Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-03-28 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-906215)
Quatre injections dans le péritoine, une injection dans la veine rétro-orbitale, une injection directement dans le foie, cinq anesthésies gazeuses suivies de séances d’imagerie et deux anesthésies générales profondes: 2 138 souris génétiquement immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l’issue pour le prélèvement de leurs organes lymphoïdes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris reçoivent des cellules souches ou des progéniteurs sanguins humains, corrigés ou non, pour vérifier que ces cellules se développent dans un organisme vivant. Le porteur indique que cette étape est exigée par l’Agence nationale de sécurité du médicament avant toute demande d’essai clinique chez l’être humain. L’effectif de 2 138 animaux n’est adossé à aucun calcul de puissance statistique, il a été dimensionné « en fonction de notre expérience du modèle » et de la variabilité observée lors de projets antérieurs.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le but de ce projet est de tester in vivo dans un modèle murin l’innocuité et l’efficacité de nouveaux protocoles thérapeutiques pour des déficits immunitaires sévères. Ces déficits sont des pathologies très graves qui touchent les cellules sanguines et immunitaires, indispensables à la lutte contre les agents infectieux. Ils sont dûs, soit à une mutation dans un gène indispensable au développement ou à la fonction des cellules sanguines, soit à des traitements contre le cancer du sang, dans le cas de leucémie par exemple. Pour toutes ces pathologies, la greffe de moelle osseuse provenant d’un donneur sain est une option thérapeutique largement utilisée, mais la survie après greffe est très hétérogène et peut être inférieure à 30%. De nouvelles approches thérapeutiques doivent donc être absolument développées pour augmenter la survie de patients greffés. Notre objectif est d’explorer l’efficacité de trois nouveaux traitements de thérapie cellulaire (injection de progéniteurs des cellules sanguines), et de thérapie génique (injection de progéniteurs des cellules sanguines ou cellules souches, génétiquement modifiés). L’efficacité de ces approches innovantes doit absolument être validée dans un modèle animal car cette étape est exigée par l’Agence Nationale de la Santé et du Médicament avant tout essai clinique chez l’homme. Il existe un modèle de souris génétiquement modifiée pour être atteinte de déficience immunitaire et qui peut recevoir des cellules sanguines humaines pour qu’elles se développent sans effet délétère. Selon l’âge des souris receveuses, les cellules humaines seront injectées en intraveineuse ou en intrahépatique et la reconstitution immunitaire sera suivie par des prélèvements d’organes lymphoïdes après la mise à mort.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les résultats de ce projet permettront de valider et de justifier la mise en place de nouvelles thérapies dans le cas de déficits immunitaires sévères. Plus spécifiquement, les différentes études sur les progéniteurs de cellules sanguines nous permettront de choisir le protocole de production le plus optimisé pour leur capacité à se développer dans le corps. Par ailleurs, les protocoles impliquant la modification génétique des progéniteurs ou cellules souches visent à évaluer l’efficacité de telles stratégies de remplacement de gènes défectueux et notamment en vérifiant la bonne évolution des cellules génétiquement corrigées chez la souris, et ce durant leur développement. A terme, l’ensemble de ce projet permettra la mise au point jusqu’au stade clinique de protocoles thérapeutiques personnalisés avec une survie améliorée pour tous les patients atteints de déficits immunitaires.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux subiront selon leur utilisation, soit 1 ou 2 : Injection intrapéritonéale (4X), 10s par intervention. Injection intraveineuse rétro-orbitale (1X), 30s par intervention. Anesthésie générale profonde (2X), 2min par intervention. Injection intrapéritonéale (1X), 10s par intervention. Injection intrahépatique (1X), 10s par intervention. Anesthésie gazeuse (5X), 10min à 30min. Imagerie optique (5X), 10min à 30min par intervention. Anesthésie générale profonde (1X), 2min par intervention.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les altérations génétiques des animaux provoquent une immunodéficience sévère qui les rend vulnérables aux infections microbiennes. A la dose utilisée, l’agent de conditionnement n’induit pas d’effet indésirable majeur mais une douleur transitoire durant les heures post-injectio. L’anesthésie légère gazeuse ou profonde générale par injection de produits anesthésiants peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux. Les cellules souches et progéniteurs lymphoïdes ne provoquent pas d’effets indésirables et sont très bien tolérés chez les animaux. Les injections intrapéritonéales et intraveineuses par voie caudale provoquent une douleur localisée légère. Les injections intraveineuses par voie rétro-orbitaire provoquent une douleur localisée légère et un stress transitoire.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort à la fin de cette procédure car nous avons besoin de prélever leurs organes afin de réaliser plusieurs analyses moléculaires et biochimiques.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La mise en place d’essais précliniques sur modèles animaux, quand ceux-ci existent, est exigée par l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament dans tout dossier préalable à la demande d’un essai clinique chez l’homme. Il est à noter que seuls les protocoles mis au point et validés sur les cellules seront testés chez l’animal. Notre protocole de production de progéniteurs de cellules sanguines est déjà une méthode de remplacement partiel, puisque nous partons de cellules souches pour produire et expandre des cellules qui normalement se différencient en plusieurs mois dans la moelle osseuse. Nous utilisons un système de culture cellulaire, en évitant la maturation des cellules humaines chez la souris sur plusieurs stades. De même, la modification génétique des cellules sera faite dans la culture puis validée (efficacité de l’incorporation du gène sain, expression protéique du gène sain…) avant l’injection chez les animaux. En outre, la capacité des progéniteurs ou cellules souches, corrigées ou non, à se développer correctement, notamment en certains sous-type de cellules sanguines, sera également évaluée dans une culture cellulaire grâce à des tests déjà validés dans la littérature. Ils serviront à statuer sur la fonctionnalité potentielle des cellules avant leur injection chez les souris. Les expériences chez l’animal interviendront au terme d’un long développement et d’une caractérisation des produits cellulaires qui seront utilisés afin de ne traiter les animaux qu’avec les cellules dont les résultats sur les cellules seront suffisamment satisfaisants pour poursuivre chez l’animal. Ces expérimentations s’inscrivent dans le cadre d’une validation de la capacité de ces cellules, dans un organisme complet, à se développer. En effet, les expériences sur les cellules ne permettent pas d’évaluer la biodisponibilité, la capacité à migrer et la persistance de nos cellules therapeutique.
2. Réduction
Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé en fonction de notre expérience du modèle en question, en prenant en compte la variabilité observée lors de précédents projets du laboratoire. De par la faible taille de nos groupes, nous nous attendons à ne pas pouvoir valider une distribution gaussienne de nos données et donc à privilégier des tests non paramétriques. Cependant, nous raisonnerons de manière méthodique en testant la possibilité d’une répartition en loi normale de nos jeux de données. Un premier test sera utilisé pour évaluer la répartition gaussienne de chaque groupe, suivi d’un test pour comparer les variances. Pour la comparaison entre deux groupes, si les données suivent une distribution gaussienne, nous aurons recours aux tests paramétriques. En cas de répartition non gaussienne, un test non paramétrique sera utilisé. Pour les comparaisons entre plus de 2 groupes, nous utiliserons soit un test d’analyse de la variance pour les données normales avec comparaisons multiples ou son équivalent non paramétrique en cas de répartition non gaussienne. Par ailleurs, afin de réduire au maximum la production de notre élevage de souris immunodéficientes, nous aurons recours à la synchronisation des trios en amont de chaque expérience de manière à utiliser au maximum les animaux de chaque portée.
3. Raffinement
Les animaux immunodéficients seront hébergés au sein d’un établissement dont le statut sanitaire apporte un niveau de stérilité permettant d’éviter toute souffrance dues à leur phénotype immunodéficient. Les souris seront hébergées à raison de 5 par cage sur portoir ventilé avec un accès à la nourriture et à la boisson à leur volonté, la nourriture et l’eau sont stériles. Chaque cage bénéficie d’un enrichissement matérialisé par un tunnels de polycarbonate rouge translucide (pour les activités journalières) destiné à diminuer le stress et stimuler leur activité, des carrés de cellulose afin de favoriser la nidification et un bâtonnet en bois pour répondre aux besoins naturels des rongeurs. Des gels riches en nutriments pourront être ajoutés dans la cage si le besoin s’en fait sentir (animal chétif ou faible). La souffrance des animaux sera surveillée régulièrement et la décision de leur mise à mort encadrée par une grille de score définissant des points limites spécifiques. Une surveillance quotidienne sera réalisée par le personnel compétent de l’animalerie ainsi qu’une surveillance hebdomadaire par les responsables du projet. Chaque procédure invasive sera précédée d’une anesthésie générale profonde accompagnée d’une analgésie. Lors des anesthésies gazeuses, les animaux seront placés sur un plateau thermostaté permettant de maintenir leur température corporelle. La mise à mort de l’animal sera faite sous anesthésie générale afin de réduire leur stress.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris immunodéficiente que nous avons choisie constitue le modèle de référence pour tester l’efficacité de nouvelles approches de thérapie cellulaire et génique des déficits immunitaires. En effet, ces souris immunodéficientes sont capables de soutenir le développement des différentes cellules sanguines humaines à partir de cellules souches. Nous utiliserons soit des souris femelles ou mâles de 4 à 8 semaines soit des souris nouveau-nés (moins de 4 jours). Les souris de 4 à 8 semaines supportent bien le traitement permettant de les “vider” de leur globules blanc les 2 jours précédant la greffe. Ce traitement à la dose choisie est sans toxicité majeure et permet d’une part de mimer la situation clinique de greffe, et d’autre part de « vider » la moelle des animaux afin de faire de la place pour les cellules humaines et faciliter leur différenciation dans toutes les lignées sanguines. La prise de greffe des cellules humaines est bonne chez les animaux âgés de 4 à 8 semaines. Les souris nouveau-nées (