Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 08/12/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-928176)
133 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dont 28 mis à mort sans réveil comme donneurs de cellules et 105 opérés du crâne sous anesthésie en souffrance modérée. Un défaut osseux est créé chirurgicalement dans la calotte crânienne puis comblé par un biomatériau, les rats étant hébergés deux à huit semaines avant mise à mort pour analyser la régénération osseuse. Le porteur décrit une douleur post-opératoire prise en charge par analgésie et des points limites déclenchant l’euthanasie. Il affirme que ces études de reconstruction osseuse « ne peuvent être menées que sur des animaux ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif de cette étude est de tester l’hypothèse selon laquelle le traitement, pré-implantation, de cellules souches autologues avec une molécule nommée l’alpha-tocophérol (AT) peut améliorer leur participation au phénomène de réparation osseuse. Cette hypothèse est établie sur la base des résultats montrant que l’AT favorise la formation de cellules productrices de tissu osseux à partir de cellules souches mésenchymateuses. Ces effets sont obtenus sans effet toxique de l’AT.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les précédentes expériences effectuées in vitro suggèrent que les CStroM traitées avec l’AT pourraient avoir une meilleure capacité de régénération osseuse se traduisant par une résolution des défauts plus rapide et de meilleure qualité. Dans ce cas, nous allons tester, sur un modèle animal, la preuve de principe d’une procédure thérapeutique (accélération de la régénération osseuse) innovante. La mise au point d’un essai préclinique sur grand animal est la perspective directe de ces expériences, utilisant les réactifs et consommables de grade clinique, compatibles avec une procédure ex vivo de médicament de thérapie innovante (MTI). Dans la même perspective, nous préparerons ces cellules pour le développement d’un MTI et d’un essai clinique de grade 1/2 en médecine humaine. De même, ces résultats peuvent orienter la recherche sur l’effet de l’AT ex vivo sur les cellules souches isolées à partir d’autres tissus, ce qui pourrait, à son tour, ouvrir des perspectives vers le développement d’autres MTI.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux (rats) prévus pour ce projet seront soumis à une seule procédure chirurgicale (procédure 1, durée environ 30 minutes, 105 rats), à l’exception des rats donneurs de cellules qui seront euthanasiés pour obtenir des cellules souches mésenchymateuses (28 rats).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Durant ce projet, uniquement une douleur post chirurgie est attendue pour les animaux. Comme indiqué dans la suite du formulaire, l’estimation de la souffrance sera réalisée dans les 5 premiers jours par l’expérimentateur et/ou par le personnel de l’animalerie. Cette estimation sera ensuite réalisée quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Les animaux seront surveillés concernant leurs activités et leurs comportements [voir annexe 2 et 3]. Les critères utilisés seront ceux de Lloyd.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux (105 rats) ayant subi l’unique procédure 1 seront hébergés entre 2 et 8 semaines puis sacrifiés pour prélever les implants et réaliser les différentes analyses ayant pour but de quantifier la régénération osseuse induites par les matériaux implantés.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le processus de développement et de validation des biomatériaux utilisés pour la reconstruction osseuse nécessite des études précliniques qui ne peuvent être menées que sur des animaux et, dans le cas de ce projet, sur des rongeurs. Les études faisabilité, de fonctionnalité et de régénération osseuse chez l’animal sont indispensables pour le développement des biomatériaux. Ces tests menés chez le rongeur sont une étape nécessaire pour permetre la suite de notre projet dirigé vers la clinique. Le principe général est de créer chirurgicalement un défaut osseux dans la calvaria puis de mettre en place un biomatériau de comblement permettant de stimuler la reconstruction osseuse. Les procédures d’évaluation comprennent un suivi clinique (inflammation, douleur), ainsi qu’un suivi histologique et radiologique par microscanner, après euthanasie des animaux.
2. Réduction
Afin d’utiliser le moins d’animaux possibles mais également afin d’avoir un nombre suffisant d’échantillons à la fin de l’étude, tout en prenant en compte le risque de perte d’animaux, une approche statistique nous a permis d’établir que notre projet comprendra des groupes de 5 rats pour l’expérience préliminaire puis de 8 rats pour chaque condition dans les expériences suivantes. Pour l’analyse statistique, nous comparerons les résultats obtenus avec les différents échantillons.
3. Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe et dans des cages avec de l’enrichissement adapté afin de leur offrir un cadre d’hébergement optimal: litière en copeaux de peupliers et des jouets. Après la chirurgie, chaque animal se réveillera dans une cage séparée pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Après le réveil complet, l’animal reviendra dans sa cage d’origine. L’anesthésie des animaux sera réalisée au masque (anesthésie gazeuse) par de l’isoflurane (4,5% pour l’induction, puis 2.5% pour le maintien). L’analgésie sera réalisée en pré oépratoire par une par une injection sous-cutanée d’un anesthésique local (lidocaïne) et par une injection sous-cutanée de buprénorphine, 30 minutes avant l’intervention, ainsi qu’une injection en post-opératoire. L’estimation de la souffrance animale sera constamment mesurée: 1/ Tout au long de l’intervention chirurgicale, les signes avant-coureurs du réveil seront surveillés et, si un de ces signes apparait, une augmentation temporaire du taux d’isoflurane à 4,5% sera réalisée. Si les signes persistent, l’animal, qui sera toujours sous anesthésie sera euthanasié par dislocation cervicale. 2/ L’estimation de la souffrance sera mesurée dans les 5 premiers jours post chirurgie concernant leurs activités et comportements. Les critères utilisés seront ceux de Lloyd et al. : le score limite est de 14 et au-delà, l’animal sera euthanasié. Toute souffrance plus modérée sera traitée par l’administration quotidienne, par voie intra-péritonéale, de buprénorphine pendant 3 jours. La persistance de douleurs entraînera l’euthanasie de l’animal. Les critères suivants seront prépondérants dans la détermination du point limite : apparence de l’animal, prise d’eau et de nourriture, signes cliniques (rythme cardiaque et respiratoire), comportement naturel et provoqué. En cas de blessures corporelles suite à un combat, l’animal sera isolé et soigné avant de retourner dans sa cage pour être surveillé en continu. En cas de problème de cicatrisation des plaies, les soins nécessaires seront effectués. Selon la gravité, la plaie sera ré-ouverte pour enlever pus ou hématomes, et un traitement antibiotique. Les animaux ayant atteint les points limites seront euthanasiés.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le défaut de calvaria chez le rongeur est un modèle largement utilisé dans notre recherche, validé dans la littérature. C’est un modèle de choix pour étudier l’influence des cellules et biomatériaux sur la régénération osseuse. Pour ce projet, nous devons nous placer dans des conditions expérimentales in vivo qui miment l’allogreffe. Nous travaillerons ainsi avec une souche allogénique de rats couramment utilisé pour ce type d’expérimentation : des rats Sprague Dawley. Nous utiliserons un modèle de rat plutôt qu’un modèle plus petit (comme la souris) car ce modèle est mieux adapté aux types de matériaux (nature et taille) et car nous avons déjà une bonne expertise de la culture des CStroM de rats qui rend ce projet réalisable sans mise au point.. Les animaux seront commandés et hébergés environ 2 semaines avant l’intervention pour permettre leur acclimatation. Nous utiliserons des animaux adultes (10 à 12 semaines pour les rats). Cela permettra d’éviter que la croissance osseuse des animaux vienne interférer avec les processus de régénération.