Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 17/12/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-979153)
Injectées d’une toxine bactérienne dans l’abdomen, prélevées de 20 microlitres de sang à la queue sous anesthésie gazeuse, 144 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le dernier jour, sous anesthésie profonde, la peau du crâne est ouverte pour observer la moelle osseuse au microscope à travers l’os, pendant trois heures. Le porteur anticipe pour cette étape un risque d’hypothermie, un dessèchement des yeux et une douleur liée à la durée de l’anesthésie, et attribue aux cycles répétés d’anesthésie et de réveil une nuisance modérée. Toutes les souris sont tuées par prélèvement de 800 microlitres de sang à l’aorte abdominale ou à la suite de la chirurgie crânienne, gestes qu’il qualifie de terminaux.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les plaquettes sanguines, qui jouent un rôle vital dans l’arrêt des saignements, sont produites dans la moelle osseuse à partir des mégacaryocytes, des cellules remarquables par leurs grandes tailles et leur noyau polyploÏde. Les processus de différenciation et de maturation vers la lignée mégacaryocytaire (mégacaryopoïèse) s’effectuent sous l’influence du microenvironnement médullaire, incluant notamment des macrophages qui ont pour rôle principal la phagocytose. Des observations récentes au laboratoire mettent en évidence l’existence, dans la moelle osseuse, des nombreuses interactions entre les mégacaryocytes et les macrophages et leur implication dans la mégacaryopoïèse et la production éventuelle de plaquettes. Les macrophages jouent un rôle essentiel dans l’initiation, le maintien et la résolution de l’inflammation. De plus, on sait que les conditions de stress telles que l’inflammation ont un impact significatif sur le phénotype et la fonction des macrophages. Ainsi, il sera intéressant d’étudier l’impact de l’inflammation sur l’interaction entre les macrophages et les mégacaryocytes dans le microenvironnement de la moelle osseuse avec un accent particulier sur son influence sur la mégacaryopoïèse et la production de plaquettes.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les retombées de ce projet sont cognitives et cliniques. Sur le plan fondamental, il vise à comprendre l’impact de l’inflammation sur la mégacaryopoïèse et à la production de plaquettes sanguines. Sur le plan clinique, une meilleure compréhension du rôle des macrophages dans la maturation des mégacaryocytes et la formation des plaquettes notamment dans les maladies inflammatoires permettra de mieux comprendre la régulation du nombre de plaquettes produites par des mégacaryocytes dans les conditions pathologiques, et à plus long terme, de contribuer à faire avancer les traitements adaptés chez les patients avec l’inflammation systémique et risque de thrombose. Les données recueillies concernant l’effet induit par l’infection permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués à la fois dans le développement des maladies parodontales et leur implication dans la perturbation de l’homéostasie de la moelle osseuse et sur la mégacaryopoïèse et à la production de plaquettes sanguines ainsi que des pathologies associées par exemple thrombose afin de pouvoir, par la suite développer de nouvelles thérapeutiques. La mise en évidence de nouveaux mécanismes, notamment l’identification de nouveaux récepteurs et/ou molécules, permettra de mieux comprendre les interactions entre les maladies parodontales et les maladies générales, ces bactéries ayant été retrouvées, à distance au niveau d’organes tels que le foie, le cœur et les vaisseaux, et la moelle notamment. Les mécanismes impliqués semblent mettre en jeu une activation exacerbée, locale et à distance, de la réponse immune innée induisant une sécrétion amplifiée de médiateurs de l’inflammation aboutissant à la destruction tissulaire. L’amélioration des connaissances mécanistiques et moléculaires permettra à terme d’améliorer les stratégies de prise en charge des patients atteints de comorbidités et de développer de nouvelles approches pharmacologiques spécifiques.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les injections en IP se font en une fois et les prélèvements 20µL de sang à la queue se font sous anesthésie courte à l’isoflurane 2% de 10 minutes en début et en fin d’expérience. La dissection du crâne et l’immobilisation de l’animal sous le microscope se fait le dernier jour de l’expérience, sous anesthésie profonde. Injection en ip pour l’anesthésie profonde en 1x. Injection sc de l’analgésique : 1x Anesthésie gazeuse au masque 2% 10 minutes pour les étapes de prélèvements à la queue et 0.5% 3h pour l’observation au travers du crâne le dernier jour. Chirurgie crâniale : sous anesthésie profonde en ip pour 30 minutes. Le prélèvement de sang de 800µl à l’aorte abdominale sous anesthésie profonde est terminal. Tous les animaux seront mis à mort en fin d’expérimentation.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les injections et prélèvements de sang (seulement une fois) présentent un risque léger de douleurs à la queue et de saignements légers : nuisances légère. Les protocoles liés au LPS (toxine bactérienne) ont déjà bien été établis au laboratoire et les souris ne présentent pas de signes manifestes de gêne, de détresse ou de perte de poids : nuisance légère. En raison de la répétition des cycles d’anesthésie gazeuse et de réveil, nous anticipons un stress supplémentaire des animaux : nuisance modérée. En ce qui concerne les expériences par microscopie au travers du crâne de l’animal anesthésié, nous anticipons un risque d’hypothermie, un dessèchement oculaire et un risque de douleur liée à la durée de l’anesthésie de longue durée : nuisance modérée.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation puisque les expériences auquelles ils sont soumis sont terminales que ce soit par prélèvement à l’aorte abdominale ou suite à une chirurgie craniale.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Cette approche in vivo permettra de confirmer les résultats obtenus par l’approche in vitro ayant permis de mettre en évidence des preuves de concept et l’identification de nouveaux mécanismes moléculaires associant bactériémie et l’inflammation systémique car il n’est pas possible de reproduire de manière fidèle la complexité des interactions tissulaires et cellulaires de la moelle osseuse in vitro. Un modèle expérimental d’injection intra-péritonéale permettra de mimer la situation clinique observée à savoir la bactériémie associée avec l’inflammation systémique. Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique in vivo dans sa totalité, à l’état homéostatique, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. Nous avons par ailleurs remarqué que la morphologie des mégacaryocytes et la production des cytokines, diffèrent fortement dans des mégacaryocytes en culture par rapport à ceux observés in vivo.
2. Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit par l’emploi de méthodes statistiques adaptées. Les mécanismes seront dans un premier temps évalués in vitro dans des cultures cellulaires pour déterminer les cibles d’intérêt physiopathologiques et thérapeutiques. A la fin des expériences les animaux seront euthanasiés et les moelles osseuses récupérées, fixées et stockées pour des observations ultrastructurales ultérieures, limitant ainsi le nombre de souris. Le nombre de souris déterminé permettra d’obtenir des résultats statistiques solides. Enfin, le maximum de prélèvements seront réalisés sur une même souris (sang, fémurs, tibia).
3. Raffinement
Le raffinement se fera par une prise en compte du bien-être animal (enrichissement du milieu comprenant la mise à disposition de languettes de papier et d’un large tube en carton. Ce tube est utilisé comme refuge ou bien déchiqueté par les rongeurs comme substrat permettant, en complément des languettes de papier et de la litière, la composition d’un nid et soins quotidiens aux animaux) et par l’établissement de points limites permettant de limiter la douleur et la souffrance de l’animal. Les expériences seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux procédures expérimentales. Les moyens de raffinement des expérimentations sont les suivants : – Pendant l’hébergement, les animaux sont élevés en groupe dans un environnement calme et non stressant et privilégié avec un minimum de manipulation. Le milieu est enrichi avec de la frisure de papier, des carrés de cellulose et des bâtonnets de coton afin de permettre aux souris de confectionner leur nid et structurer leur environnement. Des croquettes sont déposées sur le fond de la cage pour favoriser le comportement de fouissage. – Les expériences intravitales et les prélèvements à l’aorte ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées. Lors de la chirurgie pour les expériences intra vitales sous anesthésie une analgésie par injection sous cutanée de buprénorphine et de lidocaïne est apportée.- Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie gazeuse, nous appliquerons un tampon hémostatique pour arrêter le saignement avant de replacer l’animal dans sa cage. A la fin de l’expérimentation, les animaux sont sacrifiés avant leur réveil. Une fiche de suivi avec les points limites définis sera mise en place afin de pouvoir contrôler l’état des animaux tout au long du protocole expérimental. Quand un score de 4 est observé, la souris est mise à mort par inhalation progressive de CO2. Quand un score de 2 est observé, une attention particulière est apportée à l’animal et une décision est prise : augmentation de l’enrichissement, soins, euthanasie. Concrètement, lors de la surveillance quotidienne des animaux, nous observerons attentivement l’aspect des souris pour s’assurer de l’absence de signes extérieurs d’infection tels que des lésions cutanées ou des écoulements nasaux ou oculaires. Une attention particulière sera apportée au niveau des sites d’injection des substances pour s’assurer qu’il n’y a pas d’infections.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir de leur précurseurs MKs. La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptés à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Le prélèvement à l’aorte se fera sur des souris adultes sans distinction entre 8 et 35 semaines, il est connu que la moelle des souris plus agées change et présente plus de cellules graisseuses de type adypocyte interférent dans nos études. Par contre l’approche d’imagerie intravitale requière des animaux à un stade de développement jeune (de 4 à 8 semaines) car ils ont l’os du crâne suffisamment fin pour laisser passer la lumière.