Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 17/10/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-982849)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le méningocoque est une bactérie pathogène de l’homme responsable de septicémies (infections généralisées) et de méningites (infections du système nerveux). Ces infections graves sont souvent associées à des séquelles importantes, et restent parfois mortelles (10-20% des cas) malgré les traitements disponibles. Le pouvoir pathogène du méningocoque réside dans sa capacité à « coloniser » les vaisseaux sanguins humains. Après 24 à 48 heures, ce processus aboutit à la destruction du vaisseau colonisé. Nous cherchons à étudier la colonisation vasculaire, étape cruciale lors de ces infections. Nous nous intéressons notamment à deux phénomènes : aux gènes bactériens nécessaires à la colonisation vasculaire ainsi qu’à l’environnement rencontré par la bactérie lors de la colonisation. 2 objectifs imbriqués sont attendus pour ce projet : 1) L’identification des gènes importants pour la colonisation vasculaire à des temps d’infection court et long 2) La validation de ces gènes L’identification des gènes importants pour la colonisation passe par la réalisation d’une analyse des 1600 gènes non essentiels de la bacétrie après passage dans notre modèle animal. La validation des gènes importants sera réalisée via des expériences de compétition individuelle entre la souche d’intérêt et deux souches de contrôle dans notre modèle animal. Nous espérons qu’une meilleure compréhension des mécanismes d’infection permettra l’amélioration des traitements disponibles.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Notre modèle murin humanisé par xénogreffe de peau humaine est à ce jour le seul et unique modèle murin permettant de reproduire chez la souris les grandes caractéristiques des infections invasives à méningocoque observées chez l’homme, à savoir la fixation et la multiplication des bactéries sur la paroi des vaisseaux sanguins, entrainant le déclenchement d’une septicémie. A court et moyen terme, ce projet nous permettra : • D’étudier les déterminants bactériens impliqués dans la mise en place du phénomène de colonisation vasculaire • De mieux caractériser l’environnement dans lequel la bactérie évolue lors de l’infection A long terme nous espérons que ce projet permettra l’amélioration des traitements des infections invasives à méningocoques chez l’homme en permettant une prise en charge précoce plus efficace.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Tous les animaux utilisés dans cette étude sont greffés avec de la peau humaine. Le greffon est implanté sur le dos de l’animal au cours d’une procédure chirurgicale d’une durée d’environ 30min réalisée sur des animaux anesthésiés. Les animaux portent un bandage pour protéger le greffon pendant 7 jours. Une fois les bandages enlevés et au minimum 4 semaines après l’implantation du greffon, les animaux seront utilisés dans 1 type d’expériences : des expériences où les animaux sont infectés par l’injection de bactéries. Les injections se feront sur des animaux vigiles placé dans un tube de contention pendant 2min. Les animaux sont infectés pendant 6 ou 16 heures puis une ponction de sang. La souris est immobilisée pendant 2 minutes.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Plusieurs effets indésirables sont attendus lors des différentes procédures expérimentales présentes dans ce projet : • du fait de leur degré d’immunodéficience sévère, ces animaux sont très sensibles aux infections • le retrait d’une petite partie de la peau du dos pour la remplacer par de la peau humaine est une chirurgie qui entrainera une douleur modérée pendant quelques jours. • La présence de bandages maintenus pendant 7 jours pour protéger le greffon et favoriser sa prise entraineront une gêne et une mobilité réduite. • Lors des expériences d’infection par le méningocoque, les animaux infectés par l’injection de bactéries développent une septicémie entrainant progressivement une baisse de leur activité (0-6h post-infection) allant jusqu’à leur prostration (6h-16h post-infection) et la survenue du décès de l’animal (plus de 24h post-infection). L’introduction de l’aiguille lors de l’injection entraine une douleur légère de courte durée. Nos procédures ne dépasseront pas 16h post-infection.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils sont greffés avec de la peau humaine et infectés par le méningocoque.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Du fait de la spécificité du méningocoque pour les cellules humaines, la majorité des études portant sur cette bactérie utilise des cultures in vitro de cellules humaines infectées, sur lesquelles la bactérie peut se fixer. Il est cependant encore impossible de reproduire in vitro la complexité et dynamique du système vasculaire et son interaction avec le système immunitaire. Notre modèle murin humanisé par xénogreffe de peau humaine est le seul à ce jour à fournir ce niveau de complexité et représente donc un modèle de choix pour l’étude des infections invasives à méningocoque.
2. Réduction
Le calcul des effectifs des groupes d’animaux de cette étude s’est fait sur la base du retour d’expérience d’une précédente étude où nous avons pu identifier plusieurs causes potentielles de perte d’animaux lors de nos expériences, ainsi qu’avec l’expertise de biostatisticiens : 1. Une mort prématurée lors de la chirurgie de greffe de peau : hémorragie, non réveil de l’animal 2. Une mauvaise évolution du greffon au cours du temps conduisant à l’exclusion de l’animal : lésions de grattage, diminution importante de la taille 3. Une mauvaise qualité du greffon : présence de peu de vaisseaux humains 4. Une mort prématurée de l’animal lors des infections Une étude pilote sera réalisée sur 5 animaux, pour optimiser la technique de séquençage. Une étude pilote sera également mise en place pour confirmer la taille du goulot d’étranglement, afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour le projet. Cette étude repose sur 10 souris utilisées dans une procédure sévère d’infection du modèle murin. Les 1600 gènes non essentiels sont testés pour le criblage par groupes de 400 souches bactériennes, en raison des limitations de notre modèle animal. La variabilité technique conduit à ce qu’une souche bactérienne se retrouve dans le sang dans 80% des cas. Nous pouvons estimer que le nombre nécessaire d’animaux est de 80 par groupe. La procédure nécessite donc un effectif total de 160 animaux, afin de mesurer des effets de taille forts à très forts. Concernant la validation individuelle des gènes candidats établis précédemment, nous supposons ici que les effets à chercher sont forts. Pour un gène candidat, 5 souris seront suffisantes. Nous estimons que 10 gènes bactériens apparaitront comme nécessaires à la colonisation bactérienne, après le criblage haut débit. Cela nous conduit donc à estimer pour cette procédure un effectif total de 50 animaux. Toutes les procédures conduisant à la mise à mort des animaux, aucune des procédures ne permet la réutilisation d’animaux.
3. Raffinement
Souris immunodéficientes Les animaux immunodéficients étant considérés comme ayant un « phénotype dommageable », ceux-ci seront hébergés dans une animalerie au statut sanitaire adapté. Xénogreffe de peau humaine : Utilisation d’antalgique avant la chirurgie. La chirurgie (~30 min) est réalisée sur des animaux anesthésiés, et les animaux placés sur un tapis chauffant (37°C) pour éviter la baisse de leur température corporelle. Avant de placer les animaux greffés dans leur cage de réveil, ceux-ci sont réhydratés par une injection de sérum physiologique. Les animaux sont ensuite placés dans une cage de réveil, propre et placée sous une lampe chauffante. Un gel de réhydratation enrichi en sucres est placé dans la cage pour favoriser leur récupération. Un traitement antalgique est fourni aux animaux pendant 5 jours après la chirurgie. Si des signes de souffrance persistent 2 jours après la chirurgie malgré le traitement (poils hérissés, changements d’expressions faciales, abattement, perte d’activité …), les animaux sont mis à mort. Les animaux sont évalués quotidiennement les 5 premiers jours suivant la chirurgie pendant le port de leur bandage afin de détecter des signes éventuels de souffrance et vérifier l’intégrité des bandages protégeant le greffon. Si l’animal a détérioré son bandage sans léser le greffon, le bandage est refait sous anesthésie. Si l’animal a détérioré son bandage et lésé le greffon de peau humaine, l’animal est mis à mort. Une fois le bandage enlevé, l’évolution des greffons est suivie hebdomadairement pendant 4 semaines. Infection par le méningocoque : Les animaux infectés ont ensuite placés dans des cages contenant des gels de réhydratation enrichi en sucres et dont la moitié du sol de la cage est chauffé à l’aide de chaufferettes pour aider au maintien de la température corporelle des animaux infectés. Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérience. Hébergement : Les animaux ayant subi une xénogreffe de peau humaine sont hébergés au nombre de 4 maximum par cage dans des cages contenant du coton et un igloo.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Cette étude utilise des souris car le système vasculaire de la souris est proche du système vasculaire humain. De plus les modèles immunodéficients disponibles chez cette espèce en font le modèle le choix pour la xénogreffe de peau humaine. Les greffes de peau humaine sont réalisées chez des souris adultes immunodéficientes âgées de 6 à 12 semaines, période pendant laquelle la prise du greffon est maximisée selon nos observations. Les expérimentations sont ensuite réalisées 4 semaines minimum après la chirurgie, période nécessaire à une bonne prise du greffon.