Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 30/09/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-983556)
Toutes tuées pour que leurs embryons soient prélevés, 1 747 souris femelles vont être utilisées dans une procédure déclarée d’un niveau de souffrance léger. La superovulation leur est provoquée par deux injections intrapéritonéales d’hormones à quarante-huit heures d’intervalle, de façon à porter à vingt ou trente le nombre d’embryons prélevés sur chaque femelle. Le porteur écrit que ces injections sont « dénuées de tout effet nocif » tout en reconnaissant une douleur, un inconfort et un stress de courte durée. Il indique que ses travaux antérieurs sur cellules souches embryonnaires ne récapitulent pas la ségrégation des lignages dans l’embryon et qu’il doit désormais tester ses conclusions directement sur des animaux.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif de ce projet est de clarifier les rôles joués par une classe de facteurs capables de contrôler l’expression de gènes, dans le développement de l’embryon de souris. Après la fécondation, les embryons de mammifères doivent générer rapidement tous les types de cellules nécessaires pour s’implanter dans l’utérus et se développer. Ce processus dépend de la mise en route de l’expression de gènes (en anglais: zygotic genome activation, abrévié ZGA), et sur la réinitialisation de l’état de l’ADN hérité des parents. Cette opération est nécessaire pour effacer l’origine parentale de l’ADN au début de la vie et comprend la nécessité de réparer et d’étendre les extrémités des molécules d’ADN, dans des régions connues sous le nom de télomères. Les récepteurs nucléaires ont été impliqués dans ce processus, mais il reste à prouver qu’ils ont un rôle essentiel. Une fois la ZGA achevée et après les deux premières divisions cellulaires, des cellules différenciées émergent et vont donner naissance au trophectoderme, qui formera une partie du placenta, l’endoderme primitif, qui contribue au sac vitellin, et l’épiblaste, qui génère tous les tissus constituant le corps adulte. Ce potentiel immense de l’épiblaste est qualifié de pluripotence. Nos travaux antérieurs in vitro sur des cellules embryonnaires souches, lignées cellulaires issues de l’embryon qui conservent le même potentiel immense de différenciation, ont montré que deux récepteurs nucléaires, sont ensemble indispensables au maintien de la pluripotence. Il est donc important de comprendre si l’acquisition de la pluripotence repose aussi dans le contexte du développement embryonnaire naturel sur l’activité de cette classe de gènes. Bien que les résultats publiés sur l’inactivation des gènes de récepteurs nucléaires ne montrent pas d’effet sur les premiers jours du développement, nous pensons que l’importance de ces gènes a été masquée par la capacité de l’embryon à compenser l’absence de l’un des gènes par un autre gène de la famille. En utilisant de souris génétiquement modifiées nous allons définir le rôle synergique de plusieurs récepteurs nucléaires dans la réinitialisation et l’activation du génome, la spécification de différents types cellulaires embryonnaires, et en particulier dans l’acquisition de la pluripotence. L’objectif principal de ce projet est donc de générer de nouvelles connaissances scientifiques.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet vise à comprendre le rôle d’une classe importante de gènes, les récepteurs nucléaires orphelins, dans la coordination des premiers jours du développement embryonnaire, qui aboutit à la formation entre autres d’une population de cellules capable de donner naissance à tous les types de cellules constituant le corps adulte. L’embryon permet d’obtenir des cellules qui peuvent être cultivées et maintenues en laboratoire in-vitro: les cellules souches embryonnaires, ou « ESCs ». Comme les cellules de l’embryon préimplantatoire, les ESCs sont aussi pluripotentes et capables de générer de nombreux types cellulaires. Cette propriété remarquable suscite beaucoup d’espoir dans le domaine médical dans le cadre de thérapies de remplacement cellulaire. Une des retombées de nos travaux sur les embryons est d’identifier les conditions permettant de dériver des modèles cellulaires de type ESCs, mais plus immatures et donc possédant des potentialités accrues de différenciation. Ainsi, en plus de générer des connaissances de base pour mieux comprendre le développement embryonnaire de la souris, mais également d’autres mammifères, nos résultats pourraient faire progresser de manière significative notre capacité à utiliser les ESCs dans la clinique.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Nous utiliserons la superovulation, une technique basée sur 2 injections consécutives d’hormones par voie intrapéritonéale, nécessitant l’immobilisation de l’animal pendant moins d’une minute, à 48 heures d’intervalle.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les nuisances pour les animaux seront dues à deux injections d’hormones dans l’abdomen. Ces injections sont dénuées de tout effet nocif dans les conditions d’utilisation prévues. Néanmoins, elles peuvent entrainer une douleur, inconfort et stress de sévérité légère de courte durée sans impact sur la santé ou le bien-être animal.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Toutes les femelles seront mis à mort pour prélever des embryons.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Nos travaux antérieurs ont largement utilisé les cellules en culture (ESCs) et ont permis d’identifier une classe de gènes, les récepteurs nucléaires orphelins, qui pourraient être impliqués dans les processus de différenciation cellulaire. Bien que l’étude in vitro des lignées de cellules pluripotentes présente un intérêt indéniable, ce modèle de différenciation ne récapitule pas complètement les mécanismes qui contrôlent la ségrégation des différents lignages embryonnaires, et les résultats obtenus en culture doivent être vérifiés et développés dans le contexte du développement naturel. C’est précisément pour ces raisons que nous devrons maintenant tester directement sur des animaux les conclusions de nos études précédentes.
2. Réduction
Notre travail est basé sur la comparaison entre des embryons témoins et des embryons porteurs de mutations dans différents gènes. Pour réduire le nombre de souris femelles utilisées, nous avons : optimisé les croisements, de sorte que chaque femelle produit à la fois les embryons témoins et des embryons porteurs des mutations étudiées, dans les proportions désirées. Nous prévoyons aussi d’utiliser la superovulation, une technique permettant d’obtenir, à partir de chaque femelle 20-30 embryons. Nous chercherons également à utiliser le moins d’embryons possible pour chacune des approches expérimentales : Nous devrons évaluer l’expression des gènes dans les embryons et la capacité de l’ADN à être lié et modifié par des facteurs régulant le développement. Pour ces techniques basées sur le séquençage ADN, les exemples existants dans la littérature font souvent état de l’utilisation de centaines d’embryons par échantillon. Nos données préliminaires suggèrent que des données informatives sont obtenus à partir d’embryons uniques, bien que le bruit de fond et les effets de lot soient dans ce cas substantiels. Des améliorations techniques ont été implémentée, pour maximiser la reproductibilité, permettant l’utilisation de seulement 5 embryons par condition, répétée en 5 expériences indépendantes. Nous devrons également visualiser par microscopie la présence et la localisation des facteurs contrôlant la spécification et la prolifération de chaque type cellulaire de l’embryon précoce, ainsi que suivre les extrémités des molécules d’ADN présentes dans chaque cellule, les télomères, et les protéines actives à ces régions. Nous utiliserons aussi la microscopie pour mesurer les niveaux d’expression génique globaux, et ceux de gènes spécifiques. Pour analyser chacun de ces facteurs/gènes par microscopie, entre 5 et 10 embryons sont nécessaires, et les analyses doivent être répétées au moins 3 fois. Néanmoins, 3 marqueurs peuvent souvent être analysés sur chaque embryon en même temps. Nous veillerons donc à coupler la détection de plusieurs marqueurs par embryon, et nous analyserons le moins de marqueurs possible, tout en obtenant des résultats informatifs. Enfin, des modèles de culture cellulaire pourront nous aider à établir des priorités ou d’éliminer certaines sections expérimentales tout au long de l’exécution du projet.
3. Raffinement
Les souris concernées par cette demande sont les femelles donneuses d’embryons, sur lesquelles deux injections intrapéritonéales seront réalisées. Bien que ces injections ne soient pas dommageables, tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute souffrance et angoisse de l’animal. Pour cela, nous veillerons à ce que les animaux n’assistent pas aux injections d’autres individus, pour ne pas provoquer de stress avant la procédure. Nous immobiliserons les animaux avec précaution, et après qu’il se soient adaptés à la manipulation par l’expérimentateur.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est un mammifère de petite taille à reproduction rapide qui partage 99% d’homologie avec le génome humain, d’où son intérêt majeur en recherche fondamentale sur le développement. En plus, des souris génétiquement modifiées existent déjà pour les gènes étudiés. Les souris femelles donneuses d’embryons sont des souris âgées de 3 à 12 semaines : la stimulation hormonale est efficace pour induire l’ovulation sur cette tranche d’âge.