Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 31/05/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-988172)
Injectées de cellules de mélanome uvéal humain dans le derme du flanc, 500 souris voient leur tumeur primaire retirée pour laisser les métastases se former, et 180 autres reçoivent ces cellules directement dans la rate au cours d’une intervention de trente minutes sous anesthésie. Elles reçoivent ensuite des molécules par voie orale ou injectée, d’une fois par semaine à deux fois par jour, subissent une imagerie sous anesthésie toutes les deux semaines puis chaque semaine, et des prélèvements sanguins au sinus rétro-orbital. 743 souris sont utilisées au total, dans des procédures toutes déclarées d’un niveau de souffrance sévère. Celles qui perdent plus de 18 % de leur poids entre deux évaluations sont tuées dans les 72 heures si leur état ne s’améliore pas, les autres à la fin de la procédure pour des analyses post-mortem.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le cancer reste parmi les premières causes de décès dans le monde. Le mélanome de l’uvée est un cancer rare de l’adulte avec une incidence de 500 à 600 nouveaux cas par an en France. Même s’il existe des traitements efficaces pour éliminer la tumeur primaire (chirurgie ou radiothérapie), aucun traitement n’existe actuellement contre la phase métastatique de la maladie. L’évaluation des nouvelles thérapies disponibles aujourd’hui nécessite le développement des modèles pertinents. Un modèle métastatique a été développé dans le laboratoire suite à l’injection de cellules tumorales humaines sur souris ce qui permet la réalisation d’études pharmacologiques dont le potentiel prédictif clinique est très élevé. Ce modèle nous a permis d’observer le développement de métastases principalement au niveau hépatique mais également au niveau péritonéal dans certains cas. Ainsi elles constituent un outil primordial pour tester l’efficacité de nouveaux médicaments ou encore de nouvelles combinaisons ou schémas d’administration de médicaments. Ces essais précliniques ont différents objectifs : déterminer le type tumoral qui présentera le plus de bénéfice au traitement, déterminer les combinaisons et les fréquences d’administration qui seront les plus efficaces mais également effectuer des études moléculaires de la tumeur qui permettront d’expliciter le mécanisme d’action des molécules testées ou encore les mécanismes de résistance de ces tumeurs par rapport à ces thérapeutiques. Ces essais précliniques sont des phases préliminaires aux phases cliniques. Ils permettent d’orienter les développements futurs des nouvelles molécules et d’optimiser des traitements qui seront ensuite utilisés chez l’homme. Les modèles murins de mélanome uvéal de notre laboratoire représentent des tumeurs générées par injection de lignées cellulaires humaines tumorales. Ces tumeurs représentent la diversité de la maladie chez l’homme et sont utilisées dans le cadre de collaboration avec des partenaires pour évaluer des nouvelles drogues. L’évaluation de l’effet de ces molécules comprend l’étude de la tolérance qui permet de déterminer la dose des molécules ou des associations de molécules sur de petits groupes d’animaux jusqu’à l’étude de l’efficacité anticancéreuse de ces mêmes molécules.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le mélanome uvéal (MU) est un cancer rare de l’adulte avec une incidence de 500 à 600 nouveaux cas par an en France. Dans la grande majorité des cas, le mélanome uvéal apparait suite à une surprolifération des mélanocytes au niveau de la choroïde, qui est une des couches de la paroi du globe oculaire. Mais il peut également survenir dans deux autres couches de l’œil, l’iris ou le corps ciliaire. Il représente 5% de tous les mélanomes et se distingue du mélanome cutané au niveau biologique et génétique. Il existe des thérapies efficaces comme la chirurgie et la radiothérapie pour éliminer la tumeur primaire. Cependant plus de 30% des patients développent des métastases principalement au niveau hépatique et péritonéal. Malheureusement il n’existe actuellement aucun traitement de référence contre la phase métastatique de la maladie. A la fin de l’expérience la tumeur primaire et les métastases seront prélevées pour étude post-mortem. Une partie sera congelée à sec pour analyse génomique et une autre sera fixée pour analyses histologiques. Le but de ces expériences in vivo est donc dans un premier temps de comprendre les mécanismes impliqués dans le développement du MU (croissance de la tumeur primaire ainsi que des métastases). Cette étude a également pour but de trouver un traitement afin de lutter contre la croissance de la tumeur au niveau de sa localisation initiale mais surtout d’évaluer l’efficacité de différentes « molécules actives » ou nouvelles cibles thérapeutiques sur le développement métastatique de la maladie. Ces avancées sont indispensables et majeures afin d’augmenter le pourcentage de survie des patients.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
>Injection intradermique sur animal vigile de cellules dans le derme de la souris au niveau du flanc droit / 1 fois en début d’expérience- 10 secondes / 500 souris >Injection intrasplénique sur animal anesthésié de cellules / 1 fois en début d’expérience / 180 souris. Durée de l’anesthésie : 30 minutes >Imagerie sur souris anesthésiées en gazeuse après injection de sonde colorimétrique en intrapéritonéal / 1 fois toutes les 2 semaines puis une fois par semaine tout au long de la procédure / 680 souris. Durée de l’anesthésie : 30 minutes maximum >Prélèvements sanguins sur animal vigile ou sous anesthésie gazeuse au niveau du sinus rétro-orbital / 1 fois en début d’expérience et 1 fois en fin d’expérience avant sacrifice / 680 souris – 20 secondes et durée avec anesthésie : 3 minutes >Injection/ingestion de molécules chimiques sur animal vigile / de 1 fois par semaine à 2 fois par jour selon le traitement tout au long de la procédure / 743 souris -10 secondes
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les nuisances attendues lors des procédures chirurgicales seront celles liées à l’incision de la peau (nuisance modérée) ou du péritoine ou bien l’exérèse de la tumeur primaire (dans le but de développer les métastases par l’animal) (durée 5 minutes pour enlèvement de la tumeur primaire et 30minutes pour injection intrasplénique et souture de la péritoine (nuisance sévère). Lors des anesthésies, une baisse de température corporelle est observée chez la souris (nuisance légère) Des prélèvements de sang seront faits en sinus retro orbital sur animal anesthésié : durée 20 secondes et durée avec anesthésie : 3 minutes (nuisance légère) Les injections de cellules en intradermique ou l’administration de molécules par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutané ou intramusculaire, ou enfin injection de la molécule pour visualiser les métastases ne provoquent pas de douleur chez les animaux au-delà de l’injection elle-même (durée10 sec maximum, nuisance légère). Par ailleurs, la croissance des tumeurs greffées au niveau des différents sites, pourraient provoquer une perte de poids ou une gêne pour se déplacer. Si une perte de poids rapide est observé (>18%) entre 2 évaluations, sans la présence de tumeur apparente, et qu’elle ne peut être récupérée par l’alimentation riche dans la cage et l’hydratation par voie sous-cutanée, cela est un signe de développement des métastases. Dans ce cas l’animal est euthanasié dans les 72h si aucune amélioration n’est observée (la perte de poids peut être considéré comme modérée et sévère si apparition de métastases). Pour visualiser les métastases on utilise l’imagerie sur souris anesthésiées en gazeuse après injection de sonde colorimétrique en IP (durée max 10 secondes) sous un volume de 100µL / 1 fois toutes les 2 semaines puis une fois par semaine tout au long de la procédure. Durée de l’anesthésie : maximum 30 minutes (la nuisance de l’imagerie est légère pour l’animal).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Dans chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’efficacité antitumorale de tous les traitements est préalablement évaluée sur des cultures cellulaires (système in vitro). Seules les molécules ayant montré une efficacité in vitro sont alors ensuite utilisées in vivo. En effet il est nécessaire de valider l’effet observé dans un système intégré et tenant compte de la complexité d’un organisme vivant avec les multiples interactions, la toxicité possible ou encore la difficulté de la molécule à atteindre sa cible. L’injection de lignées cellulaires tumorales constitue l’outil d’analyse pharmacologique des nouveaux composés le plus proche de l’utilisation clinique aujourd’hui. Pour sélectionner les meilleurs composés antitumoraux, l’évaluation préclinique est une étape importante dans le développement d’un médicament avant son utilisation clinique. Cette évaluation conduit à optimiser les modalités thérapeutiques, prédire les effets du médicament en association et identifier des marqueurs de réponse ou de résistance. Les effets des thérapies testées sur la dissémination métastatique et sur les cellules initiatrices de tumeurs sont également étudiés.
2. Réduction
En se basant sur notre expérience, pour les expériences de toxicité, l’utilisation de 3 souris/dose est le minimum suffisant pour déterminer les effets secondaires des molécules. Dans les expériences d’efficacité, le nombre de souris correspond au nombre minimal requis pour avoir une différence significative. Ce nombre tient compte du taux de prise tumorale et l’hétérogénéité des réponses des animaux.
3. Raffinement
Les injections de cellules tumorales par voie intradermique sont peu invasives, avec un suivi de croissance tumorale facile et avec peu de manipulation. Les différentes procédures seront mises en œuvre de façon à engendrer le minimum de contraintes et de douleur aux animaux : – utilisation d’anesthésiques et d’analgésiques systématique lors des chirurgies. – Réduction de l’hypothermie lors de la chirurgie : tapis ou lampe chauffante – Addition d’alimentation hydraté en post-opératoire si besoin, hydratation supplémentaire de l’animal si perte de poids ou difficulté à se déplacer après chirurgie. – Si l’animal montre des signes de douleur des antalgiques lui seront administrés. – Les animaux seront surveillés pendant 24h lors des chirurgies. Par la suite, les animaux sont surveillés minimum 1 fois par semaine par le personnel. Pour faciliter le suivi des métastases nous allons utiliser l’imagerie dans la mesure du possible. Les traitements par différentes voies sont peu invasifs et se font sur animaux vigiles ; néanmoins si des signes de douleurs apparaissent lors de l’administration d’une molécule, celle-ci sera administrée sous anesthésie générale gazeuse. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de définir les points-limite.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le choix de l’espèce a été fait pour plusieurs raisons : – La souris est un mammifère comme l’Homme et sa physiologie est proche de celle de l’Homme. – La réglementation demande à ce que tout développement de médicaments soit testé chez deux modèles animaux différents avant toute administration chez l’humain. La souris est le modèle le plus utilisé en première instance et il permet d’acquérir un grand nombre d’informations pour un investissement contrôlé. – L’existence de souches immunodéficientes chez la souris permet la greffe de cellules humaines sans risque de rejet. Cette greffe de cellules humaines est plus difficile dans d’autres espèces (le Zebrafish est moins permissif) Jeune adulte : L’injection a lieu entre 5 à 8 semaines. Les souris ont ainsi fini leur croissance mais sont suffisamment jeunes pour que la tumeur greffée puisse prendre sur les animaux car l’immunodéficience pourrait diminuer avec l’âge. De plus le temps de croissance des cellules tumorales MU est long ainsi que l’apparition des métastases. Les animaux à cet âge supportent également mieux le transport à partir de l’élevage jusqu’à l’animalerie ainsi que l’anesthésie, la chirurgie et les traitements