Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 08/02/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-539947)
820 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Le porteur décrit un modèle de dénutrition sévère chez des souris juvéniles sevrées, avec suivi de poids, prélèvements sanguins et de fèces, puis une phase d’infection par Salmonella provoquant pelage hirsute, prostration et amaigrissement. Les animaux sont euthanasiés à chaque point de la cinétique pour prélever sang, cerveau et intestin. Il affirme qu’aucun modèle in vitro ni le poisson zèbre ou la drosophile ne conviennent et présente la souris comme un « modèle incontournable » pour transposer à l’enfant dénutri.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Développer de manière durable des thérapies nutritionnelles pour contrer la dénutrition est une priorité sanitaire mondiale. Actuellement les campagnes de re-nutrition n’ont qu’un effet bénéfique transitoire sur la santé des enfants souffrant de dénutrition sévère (Severe Acute Malnutrition, SAM). La rémission nécessite la prise en compte simultanée des paramètres anthropométriques, physiologiques, immunitaires et microbiologiques. Or l’interaction entre la physiologie, le microbiote et l’immunité mucosale reste peu étudiée. En effet, déchiffrer l’interaction des principaux acteurs de l’écosystème intestinal chez les enfants SAM nécessite d’utiliser des méthodes invasives, telles que des biopsies intestinales, chez des enfants déjà affaiblis par la malnutrition. De par sa complexité, le modèle animal reste incontournable. Actuellement, un obstacle majeur qui limite l’investigation de la SAM, est l’absence d’un modèle animal approprié. Cependant, nous avons réfléchi au développement d’un modèle de souris juvénile qui présenterait de fortes similitudes physiologiques, microbiennes et immunitaires avec les enfants atteints de SAM. Grâce au modèle murin de dénutrition que nous développerons, nous déterminerons comment améliorer les interventions nutritionnelles en 1) identifiant les signatures physiologiques, microbiennes et immunologiques précoces associées à la dénutrition sévère et au régime thérapeutique proposé, et 2) en utilisant ces signatures afin de créer une combinaison de candidats associé au régime thérapeutique (nutriment et ou métabolite bactérien/bactérie bénéfique) qui simultanément améliorerait chaque paramètre. Chez les enfants, les conséquences de la SAM semblent persister au-delà de la première année après la sortie d’hôpital, et une mortalité élevée est toujours associée à de nombreuses infections et entéropathies. Une fois, le modèle de dénutrition et le régime thérapeutique amélioré, nous voudrions tester la susceptibilité des souris dénutries et ou en phase de rétablissement à développer une infection de type entéropathie avec Salmonella enterica Typhimurium.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Bénéfices à court terme: La SAM est une maladie multi-factorielle où la physiologie (reprise de poids, croissance, maturation intestinale pour une absorption des nutriments optimale), l’immunité mucosale et le microbiote intestinal jouent un rôle important dans son développement mais aussi au cours des traitements de re-nutrition avec le RUTF. Chez des enfants déjà affaiblis par la dénutrition, il n’est pas concevable de prélever des échantillons invasifs comme il serait nécessaire de la faire pour étudier la maturation intestinale ou encore le système immunitaire mucosal. Développer un modèle animal approprié est donc nécessaire afin de déchiffrer les principales caractéristiques de la SAM, et de proposer des stratégies thérapeutiques durables. L’importance de l’intégration de méthodologies multidisciplinaires comme nouvelle façon d’aborder la complexité de la physiopathologie de la SAM fait de ce projet un projet phare pour faire avancer les connaissances dans les domaines de la nutrition, l’immunité, l’infection et le microbiote intestinal. Bénéfices à long terme: Les résultats de cette étude permettront de fournir de nouvelles approches nutritionnelles qui pourraient être envisagées chez les enfants atteints de SAM. Des stratégies multifactorielles comprenant un RUTF optimisé avec des métabolites bactériens et/ou des bactéries bénéfiques devraient fournir des approches thérapeutiques durables en favorisant aussi bien la reprise de poids et la croissance, que la maturation du système immunitaire et du microbiote intestinal.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Prise de poids sur animaux vigiles, hebdomadaire. Prélèvements sur animaux vigiles: prélèvement de feces (1 fois à la fin de l’expérience), prélèvements sanguins pour glycémie (procédures 3 et 5), 1 fois à 0, 30, 60 et 90 minutes après administration de la solution de glucose, un prélèvement sanguin de l’ordre de 0,3 μl sera effectué au niveau de la queue). Prélèvements sur animaux endormis: prélèvement sanguin rétro-orbital pour le FITC dextran ( procédures 2 et 6) et 1 fois à la fin de l’expérience.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Le but de ce projet qui est de suivre l’impact d’une alimentation qui entraine une dénutrition et un régime thérapeutique pouvant contrer cette dénutrition sur la physiologie, l’immunité et le microbiote intestinal des individus, implique de facto l’utilisation d’animaux. Ce projet occasionnera des modifications physiologiques sur les animaux. Selon le régime alimentaire apporté, les animaux subiront un ralentissement de croissance ou des hausses de poids. Selon le régime alimentaire apporté, les animaux subiront un ralentissement de croissance ou des hausses de poids. Une fois, le modèle de dénutrition et le régime thérapeutique amélioré, nous voudrions tester la susceptibilité des souris dénutries et ou en phase de rétablissement à développer une infection de type entéropathie avec Salmonella enterica Typhimurium. Pour la procédure impliquant une infection par Salmonella, les symptômes de la maladie seront observés chaque jour dès le début de l’infection (signes extérieurs: pelage hirsute , yeux tirés larmoyants, miclos, posture anormale, dos rond, prostration).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux de toutes les procédures sont concernés par la mise à mort. A chaque point de cinétique déterminé, les animaux seront euthanasiés afin d’effectuer les prélèvements en vue d’analyses.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’étude de la physiologie, de l’immunité et du microbiote intestinal des individus, implique de facto l’utilisation d’animaux. Nous développerons notre modèle sur des souris mâles C57BL/6J âgées de 21 jours. L’épithélium intestinal murin est anatomiquement et physiologiquement proche de celui de l’Homme. Aucun autre organisme modèle de petite taille (danio zébré, drosophile) ne possède une telle structure aussi similaire.
2. Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, tout au long des expériences, les souris seront hébergées dans des cages appropriées à raison de 5 souris/cage maximum. Des groupes de 5 souris seront donc étudiés. Les expériences seront répétées de manières indépendantes 3 fois. Cette répartition des groupes a été choisie pour permettre une analyse statistiquement significative des résultats tout en limitant au minimum le nombre de souris. Un maximum de 820 souris seront utilisées sur 5 ans.
3. Raffinement
La nourriture et l’eau seront à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Nos visites quotidiennes ou hebdomadaires pour le suivi du poids et la consommation des régimes sera réalisés plutôt en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. La table de souffrance animale (Cf. Annexe 3) indique que lorsque le score est compris entre 0 et 4, aucune procédure spéciale n’est à appliquer considérant normal l’état de « souffrance » des animaux ; un score compris entre 5 et 12, nécessite un renforcement de notre surveillance à 2 fois par jour, et l’administration éventuelle d’un analgésique (buprénorphine voie s.c. 0.1mg/kg) ; enfin un score compris entre 13 et 30 indique une souffrance animale avérée ou sévère et entrainera l’euthanasie de l’animal considéré. Ce score final sera calculé suivant 4 points limites : l’apparence générale, la prise alimentaire et le poids corporel, la détection de signes cliniques et le comportement général. Dans chaque catégorie, un score allant de 0 (RAS) à 4 (état critique ultime) sera établi, générant un score intermédiaire qui sera modifié ou non suivant le critère suivant : si le score est égal à 3 plus d’une fois, ajouter un point. Après dénutrition ou infection, si le score de la table de souffrance animale (Cf. Annexe 3) indique un score compris entre 5 et 12, nous renforcerons notre surveillance à 2 fois par jour, et administrerons un analgésique si besoin (buprénorphine voie s.c. 0.1mg/kg) ; si le score est compris entre 13 et 30 la souffrance animale avérée ou sévère entrainera l’euthanasie de l’animal considéré.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le but de ce projet est de caractériser l’impact d’une dénutrition sévère sur la physiologie, le système immunitaire et le microbiote intestinal afin de proposer un régime thérapeutique durable aux enfants souffrant de SAM. Il est maintenant bien reconnu que le système immunitaire et le microbiote intestinal sont suffisamment proches de celui de l’Homme afin d’utiliser la souris comme modèle fiable avant qu’une transposition ne soit faite chez l’Homme. De plus, l’épithélium intestinal murin est anatomiquement et physiologiquement proche de celui de l’Homme. Aucun autre organisme modèle de petite taille (danio zébré, drosophile) ne possède une telle structure aussi similaire. Par ailleurs, le modèle murin est celui pour lequel les LysoDC ont été les mieux caractérisées. Enfin, le modèle infectieux que nous souhaitons utiliser est très bien décrit et étudié chez la souris. L’ensemble de ces critères fait de la souris l’espèce animale la plus appropriée pour effectuer notre étude. Les animaux utilisés seront des souris males âgées de 21 jours. L’épithélium intestinal des rongeurs est immature à la naissance. L’intestin grêle de la souris continue à se développer après la naissance et sa maturation est fortement associée à la période de sevrage. Le sevrage est donc une étape clef dans la structuration de l’épithélium intestinal, le développement immunitaire et la maturation du microbiote intestinal des rongeurs. C’est donc lors de cette fenêtre particulièrement sensible que se joue le développement en bonne santé de la souris mais également de l’Homme. Les souris sevrées à 21 jours seront alors utilisées afin d’être au plus proche des conditions de développement de la SAM observée chez l’Homme entre trois et 24 mois lors du sevrage. A cet âge la maturité du système immunitaire, la physiologie et la maturation du microbiote intestinal sont en cours de développement chez la souris, tout comme ça l’est chez l’enfant à bas âge.