Etude de la cinétique de réactivation du chromosome X dans l’embryon de souris

Chez les mammifères, le formation de l’embryon et des gamètes (précurseurs des ovules et spermatozoïdes= nécessite un changement radical d’expression des gènes et de marques épigénétiques dans les cellules. Dans les deux cas, cela implique un profond remodelage épigénétique, à travers des modifications telles que la méthylation de l’ADN et les marques des histones, ainsi que des spécificités en fonction du sexe de l’embryon. En effet, Il est, il existe de profondes disparités entre les sexes en termes de développement mais aussi de maladie et d’occurrence et mortalité des cancers. Pourtant très peu de données existent sur le chromosome X au cours du développement, ainsi que sur les spécificités de la reprogrammation épigénétique en fonction du sexe. Au cours du développement, cette reprogrammation est essentielle à l’obtention de cellules reproductives et à la perpétuation de l’espèce et elle est accompagnée par la réactivation du chromosome X inactif chez les femelles. Ce chromosome inactif représente un paradigme de contrôle épigénétique de l’expression des gènes à l’échelle d’un chromosome entier. Quand et comment a lieu la réactivation du chromosome X ? Quel est son impact sur la lignée germinale ? Une meilleure compréhension du contrôle de l’expression génique au cours de la reprogrammation développementale permettra également de comprendre les aberrations transcriptionnelles observées dans les cellules cancéreuses.

L’utilisant de nouveaux modèles murins apportera de nouvelles connaissances sur la lignée germinale, le développement pré-implantatoire, les différences entre les sexes et le contrôle épigénétique des gènes. Cela pourra avoir des implications futures en médecine régénérative et de la reproduction, nous permettra d’approfondir nos connaissances sur la transmission épigénétique entre les générations, et ouvrira de nouvelles avenues thérapeutiques pour le traitement des cancers en prenant en compte le sexe des patients. Cela est aujourd’hui considéré comme crucial, et par l’Union Européenne, et par le NIH aux Etats-Unis.

Les femelles sont super-ovulées pour produire plus d’ovocytes ce qui nous permettra d’utiliser moins d’animaux. Ces femelles seront stimulées par deux injections d’hormones à 48h d’intervale , en intrapéritonéale. Ces injections sont utilisées en routine dans de nombreuses animaleries et n’entraînent pas d’effets indésirables pour les femelles. L’injection en intrapéritonéale dure en soit quelques secondes, et l’accouplement a lieu courant de la nuit suivant la 2nde injection. Le prélèvement des embryons a lieu entre le matin et le 3e jour après l’accouplement. Au total la stimulation hormonale de la première injection à l’euthanasie de la femelle est de 68 à 120h heures. Nous ne nous attendons pas à des effets secondaires suite à cette injection qui sera pratiquée uniquement par des personnes habilitées et formées et qui est une procédure standard dans l’animalerie. Les mâles reproducteurs resteront seuls dans leur cage, une fois l’accouplement ayant eu lieu, et avant le prochain accouplement. Nous nous assurerons d’une grande quantité d’enrichissement dans les cages pour éviter tout stress lié à l’isolement. Ces mâles seront remis en accouplement très régulièrement (plusieurs fois par mois) ce qui ne donnera pas lieu à des isolements prolongés (< 10 jours). Cet isolement est nécessaire pour éviter les bagarres entre animaux mâles après accouplement.

Pas d’effet indésirable attendu sur les mâles isolés car ces derniers seront régulièrement mis en accouplement (plusieurs fois par mois), ce qui ne devrait donc pas générer de stress important à l’animal. Les femelles superovulées seront manipulées au minimum, avec seulement deux injections intrapéritonéales nécessaires à 2 jours d’intervalle. Nous ne nous attendons pas à des effets secondaires suite à cette injection qui sera pratiquée uniquement par des personnes habilitées et formées et qui est une procédure standard dans l’animalerie. Si toutefois un animal présentait un stress important, un problème comportemental ou une apparition d’une blessure/tumeur de façon fortuite, nous euthanasierons l’animal dans les plus brefs délais pour éviter toute souffrance animale.

Apres superovulation ou accouplement naturel, les femelles gestantes seront euthanasiées pour récupérer les embryons datés. Les mâles reproducteurs seront gardés en vie pour production d’autres embryons datés. Les mâles seront sacrifiés autour de 15-18 mois. Tous les animaux sont euthanasiés en fin de projet, aucun ne pourra être réutilisé.

L’inactivation du chromosome X est un phénomène conservé et spécifique des femelles de mammifères, impliquant que notre modèle soit la souris. Notre étude ne peut en aucun cas être menée sur d’autres modèles animaux non mammifères. De plus, il est connu que l’inactivation est un processus très dynamique pendant le développement, dépendante du stade gestationnel, de l’état de différentiation et de l’origine cellulaire. Il est donc important d’avoir recours à une étude développementale sur animaux vivants pour comprendre les mécanismes de réactivation. Nous proposons d’étudier l’expression des gènes par transcriptomique, et hybridation des ARN, et les marques épigénétiques, dans l’embryon préimplantatoire de souris entre la fécondation et l’implantation (1ère vague d’inactivation et réactivation du chromosome X) et dans les cellules germinales primordiales, qui sont présentes entre 7 et 13 jours de développement embryonnaire (dpc). Les embryons seront issus de croisements entre souris sauvages et transgéniques pour nous permettre d’isoler des embryons femelles avec une inactivation biaisée du chromosome X et des marqueurs fluorescents des cellules germinales et/ou du chromosome X. Les parents transgéniques ainsi que la descendance ne présentent aucun phénotype dommageable. Les embryons (femelles et mâles en contrôle) seront collectés entre 0.5 et 4.5 et entre 7.5 et 13.5 jours de développement embryonnaire. Les animaux transgéniques nécessaires sont déjà disponibles et nous possédons un grand jeu de données transcriptomiques sur le modèle souris dans le laboratoire.