Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 29/04/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-882236)
2500 poissons zèbres vont être utilisés, la quasi-totalité tués à l’issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés ou menées sous anesthésie sans réveil. Des lignées mutantes développent une scoliose progressive pouvant réduire leur capacité à nager et à accéder à la nourriture, et des larves reçoivent des injections de colorant dans le cerveau sous anesthésie terminale. Un morceau de nageoire est prélevé pour le génotypage et vingt individus seulement sont gardés vivants pour reproduction. Le porteur indique utiliser des modèles cellulaires mais affirme que l’étude de la colonne vertébrale sur un vertébré reste essentielle.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Ce projet vise à identifier les mécanismes d’apparition de scolioses chez le poisson zèbre en lien avec les anomalies du fonctionnement des cils du système nerveux. Nous étudions des gènes qui causent des ciliopathies, des maladies humaines rares liées à des défauts de formation ou de fonction des cils, des organites cellulaires sensoriels et motiles présents sur la majorité des cellules. Le poisson zèbre a des intérêts scientifiques et techniques uniques pour l’étude des processus développementaux: transparence des embryons, développement externe, possibilité de produire et d’étudier des lignées mutantes. De plus, c’est un modèle reconnu de la scoliose idiopathique, une maladie très répandue (qui affecte 3% des adolescents dans le monde) dont l’étiologie est très mal comprise. Notre projet se subdivise en 3 objectifs: 1) Identifier les mécanismes d’apparition de la scoliose due à une dysfonction ciliaire, en prenant pour modèle un mutant de poisson-zèbre. Ce mutant ne présente pas de létalité embryonnaire à l’état homozygote et développe une scoliose progressive chez le poisson juvénile. 2) Tester les interactions fonctionnelles entre différents protéines ciliaires et avec des acteurs de la signalisation des neuropeptides en étudiants des doubles mutants. 3) Tenter de diminuer ou de retarder la scoliose par des traitements par des drogues. Pour l’ensemble du projet, nous utiliserons 2500 animaux sur 5 ans. Les animaux utilisés pour des expériences avant la fin du stade embryonnaire (5 jours) ne sont pas inclus dans ce décompte.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les bénéfices attendus sont, à court et moyen terme, de mieux comprendre les événements qui conduisent à la scoliose chez le poisson-zèbre, en espérant à plus long terme que les mécanismes pathologiques identifiés pourront au moins en partie être validés chez l’homme. La scoliose idiopathique est une maladie d’origine inconnue qui touche environ 3% des adolescents dans le monde. Ceci est particulièrement important car il n’existe à ce jour pas de traitement médicamenteux pour la scoliose. Les seules interventions possibles sont le port d’un corset, traitement préventif, qui ne corrige pas la scoliose déjà existante, ou l’arthrodèse, une chirurgie lourde qui consiste à fixer les vertèbres les unes aux autres.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Des animaux mutants ou double-mutants à phénotype dommageable de scoliose seront produits. La scoliose apparait entre 4 et 5 semaines après la ponte. Dans le cas où les animaux sont produits pour observation de l’évolution de la scoliose, les animaux seront maintenus jusqu’à l’âge de 6 mois. La durée de cette procédure est donc de 6 mois. Dans le cas où les animaux sont euthanasiés pour prélèvements, l’euthanasie interviendra à 3 stades différents : 5-21 jours, 3-9 semaines (2 stades différents) et 3-4 mois. Dans ces deux cas, entre 1 à 2 mois, un petit morceau de nageoire caudale sera prélevé sur l’alevin anesthésié pour l’identification afin de conserver les alevins au génotype intéressant. L’anesthésie pour prélèvement de nageoire dure moins d’une minute. Une à deux semaines après le prélèvement, la nageoire caudale a complètement régénéré. Pour la procédure d’injection de billes ou dye fluorescent dans le ventricule cérébral ou canal central, les larves anesthésiées seront soumises à des injections sous loupe binoculaire de Dye fluorescent ou billes dans le ventricule cérébral ou canal: 90 larves âgées de 5 jours et 90 larves âgées de 15 jours seront injectées puis la diffusion du Dye sera observée sous microscope pendant 2h dans une atmosphère thermostatée et sous anesthésie. Les larves seront euthanasiées à la fin de l’expérience, donc au bout de 2 heures. Pour la procédure de test de drogues pour diminuer ou retarder la scoliose, un test de drogues sera réalisé sur 600 alevins âgés de 7 jours à 8 semaines. Observation de l’apparition de la scoliose pendant ces 7 semaines d’expériences. Vers 1-2 mois, un petit morceau de leurs nageoires caudales sera prélevé sur l’alevin anesthésié pour l’identification afin de conserver les alevins au génotype intéressant.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La principale nuisance attendue vient de l’utilisation de lignées mutantes de poissons qui développent une scoliose à l’état homozygote chez l’adulte. Cette scoliose (torsion tridimensionnelle de la colonne vertébrale en absence de malformations vertébrales ou de fractures) peut, dans les cas les plus graves, induire une difficulté de nage donc une mobilité réduite et une compétition avec des poissons sains pour l’accès à la nourriture.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
La production de lignées double-mutantes pour l’observation de l’apparition de la scoliose est procédure de sévérité modérée. Les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérience (adultes de 6 mois environ), sauf dans les cas où ils doivent être euthanasiés plus tôt car ils ont atteint les points limites selon notre grille de scoring. 20 animaux seront gardés en vie pour être réutilisés. La production de lignées mutantes pour analyse phénotypique sur animaux euthanasiés est une procédure de sévérité modérée. Dans cette procédure les animaux seront euthanasiés eà différents stades larvaires, juvéniles et adultes pour prélever les organes et réaliser des analyses. La seule raison pour les euthanasier en dehors de ce protocole serait les cas où ils doivent être euthanasiés plus tôt car ils ont atteint les points limites selon notre grille de scoring. La procédure d’injection de billes ou dye fluorescent dans le ventricule cérébral ou canal central est une procédure sans réveil. Toutes les larves seront sous anesthésie pendant toute la durée de la procédure et euthanasiées à la fin. En effet, l’injection d’un colorant fluorescent dans les ventricules du cerveau et l’observation de la larve vivante sous microscope pendant plusieurs heures compromettent la viabilité de l’animal et génèreraient potentiellement des souffrances en cas de réveil. La procédure de test de drogues pour diminuer ou retarder la scoliose est une procédure de sévérité modérée. Les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérience (8 semaines ou 12 semaines en fonction du génotype), sauf dans les cas où ils doivent être euthanasiés plus tôt car ils ont atteint les points limites selon notre grille de scoring.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Dès que possible nous utilisons des modèles cellulaires pour remplacer l’expérimentation animale. Nous avons ainsi développé dans les dernières années des modèles de cellules souches embryonnaires de souris et de cellules pluripotentes induites humaines que nous différencions en différents types neuronaux, en deux dimensions et en culture de type organoïdes. Ceci nous permet de comprendre par exemple le rôle des cils dans la formation des neurones. Néanmoins, l’expérimentation sur le poisson reste essentielle, en complément des modèles cellulaires, afin d’étudier sur un organisme vertébré les processus de développement aussi complexes que la morphogenèse du système nerveux central ou de la colonne vertébrale.
2. Réduction
Le développement externe des embryons nous permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. En effet une même femelle peut être accouplée toutes les semaines pendant au moins un an pour produire des œufs fécondés pour les expériences, sans aucun dommage pour elle. Lorsque c’est possible, nous utilisons les œufs produits (jusqu’à 200 par ponte) pour plusieurs expériences simultanément. Nous réutilisons aussi les animaux adultes produits dans certaines expériences (par exemple des animaux hétérozygotes pour certaines mutations) pour réaliser d’autres expériences. Dès qu’un animal n’est plus utile pour les expériences il est euthanasié. Enfin, afin d’identifier le plus tôt possible les animaux qu’il faut garder et ceux qu’il faut supprimer, nous avons mis en place lorsque c’est compatible avec le protocole expérimental, le génotypage des poissons dès l’âge de 1 mois (au lieu de 2 mois habituellement). Le nombre total d’animaux impliqués est de 2500.
3. Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux sont très précises afin de préserver le bien-être animal et d’enrichir l’environnement. Les poissons zèbres sont élevés dans une eau circulante (renouvellement de l’eau de l’aquarium environ 8 fois par heure) à 26-28°C, en eau douce, à une densité maximale de 5 poissons par litre. Les poissons aimant être en groupe, les périodes d’isolement (nécessaires au moment du génotypage des poissons pour identification d’une mutation) sont réduites à 10 jours maximum (en général 2-3 jours). Les alevins (5 à 15 jours post-fécondation) sont nourris avec des rotifères, de la nourriture vivante, ce qui leur permet de chasser. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Nous avons établi une grille de scoring des animaux qui permet de répertorier tout aspect ou comportement anormal et de lui attribuer un score. Un animal est euthanasié dès qu’il atteint un score égal ou supérieur à 4. Les animaux sont anesthésiés pendant les procédures expérimentales pouvant générer une douleur.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l’étude du développement embryonnaire. Son développement rapide et externe, le grand nombre d’embryons synchronisés par ponte, la transparence des embryons, les possibilités de transgenèse et de mutagenèse, en font un modèle de choix pour la recherche. Les possibilités d’imagerie sur embryon vivant font du poisson-zèbre un excellent modèle vertébré pour étudier la dynamique des processus de morphogenèse. Nous analysons également l’impact d’un défaut des cils sur l’apparence de scoliose, pathologie pour laquelle le poisson-zèbre est un modèle de choix du fait des contraintes mécaniques subies par la colonne vertébrale pendant la nage. Ce modèle permet d’étudier les étapes précoces de la maladie, avant la survenue de la courbure, ce qui est difficile chez l’homme. Le poisson-zèbre permet également de tester des molécules chimiques pour retarder ou réduire l’apparition des scolioses. Les nageoires caudales sont coupées pour le génotypage sur des animaux âgés de plus de 2 mois. Pour certaines expériences, nous pourrons génotyper les poissons à un stade plus précoce (1 mois) afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Afin d’étudier le développement de la scoliose, (phénotype dommageable modéré) nous réalisons des expériences sur des larves (5 jpf-21 jpf), des juvéniles (21 jpf-3 mois), et des adultes (> 3 mois).