Efficacité et toxicité après administration buccale et nasale de biothérapies anti-hémophiliques A et B chez des souris

L’hémophilie est une maladie hémorragique grave caractérisée par un déficit en agents de la coagulation, appelés facteurs de coagulation, sans lesquels la coagulation (formation du caillot de sang permettant de tarir l’hémorragie lors d’un traumatisme) est impossible. Un déficit en facteur numéro VIII aboutit à l’hémophilie de type A et un déficit en facteur numéro IX aboutit à l’hémophilie de type B. Le traitement actuel de cette maladie, qui consiste en l’administration régulière au long cours des facteurs de coagulation par voie intraveineuse, est efficace pour prévenir ou traiter l’apparition d’un saignement mais altèrent fortement la qualité de vie des patients. Le développement de voies d’administration, autres qu’intraveineuse, pour le traitement de l’hémophilie, permettrait donc d’améliorer la qualité de vie des patients. En pratique courante, il existe des médicaments qui peuvent être administrés au travers des muqueuses de la bouche ou du nez. Le nez a déjà montré son efficacité pour le passage de médicaments et de vaccins en dehors de l’hémophilie. La bouche présente elle l’avantage d’éviter le tube digestif (pas de dégradation du médicament, ni de réaction de défense de l’organisme) et d’avoir une muqueuse très fine facilitant la traversée des médicaments. Parmi les éléments impliqués dans la biodisponibilité muqueuse, un récepteur semble jouer un rôle majeur dans la capture des médicaments, qui s’appelle le FcRn. Ce récepteur joue ainsi un rôle de transporteur permettant le passage d’actifs à travers la barrière muqueuse. L’objectif de ce projet est ainsi de comparer deux voies d’administration muqueuses (voie nasale et voie buccale) de facteurs anti-hémophiliques dans un modèle de souris (souris sauvages ou modifiés génétiquement). Ce modèle permettra d’identifier les paramètres d’efficacité et de toxicité associé à ces deux nouvelles voies d’administrations non invasives. Cinq médicaments seront testés : les facteurs VIII et IX non modifiés, 2 dérivés du facteur IX et 1 dérivé du facteur VIII, modifiés pour améliorer leur disponibilité dans le sang leur liaison au récepteur FcRn. Après chaque traitement, des études de coagulation seront effectuées, nécessitant 2400 souris sur une durée de 5 ans afin d’atteindre une puissance statistique nécessaire à l’interprétation des données.

Le développement de voies d’administration non invasives pour les facteurs anti-hémophiliques pour le traitement de l’hémophilie A et B seraient bénéfiques pour les patients : – Améliorer l’adhésion au traitement – Améliorer l’observance (la prise régulière des médicaments à visée préventive) – Améliorer la qualité de vie en réduisant les contraintes liées aux injections répétées – Eviter des réactions de défenses de l’organisme en évitant le tube digestif (comprimé) et la circulation sanguine (administration par voie intraveineuse)

Pour la procédure 1, seulement un poiçon d’oreille sera réalisée pour pouvoir bien contrôler la qualité génétique de la lignée, Ce geste de quelques secondes sera réalisée par un zootechnicien entrainé et une légère compression (quelques secondes) sera réalisée si besoin. Pour les procédures 2 à 5, l’administration des médicaments se fera sur des animaux anesthésiés pour pouvoir évaluer l’efficacité de deux nouvelles voies d’administrations au travers de la muqueuse, la voie nasale (gouttes nasales) et la voie buccale (application d’un patch). Le patch, composé de sucres et des facteurs de coagulation, mesure 6mmx2mm et est placé sur la face ventrale de la langue. Il est mucoadhésif, biocompatible et se dégrade dans la salive en environ 20 min. Seulement une voie d’administration sera testée pour chaque souris. Il s’agit d’un inconfort de niveau léger et de très courte durée (temps d’administration inférieur à 1min dans les 2 cas (nasale et buccale) et prélèvement au maximum 24 heures après l’administration). De plus, cette administration sera exécutée après une anesthésie générale gazeuse. Il y aura 2 tests d’efficacités, un prélèvement sanguin et une section de la queue pour observer la coagulation, un seul réalisé pour chaque souris. Dans les deux cas, les gestes seront réalisés sous anesthésie générale et suivi d’une mise à mort alors que la souris sera toujours sous anesthésie générale. Ces tests seront réalisés au maximum 24 heures après l’administration nasale ou buccale. Durant le projet, tout sera mis en œuvre pour répondre au mieux aux critères de remplacement, de réduction et de raffinement (3R).

Un inconfort léger après administration nasale ou buccale est attendu pour une durée de quelques minutes. Puis les animaux seront tous mis à mort au maximum dans les 24h après l’administration des facteurs de la coagulation pour prélever le sang et pouvoir doser les facteurs de coagulation qui sont passés de la muqueuse à la circulation sanguine. Concernant le test de coagulation par section de la queue, il sera intégralement réalisé sous anesthésie générale avec mise à mort en fin d’expérimentation donc aucun effet indésirable n’est attendu. En raison du phénotype dommageable (l’hémophilie prédispose à des saignements), même si ces souris présentent très peu de signes cliniques tels qu’observés chez l’homme (hémorragies internes spontanées), en cas d’agressivité et de combats dans la cage, une hémorragie peut survenir et elle peut être mortelle. Une surveillance quotidienne de ces lignées est donc prévue (weekends et jours fériés inclus). En cas d’hémorragie, les souris seront mises à mort.

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure : – pour la procédure 1 : après 6 mois de reproduction les souris seront mise à mort pour le remplacement des géniteurs. – pour les procédures 2 et 3 : le prélèvement sanguin est terminal car un important volume de plasma (partie du sang contenant les facteurs de coagulation) est nécessaire. Les souris seront mises à mort en fin de prélèvement alors qu’elles sont encore sous anesthésie générale. – pour les procédures 4 et 5 : l’efficacité clinique des facteurs anti hémophiliques, c’est-à-dire leur capacité à arrêter un saignement, ne peut se démontrer qu’à l’aide d’un test de coagulation réalisé en conditions réelles de blessures. Ce test de référence est la section d’un petit morceau de queue et une observation du temps de saignement (au maximum pendant 10minutes) chez une souris sous anesthésie générale. Les souris ne seront pas réveillées à l’issu du test, et elles seront mises à mort. – pour toute les procédures de 1 à 5, si un point limite est atteint, les animaux seront tous mis à mort.

La souris hémophile est la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de la coagulation. En effet, le dosage de l’activité coagulante des facteurs anti-hémophiliques humains ne peut être effectué qu’en l’absence des protéines analogues du modèle. Le statut hémophile est donc indispensable. C’est pourquoi l’utilisation de souris pour cette étude se justifie car uniquement deux modèles d’animaux hémophiles sont disponibles : le chien et la souris. Les deux modèles murins hémophiles (hémophilie A et hémophilie B) servant de base à tout protocole préclinique concernant l’activité coagulante des facteurs sont très bien caractérisées. Ils permettent de mettre en évidence la capacité coagulante des molécules générées après l’administration de molécules thérapeutiques. L’absence des facteurs anti-hémophiliques murins proches de nos facteurs anti-hémophiliques humains est un prérequis pour la mesure de l’activité du produit. En plus d’être un modèle pertinent en hématologie et en immunologie, la souris est un animal de petite taille, facilement manipulable et génétiquement bien caractérisé. Ce protocole sera effectué sur des souris sevrées depuis 3-4 semaines (le sevrage se fait entre 3 et 4 semaines de vie selon la taille des souriceaux). Ces souris (entre 6 et 12 semaines) seront pesées quotidiennement à partir de la 3ème semaine de sevrage pour vérifier qu’elles ont le poids idéal (soit au moins 20-25g), pour recevoir un maximum de 10µl de matériels à tester par voie nasale et un patch de 10mm². En effet, ces jeunes individus présentent des parois vasculaires plus propices à une bonne efficacité des molécules à tester nous permettant de nous rapprocher des conditions chez l’homme. Ainsi, les modèles animaux seront bien représentatifs du profil hémorragique observé dans l’hémophilie. Des individus plus âgés ont un profil de coagulation différent des individus plus jeunes. Les expérimentateurs sont formés aux gestes impliquant un contact avec la souris, et à l’observation des signes cliniques fondamentaux, coagulation inclus.