Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2022-05-13 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-732955)
30 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées à l’issue et 2 500 réutilisées dans un autre projet. Le porteur leur greffe sous la peau des tumeurs dont il laisse le volume atteindre 1 000 à 2 000 mm³, teste des composés anticancéreux et mesure la tumeur au pied à coulisse, avec implantation chirurgicale de pompes et prélèvements sanguins répétés. Les souris incluses sont euthanasiées par dislocation cervicale ou au CO2, celles écartées à la randomisation pouvant être réutilisées. Il affirme que l’étape chez l’animal reste « indispensable » malgré les tests in silico et in vitro préalables.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
En Europe comme aux Etats-Unis, le cancer est actuellement la seconde cause de mortalité après les maladies cardiovasculaires. En France, le cancer provoque environ 33% des décès chez les hommes et 23% chez les femmes. Il est donc primordial de s’intéresser à cette maladie et de trouver de nouvelles thérapies. Les cellules cancéreuses sont initialement des cellules normales qui ont acquis, au cours du temps, un certain nombre de mutations faisant qu’elles ne répondent plus aux différents mécanismes de régulation et prolifèrent indéfiniment engendrant la formation d’une tumeur maligne et/ou de métastases. Un enjeu majeur pour la recherche consiste à trouver de nouvelles thérapies ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses, tout en limitant les effets secondaires sur l’organisme. L’objectif de ce projet consiste à tester de nouvelles thérapies, spécifiques des cellules cancéreuses, sur un modèle tumoral préalablement établi et parfaitement maitrisé chez la souris. Un moyen d’évaluer l’efficacité des molécules testées est de mesurer la régression tumorale en réponse au traitement de tumeurs greffées sous la peau, au moyen de mesures régulières de leur taille avec un pied à coulisse pendant une durée maximale de 4 mois. Ces études d’efficacité in vivo ont pour but premier de caractériser l’activité antitumorale des produits au sein d’un organisme vivant et complexe, l’objectif ultime étant le développement d’un candidat médicament pour le cancer. Les produits sélectionnés peuvent être évalués sur différents schémas de traitements (en modulant les doses, les voies d’administration, le nombre d’administration par jour, la récurrence ou une diffusion continue) afin d’escompter une régression partielle ou totale de la tumeur.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
A travers l’investigation in vivo de potentiels candidats médicament, ce projet va permettre d’évaluer leur activité antitumorale, seuls ou en combinaison avec d’autres thérapies, et ainsi identifier des nouvelles stratégies dans la lutte contre le cancer. De plus, il rendra possible l’investigation de différentes modalités et schémas d’administration, de façon à trouver les conditions optimales pour maximiser l’efficacité contre les cellules tumorales et minimiser la toxicité pour les cellules saines, véritable enjeu pour le bien être des patients. Les produits sélectionnés peuvent être évalués sur différents schémas de traitements (en modulant les doses, les voies d’administration, le nombre d’administration par jour, la récurrence ou une diffusion continue ) afin d’escompter une régression partielle ou totale de la tumeur. A travers les deux procédures décrites, les objectifs du projet vont être plus précisément les suivants : – démontrer l’efficacité antitumorale in vivo de nos composés et ainsi soutenir l’intérêt thérapeutique de la cible en question, ce qui est primordial au développement d’un candidat médicament – rechercher les indications thérapeutiques et les combinaisons qui permettent au candidat d’exprimer au mieux son potentiel curatif – établir une relation PK/efficacité et ainsi mieux comprendre et exploiter les données générées – déterminer le profil d’exposition optimal pour avoir une activité antitumorale (via l’utilisation de pompes implantées en sous-cutanée chez la souris) – investiguer la persistance d’efficacité du traitement sur la réponse immunitaire grâce à la réimplantation en contra-latéral de la même lignée tumorale après observation d’une régression tumorale complète de la greffe initiale (« rechallenge ») – étudier la formation de métastases suite à une greffe en sous-cutanée, en intradermique ou intra-mammaire et leur sensibilité au traitement.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
– Ponction à la veine jugulaire (durée 5 minutes) : 1 prélèvement de sang au dernier jour de traitement (ou en cours de traitement), sous anesthésie gazeuse, à raison de 10% du volume total de sang en 1 fois (pour les analyses de pharmacocinétique, pharmacodynamie ou biomarqueurs). Ex : 158µL pour une souris de 25g – Ponction cardiaque ou veine cave (durée 5 minutes): 1 prélèvement de sang en procédure terminale, sous anesthésie gazeuse et suivie par l’euthanasie de l’animal (pour les analyses de pharmacocinétique, pharmacodynamie ou biomarqueurs). Ex : 500µL/souris « Microsampling » (durée environ 1 minute) : prélèvements de sang, en cinétique (Ex 1 : 6 temps/ prélèvements de 40µl sur une semaine), à la veine marginale latérale du membre inférieur sur animal vigile, au maximum 1 fois par semaine, en ne dépassant pas la limite totale cumulée de 15% du volume total de sang circulant sur 28 jours (pour les analyses de pharmacocinétique, pharmacodynamie ou biomarqueurs) -Eventuellement, prélèvement de la tumeur primaire (durée 15-20 minutes) (sous anesthésie gazeuse et analgésie pré et post opératoire) dans le cas de lignées métastatiques greffées en sous-cutanée, en intradermique ou en intramammaire pour évaluer l’efficacité anti-métastatique du composé -Dans le cadre de l’implantation d’une pompe (durée 15 minutes si implantation en SC , et 1 heure si cathéter en IV), les animaux seront sujets à une intervention chirurgicale. Les conditions adaptées d’anesthésie et analgésie seront appliquées de façon à réduire autant que possible la douleur.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Le but du projet étant d’étudier l’activité antitumorale de nos candidats médicament dans des modèles relevant de la pathologie, les souris reçoivent une greffe de cellules cancéreuses ou de fragments tumoraux sous la peau qui vont développer une tumeur de taille limitée à 1000 ou 2000 mm3 selon la procédure mise en œuvre. Concernant les traitements pharmacologiques, les doses de produits à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet). Cependant, selon la cible du candidat médicament, même à des doses tolérées dans l’absolu, il peut y avoir une toxicité allant de faible à modérée. En effet, même si les efforts pour identifier des thérapies ciblées sont nombreux, les cellules tumorales sont à l’origine des cellules normales du soi : il est donc très difficile de trouver des traitements qui affectent uniquement les cellules cancéreuses en épargnant complétement les tissus sains. L’administration des candidats traitements pourra être effectuée via une pompe implantée sous chirurgicalement sous la peau du dos. Enfin, ce projet peut nécessiter l’utilisation de souches de souris transgéniques ou mutantes leur conférant un statut immunodéprimé. Ce statut peut être considéré comme un phénotype dommageable mais non exprimé dans des conditions d’hébergement protégées de l’environnement extérieur strictes.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de toutes les procédures décrites dans ce projet, les animaux inclus dans l’étude seront euthanasiés, soit par dislocation cervicale, soit par inhalation de CO2. Eventuellement, un prélèvement de sang via une ponction cardiaque, à la veine jugulaire ou à la veine abdominale (sous anesthésie gazeuse) pourra être effectué au préalable. Les animaux ne rentrant pas dans les critères d’inclusion le jour de la randomisation pourront être réutilisés dans un autre projet, dans la mesure du possible et à la suite d’une validation par SBEA et/ou vétérinaire de leur bon état général. Il se peut que quelques souris supplémentaires (non incluses dans la randomisation) soient traitées avec le composé à tester pour faire une caractérisation biochimique et/ou moléculaire des tumeurs en ex vivo.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Aujourd’hui, de plus en plus de tests in silico et in vitro sont mis en place pour caractériser autant que possible les candidats médicaments, de façon à n’investiguer in vivo que les meilleurs candidats issus de ces sélections. Cependant, cette étape chez l’animal reste aujourd’hui encore indispensable : en effet, même avec les limitations inévitablement liées à n’importe quel modèle, c’est dans un organisme vivant complet que l’on peut vraiment étudier les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse, son comportement dans un système complexe et plus relevant d’un point de vue physiologique, ses potentiels effets secondaires.
2. Réduction
Avant la mise en oeuvre de ce projet, des tests in vitro et in vivo sont systématiquement effectués afin de sélectionner les meilleurs composés à investiguer. des screenings biochimiques et cellulaires vont permettre d’identifier les molécules inhibant la cible de manière spécifique et ayant une puissance cellulaire satisfaisante. Des tests ADME (Absorption, Distribution, Métabolisme et Elimination) sont ensuite effectués in vitro puis in vivo pour identifier et sélectionner les produits circulants avec une exposition suffisante dans l’organisme. Enfin, on s’assure qu’ils atteignent bien leur cible d’intérêt et induisent l’effet escompté via des études de pharmacodynamie. C’est seulement après ces étapes que l’on peut évaluer leur efficacité antitumorale. Les conditions et taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été déterminés au préalable dans un projet dédié et permettent de définir au préalable les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires. C’est seulement sur la base de ces données que les études d’efficacité antitumorale sont ensuite réalisées : uniquement les candidats les plus prometteurs vont être testés, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Les doses de produits à administrer à l’animal sont également sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet) afin de limiter les risques d’une potentielle toxicité des composés testés. La progression tumorale (volume tumoral) est mesurée via le pied à coulisse et permet un suivi dans le temps sur les mêmes animaux. Des prises de sang en « microsampling » (c’est-à-dire sur des petits volumes) peuvent aussi être effectuées au cours de l’étude afin d’analyser des biomarqueurs ou le profil d’exposition du composé (évitant aussi de faire des études de pharmacocinétique complémentaires) et ainsi optimiser les données d’activité antitumorale. Les conditions et taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été déterminés au préalable dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires par groupe avant le début de l’expérimentation avec le support de l’équipe biostatistique. Ce nombre d’animaux nécessaires par groupe pour évaluer l’efficacité d’un candidat sera estimé par simulation avec un modèle statistique longitudinal.
3. Raffinement
Tout au long de l’étude, les souris sont hébergées avec un enrichissement de milieu adapté de manière à favoriser leur instinct de nidification. il va également permettre de surveiller l’état général des animaux par observation de leur comportement vis-à-vis de celui-ci. La croissance tumorale, mesurée au moyen d’un pied à coulisse non invasif et indolore pour l’animal permet une caractérisation et un suivi de l’évolution de la tumeur dans le temps pour un même animal et ainsi une réduction de nombre d’animaux nécessaires à la conduite d’une étude. L’état général des souris est surveillé régulièrement et les volumes tumoraux sont mesurés au minimum 2 à 3 fois/semaine, pour l’objectif de l’étude et pour identifier les éventuels signes de souffrance et appliquer les points limites prédéfinis dès que nécessaire. Ces mesures sont effectuées sous anesthésie gazeuse en cas de pompe pré-implantée (procédure 2) pour éviter l’inconfort de l’animal lors de la contention. Au-delà de 1500 mm3, pour les tumeurs sous cutanées et 1000 mm3, pour les tumeurs intra-mammaires, une surveillance accrue et une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures est mise en place afin d’anticiper plus efficacement l’atteinte du point limite lié au volume tumoral. L’exérèse de la tumeur lorsqu’elle a lieu (procédure 1) et l’implantation de la pompe (procédure 2) sont effectuées selon les bonnes pratiques chirurgicales avec un protocole anesthésique et analgésique pré et post opératoire adapté, et une observation spécifique sur plusieurs jours jusqu’au rétablissement total. Le point limite de croissance tumorale est fixé à 1000mm3 afin de limiter la charge liée au dispositif cumulée à une tumeur. Au-delà de 600mm3, une surveillance spécifique avec une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures est mise en place afin d’anticiper plus efficacement l’atteinte du point limite. Les prélèvements de sang en « microsampling » sont privilégiés dès que possible (très petits volumes sanguins) et ne dépassent pas le volume maximal respectant le bien etre animal (maximum 15% du TBV (Total Volume Blood) sur 28 jours).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche préclinique. Le choix du modèle est dicté par le type d’anti-cancéreux étudié (souris immunocompétentes et/ou immunodéprimées) et le choix de la souche par les études de prise tumorale qui permettent de déterminer, en amont, tous les paramètres in vivo (taux de prise, temps de doublement, caractère éventuellement cachectique de la tumeur sur la souche, etc…) et ainsi définir les conditions optimales de greffe. La souche est conservée pour l’ensemble des études in vivo pour une tumeur donnée (DMA/DMT, pharmacocinétique, pharmacodynamie, efficacité). En effet, des différences importantes en termes de tolérance et d’exposition plasmatique d’un produit en fonction de la souche murine peuvent exister, ce qui pourrait impacter le bien-être des animaux ainsi que l’interprétation des résultats. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 6 semaines soit un poids corporel d’environ 18-20g. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments. Pour la procédure 2, compte tenu du volume de la pompe, les animaux sont utilisés le jour de la chirurgie à un poids > à 25 g.