Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 08/06/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-664878)
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des injections sous-cutanées cinq jours sur sept de J5 à J56 et sept tests neurocomportementaux dont le porteur ne précise pas la nature, pour tester un transporteur synthétique de cuivre contre la maladie de Menkès. Les souris malades non traitées présentent des défauts de croissance et un risque de mort par rupture aortique, et toutes sont tuées à J56 pour prélèvement des organes. Le porteur affirme qu’aucune alternative in vitro n’existe et conclut à la « nécessité » de recourir à la souris vivante.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La maladie de Menkès est une maladie rare causée par un défaut de transporteur de cuivre (ATP7A) au niveau des barrières intestinales, placentaires et cérébrales causant alors de nombreuses altérations des fonctions biologiques et un décès dans les premières années de vie. Les traitements actuels sont inefficaces et le devenir des enfants atteints reste extrêmement pauvre. Dans le contexte de cette maladie, l’obstacle du passage au niveau des barrières intestinales et cérébrales est responsable de la pathologie. Le développement et l’étude des nanoparticules ont montré qu’elles avaient une capacité de diffusion inter et intracellulaire augmentée grâce à leur faible taille leur permettant alors de traverser la barrière hématoencéphalique. Dans ce cas l’utilisation d’un transporteur synthétique de cuivre serait une solution thérapeutique. Dans un projet précèdent, nous avons démontré son passage cérébral par l’augmentation de la quantité de cuivre dans le cerveau de souris malades traitées avec le « médicament ». Ces premières études ont montré la tolérance au transporteur ayant permis de déterminer la dose et le rythme optimal d’injection. Le but de ce projet est alors d’optimiser les effets de l’administration répétées chez les souris atteintes sur la biodisponibilité du cuivre et la restauration des fonctions altérées des animaux malades. L’objet de cet avenant porte sur l’ajout d’un groupe d’étude composé de 10 animaux atteints traitées avec du cuivre-histidine, traitement actuel inefficace de la maladie. En effet, bien que le cuivrehistidine restaure une concentration normale de cuivre dans le sang, ce dernier n’atteint pas le cerveau et ne permet donc pas de restaurer les atteintes neurologiques. Nous voulons donc montrer que notre traitement expérimental sera plus efficace que le traitement actuel de la maladie.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Chez les animaux malades traités avec le Transporteur synthétique de cuivre : 1) Restauration des fonctions altérées, 2) Restaurations des fonctions cognitives principales, 3) Amélioration de la survie, 4) Restaurations des troubles squelettiques observés. L’objectif de ce projet est de produire un médicament capable de soigner des enfants porteurs de la mutation et qui ont une espérance de vie très réduite.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
1/Injections sous cutanées répétées de médicament ou placebo 5 jours sur 7 à partir de J5 et ce jusqu’à la fin du protocole à J56. 2/Tests neurocomportementaux au nombre de 7 allant de J3 à J56
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Chez les animaux malades non traités avec le TSC : défauts de croissance et difficultés d’alimentation, risque de mort des animaux non traités par rupture/anévrismes aortiques. Chez les animaux malades traités avec le TSC, une toxicité liée au produit peut apparaitre mais cela n’a encore jamais été observé dans les études que nous menons depuis juillet 2020. Des études de recherche de toxicité in vitro sur cellules hépatocytaires sont en cours.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
L’ensemble des animaux du protocole (60 animaux) seront gardés en vie après chaque procédure et ce jusqu’à la fin du protocole (fixé à J56 d’âge) afin de suivre l’évolution des animaux malades en réponse au traitement médicamenteux. L’âge de survie des animaux mutants non traités ou traités avec un placebo est comprise entre 3 et 5 semaines d’âge. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et tous les organes d’intérêt seront rapidement prélevés et conditionnés afin de réaliser des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Il est nécessaire d’étudier l’efficacité du transporteur synthétique du cuivre (TSC) sur des animaux vivants car l’objectif principal de l’étude est de montrer que ce traitement permet une pénétration du cuivre au niveau cérébral et une restauration des fonctions cérébrales liées aux cuproprotéines cérébrales. Le seul traitement actuel (administration parentérale d’histidinate de cuivre) permet de traiter les tissus non neurologiques des patients, donc sans effet sur le cerveau. L’intérêt majeur du TSC réside donc dans sa capacité à franchir la barrière hématoencéphalique ce qui conduit à l’hypothèse qu’il pourra restaurer ainsi les fonctions cérébrales des sujets atteints. Les études préliminaires ont montré un dosage du cuivre plasmatique en hausse chez les animaux traités à l’aide du TSC ainsi qu’une accumulation de cuivre au niveau cérébral (colorations par rhodanine (analyse laboratoire Anatomopathologie, CHRU Nancy-Brabois). Il n’existe pas d’alternative d’approche in vitro car le projet porte sur l’étude de l’allongement de la durée de vie et l’amélioration du comportement de l’animal porteur de la maladie de Menkès en fonction de la réponse au traitement.
2. Réduction
L’étude comportementale portera sur 60 souris de laboratoire, réparties en 6 groupes de 10 mâles dont 2 groupes de 10 souris saines et 4 groupes de 10 souris malades. Cette cohorte de 60 souris mâles sera étudiée et mise à mort une fois les tests comportementaux terminés, à l’âge de 2 mois. L’étude sera réalisée avant 2 mois si les points limites sont atteints avant cette échéance. Il s’agit du nombre d’animaux nécessaires pour mener à bien cette étude afin d’obtenir une puissance statistique suffisante. Au final, 40 mâles hémizygotes et 20 mâles de type sauvage seront issus des accouplements de 40 femelles hétérozygotes à 40 mâles de type sauvage, et 20 femelles de type sauvage à 20 mâles de type sauvage, cela afin de garantir une indépendance totale des échantillons (en se basant sur l’unité indépendante correspondant à la portée). Ainsi environ 420 animaux seront générés dans le contexte de cette étude mais seuls les mâles hémizygotes ou de type sauvage seront mobilisés pour le protocole expérimental. Les animaux surnuméraires de type sauvage et ne subissant aucun traitement, seront attribués à d’autres projet après accord du vétérinaire référent
3. Raffinement
Les procédures expérimentales auront lieu au sein de l’animalerie, dans un environnement sécurisant pour les souris. Ces 2 procédures comprennent 1/ la gestion de la lignée mutante qui présente un phénotype dommageable pour l’animal et 2/ l’injection du transporteur synthétique du cuivre par piqure sous-cutanée et répétée 5 fois par semaine, associée à 7 séries de tests comportementaux, puis une mise à mort des animaux pour prélèvement des organes. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments visuels chez l’animal sont évalués afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). Plus globalement, les animaux malades non traités subiront comme les autres l’ensemble des procédures expérimentales mais ils seront surveillés avec encore plus d’attention afin d’anticiper au mieux les points limites.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris ATP7AMoblo est le seul modèle de mutation spontanée permettant une étude de cette pathologie génétique. D’autre part, ce choix se justifie par la possibilité de faire des liens avec d’autres modèles transgéniques murins d’autres maladies métaboliques Les géniteurs ont été produits par le Jackson Laboratory, puis importés en France en mai 2020 par la société Charles River avant d’être livrés à l’ACBS où la lignée est maintenue. Il s’agit de la lignée B6Ei.Cg-Atp7aMo-blo/J établie sur fond génétique C57Bl/6J Nous focaliserons l’étude sur les souriceaux durant la lactation des souris mères et jusqu’au-delà du sevrage, à J56, correspondant à la fin du dernier test comportemental. En effet, durant cette période nous pourrons évaluer l’efficacité du traitement sur l’évolution de l’activité neurocomportementale des animaux en réponse au traitement médicamenteux.