Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 12/07/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-199285)
22 750 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l’issue et 525 réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules ou de fragments tumoraux en sous-cutané, intradermique ou intra-mammaire, des administrations de candidats médicaments jusqu’à deux fois par jour et des prélèvements de sang, avant d’être tuées pour prélever la tumeur. Le porteur fixe un point limite de volume tumoral de 1 500 à 2 000 mm3 et indique que les souris surnuméraires servent à entraîner le personnel aux gestes techniques. Il affirme que l’étape animale reste « indispensable » pour évaluer une molécule anticancéreuse dans un organisme complet.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les études de pharmacodynamie ont pour but d’évaluer l’atteinte de la cible d’intérêt par un candidat médicament, au sein d’un organisme vivant et complexe. Une série de tests in vitro (biochimiques et cellulaires) est réalisée en amont afin d’identifier le meilleur candidat. Parallèlement, des tests de pharmacocinétique (PK) in vivo sont réalisés en complément. Ces études faites sur animaux non greffés, (a minima des souris), et à des doses faibles permettent de compléter la première sélection sur la base des caractéristique ADME (Absorption, Distribution, Métabolisme et Elimination). L’objectif est de sélectionner ainsi des candidats susceptibles d’atteindre leur cible d’intérêt avec une puissance cellulaire et une exposition plasmatique suffisantes dans l’organisme. En effet, une molécule très active sur la cible mais insuffisamment concentrée dans le plasma ne présentera par exemple aucune activité fonctionnelle sur la croissance tumorale. Dans ce projet, les tumeurs à étudier sont greffées sur souris et les doses testées sont plus fortes. Cela permettra d’établir une relation entre l’exposition du produit, la quantité de produit dans la tumeur et son niveau d’atteinte de la cible (PK/PD), chose que l’on ne peut pas faire sur souris non greffées. En fonction de la cible étudiée ou du candidat à caractériser, il est possible que ces études soient effectuées soit dans des conditions de système immunitaire fonctionnel sur des souris immunocompétentes (concernant dans ce cas des greffes de lignées tumorales murines), soit sur des souris immunodéprimées, classiquement utilisées en oncologie et présentant un système immunitaire altéré et permettant ainsi de recevoir des greffes de tumeurs d’origine humaine.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les cellules cancéreuses sont initialement des cellules normales qui ont acquis, au cours du temps, un certain nombre de mutations faisant qu’elles ne répondent plus aux différents mécanismes de régulation et prolifèrent indéfiniment engendrant la formation d’une tumeur maligne et/ou de métastases. Un enjeu majeur pour la recherche consiste à trouver de nouvelles thérapies ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses, tout en limitant les effets secondaires sur l’organisme. Ce projet permettra d’identifier les candidats médicaments qui agissent sur la cible d’intérêt (au niveau de la tumeur) et ainsi la sélection des produits qui feront alors l’objet d’études d’efficacité (effet sur la croissance tumorale) encadré par un autre projet.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
chez l’animal vigile : •Greffe sous-cutanée, 1 injection (durée environ 15 sec) •Pesée et Mesure de tumeur (environ 30 sec par mesure), 2 à 3 fois/ semaine le temps de l’étude (1 mois max + Mesure pour la randomisation) •Prélèvements de sang si nécessaire dans la limite de 10% du volume total de sang par prélèvement et limité à 15% de volume total de sang sur une période de 28 jours + Tonte de la patte arrière en vue du prélèvement sur animal vigile (en principe une seule fois sauf si un prélèvement a lieu longtemps après la randomisation et que les poils ont repoussé : 10 sec) •Administration de composés candidats médicaments : jusqu’à 2 fois /j suivant la nécessité de l’étude, entre 15 sec et 1 min selon les composés et la voie d’administration. Chez l’animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : •Greffe intra mammaire, intradermique ou intratumorale : 1 fois (durée Anesthésie + geste, environ 1min30)
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Le but du projet est d’évaluer l’atteinte de la cible d’intérêt par nos candidats médicament dans des modèles pathologiques. Pour ce faire, les souris reçoivent une greffe de cellules cancéreuses ou de fragments tumoraux en sous-cutanée, en intradermique ou en intra-mammaire pour développer une tumeur dont la taille cible est de 300mm3 environ (si la tumeur pousse de façon hétérogène, les critères d’inclusion peuvent être élargis entre 100-550 mm3) Concernant les traitements pharmacologiques, les doses de produits à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet). Cependant, selon la cible du candidat médicament, même à des doses tolérées dans l’absolu, il peut y avoir une toxicité allant de faible à modérée. En effet, même si les efforts pour identifier des thérapies ciblées sont nombreux, les cellules tumorales sont à l’origine des cellules normales du soi : il est donc très difficile de trouver des traitements qui affectent uniquement les cellules cancéreuses en épargnant complétement les tissus sains. Par ailleurs, ce projet peut nécessiter l’utilisation de souches de souris transgéniques ou mutantes leur conférant un statut immunodéprimé. Ce statut peut être considéré comme un phénotype dommageable mais qui ne s’exprimera pas dans les conditions d’hébergement protégées strictes appliquées au laboratoire
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux inclus dans l’étude après traitement et randomisation sur la taille de la tumeur greffée seront euthanasiés en vue de prélever la tumeur/sang pour effectuer des mesures in vitro : Réalisation des tests biochimiques et/ou moléculaires, visant à évaluer l’atteinte de la cible d’intérêt, à partir des lysats tumoraux (Western-blot, ELISA, MSD, immunohistochimie, qPCR, …). Dosage du principe actif dans les échantillons plasmatiques et/ou des lysats tumoraux, permettant la relation PK/PD. En cas d’animaux greffés surnuméraires, une ré-inclusion dans un autre projet pourra être prévue notamment pour des entrainements du personnel aux gestes techniques. A défaut, ils seront euthanasiés.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Aujourd’hui, de plus en plus de tests in silico et in vitro sont mis en place pour caractériser autant que possible les candidats médicaments, de façon à n’investiguer in vivo que les meilleurs candidats issus de ces sélections. Cependant, cette étape chez l’animal reste aujourd’hui encore indispensable : en effet, même avec les limitations inévitablement liées à n’importe quel modèle, c’est dans un organisme vivant complet que l’on peut vraiment étudier les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Son comportement dans un système complexe est plus relevant d’un point de vue physiologique
2. Réduction
Les conditions et taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été déterminés au préalable dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires avant le début de l’expérimentation. De plus, les doses de produits à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet) afin de limiter les risques d’une potentielle toxicité des composés testés. C’est seulement sur la base de ces données préalables que les études de pharmacodynamie sont réalisées : seuls les candidats les plus prometteurs vont être testés, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, des prélèvements de sang (entre 40 et 80 µl de sang) à la veine saphène latérale sont mis en œuvre chaque fois que possible pour avoir des informations sur des possibles biomarqueurs ou sur le profil d’exposition du composé (évitant ainsi des études de pharmacocinétique dédiées) et pour exploiter au mieux les données d’activité antitumorale en faisant, notamment, de la relation PK/PD. Si des prélèvements répétés sont prévus, le volume maximal prélevé n’excède pas les 15% de volume de sang total sur 28 jours. Cette technique de prélèvement peu invasive et rapide, permet de prélever plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volémie physiologiques. Si des volumes sanguins plus importants s’avèrent indispensables, les prélèvements seront réalisés en terminal, à la veine cave ou en intracardiaque, sous anesthésie gazeuse, juste avant le prélèvement de la tumeur. En cas d’animaux greffés surnuméraires après randomisation, une ré-inclusion dans un autre projet sera prévue.
3. Raffinement
Dans le cas d’un protocole avec traitement chronique, les animaux sont quotidiennement observés et les tumeurs sont mesurées au moins 2 par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais également pour limiter la souffrance et appliquer les points limites si nécessaire. De plus, au-delà de 1500 mm3 (pour les tumeurs SC et ID) et de 1000mm3 (pour les tumeurs IMam), une surveillance accrue et une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures sont mises en place afin d’anticiper plus efficacement l’atteinte du point limite attaché au volume tumoral. Si ce volume est atteint la veille du week-end, des dispositions seront prises en fonction de la croissance du modèle tumoral (déterminée lors des études de TK). Si la tumeur pousse rapidement et a un risque de dépasser les 2000mm3 avant le lundi, l’animal sera euthanasié. Dans le cas contraire, le volume tumoral sera réévalué dès le lundi. La progression du volume tumoral est mesurée via le pied à coulisse et permet un suivi dans le temps sur les mêmes animaux. Les souris immunodéprimées seront hébergées et manipulées dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulation strictes appliquées par tout le personnel et intervenants, et ce afin de prévenir tout risque d’infection et/ou contamination. Les souris immunocompétentes, quant à elles sont logées et manipulées dans un secteur conventionnel. Toutefois, pour des questions logistiques, elles peuvent être hébergées et manipulées dans le secteur à confinement spécifique dédié à l’expérimentation des souris immunodéprimées. Dans ce cas, elles sont de statut SOPF et sont logées et manipulées dans des salles dédiées et identifiées. Les souris sont hébergées en groupes sociaux. Pour répondre aux impératifs liés à l’expérimentation (nombre d’animaux par groupe/dose/temps…) ce nombre pourra varier, tout en restant dans les standards imposés de respect du nombre d’animaux maximum/superficie disponible Des éléments de nidification (ex : cocoon, sizzle…) sont apportés ainsi que des éléments d’enrichissement lavables (ex : tunnels…) permettent une complexification de l’environnement et l’expression des comportements naturels des souris
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans les publications en recherche préclinique. En effet, ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. Le choix de la souche est dicté par les études de détermination de la prise tumorale réalisées en amont de toute évaluation de candidat médicament. Cela permet de déterminer tous les paramètres in vivo (taux de prise, temps de doublement, caractère éventuellement cachectique de la tumeur sur la souche, etc…). La souche sélectionnée sera conservée pour toutes les études ultérieures quelle qu’elles soient. En effet, il peut exister des différences significatives en termes de tolérance et d’exposition plasmatique d’un produit fonction de la souche murine considérée, pouvant impacter les résultats. Femelle, sexe utilisé dans toutes nos études de pharmacologie et pour lequel nous avons un grand historique. Exceptionnellement, les mâles peuvent être utilisés dans le cas de produits dont la finalité est le traitement de tumeurs se développent spécifiquement chez la personne masculine.