Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 13/07/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-170986)
2 428 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des douleurs chroniques leur sont provoquées par ligature du nerf sciatique, implantation de cellules cancéreuses dans le tibia, ménisectomie ou injections d’agents inflammatoires, puis évaluées par immersion d’une patte dans un bain à 42 °C, pour tester des molécules antalgiques proposées à des clients. Le porteur indique que ces modèles restent douloureux et stables dans le temps, ce qui rend selon lui les rats non réutilisables et non replaçables. Il conclut que l’étude chez l’animal vigile reste la « seule option » avant le passage chez l’humain.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Cet ensemble modèle/ test a été développé à la demande de la direction de l’entreprise afin de répondre à une demande des entreprises pharmaceutiques clientes. Au sein du laboratoire, nous avons pu caractériser 10 modèles de douleur (neuropathie traumatique par ligature du nerf sciatique (CCI,SNI,SNL), neuropathie diabétique, douleur cancéreuse, et inflammatoire (CFA, MOA, Carragénine, Capsaïcine et ménescetomie partielle) chez le rat, avec des tests d’hyperalgésie et d’allodynie mécanique. La composante thermique est donc manquante afin de permettre de caractériser au mieux les candidats médicaments et améliorer la qualité de vie des patients. Ce modèle est très bien décrit dans la littérature. Chez l’homme, la douleur neuropathique est très hétérogène : elle reflète des signes et des symptômes différents. Des douleurs peuvent survenir à la suite de lésion secondaire (diabète, cancéreuse) ou traumatiques (sections d’un nerf). Ces douleurs se traduisent majoritairement par une allodynie (douleur induite par un stimulus normalement non douloureux) ou une hyperalgésie (sensation de douleur ressentie plus intensément) induite par le toucher, la pression, le froid et le chaud. Sur le plan pharmacologique, la douleur neuropathique répond mal aux antalgiques classiques ou présentent d’importants effets secondaires (Gapabentine, duloxetine et Morphine) d’où le besoin de mise au point de nouvelles molécules. Le but de ce projet, est de fournir un modèle pré-clinique pour tester l’intérêt de molécules antalgiques destinées au traitement d’une allodynie thermique liée à une neuropathie traumatique. Pour cela, nous avons mis en place un test d’immersion de la patte dans un modèle de neuropathie traumatique induite par la ligature du nerf sciatique chez le rat. La mise au point sur ce modèle nous permet de faire la translation avec les 9 autres modèles cité au-dessus. Ce couple modèle/test va nous permettre de proposer à nos clients un modèle au plus proche des conditions cliniques afin de tester de nouvelles molécules ciblant ce type de douleur.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’entreprise peut ainsi offrir à ses clients la possibilité de développer de nouveaux candidats médicaments. Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés avec un modèle proche de la clinique, qui nous permet de proposer de tester ces candidats médicaments dans des axes thérapeutiques thermique et/ou mécanique.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Induction du modèle douloureux par chirurgie: ligature du nerf sciatique ou du nerf spinal réalisé sous anesthésie générale (rompun/imalgène). Elle dure entre 10 et 15minutes. Implatation de cellules cancéreuses localement dans le tibia, Ménisectomie partielle. Injection d’agents inflammatoires en sous-cutanée plantaire. Injection intrapéritonéale de Streptozotocine (ajouter si douleur chronique ou aigue) Administration de composés par voie : orale (po), intrapéritonéale (IP), sous-cutanée (sc), intrathécale (IT), intraveineuse (IV), intradermique (IM) de manière unique ou répétée. (dans le cadre de ce projet, le traitement répété peut être réalisé afin de mimer au mieux les conditions chez l’homme et éviter un surdosage et donc des effets secondaires). Prélèvements de sang : jugulaire, caudale ou rétro-orbitaire ou en intracardiaque si l’animal n’est pas réveillé. 10 à 20% du volume de sang total / 100g pour un prélèvement unique et 10 à 20% du volume de sang total / 100g répartis entre 1 à 14 jours pour un prélèvement répété. Le nombre de prélèvements est limité à 3/jour si réveil 4 si pas de réveil Test : immersion de la patte dans un bain à 42°C pendant une période de 15seconde maximum. Les points peuvent être rapprochés au maximum de 15min. 6 points de cinétiques maximums par jour. 3 séries peuvent être réalisé (7jours après chirurgie, 14jours après chirurgie et 21 jours après chirurgie)
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Parmi les nuisances subies par les animaux,la chirurgie va impacter l’animal mais l’anesthésie par injection de rompun/imalgène permet de créer un effet antalgique le temps de la chirurgie. Des croquettes sont mises dans la cage afin que l’animal garde toujours un accès à la nourriture. L’induction peut aussi être faite par voie intrapéritonéeale (STZ) ou sous-cutannée plantaire (CFA, Carragénine, Capsaïcine). Dans le cadre de ce projet, les animaux subissent des tests de douleur aiguë évoquée (thermique par immersion de la patte dans une bain chaud). Le travail s’orientant vers de l’allodynie, une partie des animaux aura simplement une sensation de chaleur pour limiter cela la température choisie est de 42°C et un cut-off a été fixé à 15secondes d’immersion. Un maximum de 6 points de cinétique de test par semaine sur 3 semaines est fixé. Généralement seule une cinétique de 4 points de mesure est réalisée. Lors des tests, les animaux sont en contention. Pour limiter le stress, une habituation est réalisée un peu avant le test. Nous travaillons ici avec des modèles de douleurs, ils peuvent être chronique et stable dans le temps (modèles Cci, SNI, SNL, STZ, BCP, MNX, monoarthirte, procédure 1 à 7). Des points limites liées aux modèles (risque de mutilation, inflammation exagérée,palaysie de la patte arrière) peuvent survenir. Des points limites associées à la pharmacologie peuvent aussi apparaitre (tremblement, perte de poids, déshydratation…). Dans le cadre de certaines études, des prélèvements de sang peuvent être réalisés sous anesthésie (IC, caudale, jugulaire, retro-orbital) ou vigil en contention (caudale) l’anesthésie est privilégiée afin de limiter le stress de l’animal. Le prélèvement sur rat vigil n’est pas exclu (bien que limité) quand l’isoflurane (anesthésiant) interfère avec le dosage souhaité. Le volume de sang et le nombre de répétition sont encadrés comme suit : 10 à 20% du volume de sang total / 100g pour un prélèvement unique et 10 à 20% du volume de sang total / 100g répartis entre 1 à 14 jours pour un prélèvement répété. Le nombre de prélèvements est limité à 3/jour si réveil 4 si pas de réveil de l’animal
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Une grande partie des modèles utilisées ici sont des modèles stables dans le temps. Les animaux restent donc douloureux. Il n’est donc pas concevable de les replacer. Les autres modèles font mettre en place une réaction immunitaire qui peut interférer avec les autres modèles présents au sein du laboratoire. Les animaux ne peuvent donc pas être réutilisés. De plus la gamme de poids restent importante car la réalisation du test se fait en contention donc les animaux ne peuvent pas être trop gros. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésiques dans un modèle in vivo d’évaluation d’allodynie au chaud. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par le IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle » (https://www.iasp-pain.org/terminology). L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
2. Réduction
Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les tests de puissance réalisés lors du développement du modèle. En fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale), un test paramétrique ou non paramétrique sera réalisé (test-t, analyse de variance à une ou deux voie(s)) suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié via SigmaStat.
3. Raffinement
Notre activité permet de raffiner les modèles in vivo en se rapprochant au mieux situations cliniques (induction de pathologies, mesures des composantes multiples de la douleur). Nous limitons les doses et les injections au minimum afin de ne pas induire de douleurs supplémentaires. Le test comporte une valeur de cut-off à ne pas dépasser pour ne pas induire de souffrance. Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation une semaine à la salle de stabulation et 24h aux salles de tests). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise de l’entreprise (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie). Le suivi est réalisé par le technicien en charge de l’étude ou à défaut par un autre technicien (formé à l’expérimentation animale niveau I ou II ). De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique et briquettes en bois à ronger)
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle » (https://www.iasp-pain.org/terminology). L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.