Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 02/11/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-748194)
276 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une poche d’air est formée sous leur peau, des cristaux y sont injectés pour déclencher une inflammation, et un jeûne de vingt-quatre heures est imposé deux fois, avant un prélèvement de sang sans réveil, afin d’étudier l’effet du jeûne intermittent sur l’inflammation de la goutte. Le porteur indique n’attendre ni comportement douloureux ni effet nuisible du régime. Il juge difficile de reproduire un jeûne in vitro et renvoie à la vérification dans un « organisme entier ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les poussées inflammatoires articulaires observées dans les maladies microcristallines sont responsables de douleur et d’handicap majeur. Leurs mécanismes exacts demeurent encore incompris. La réaction inflammatoire est une réaction complexe qui peut être modulée par des facteurs environnementaux tels que l’alimentation et le cycle circadien. Le jeûne intermittent (JI) est une stratégie alimentaire qui améliore la santé. Il diminue les altérations liées au vieillissement, le stress oxydatif et les marqueurs inflammatoires. Il diminue l’inflammation de la polyarthrite rhumatoïde mais l’effet anti-inflammatoire s’arrête lors de la reprise de l’alimentation. Les mécanismes impliqués dans cette baisse de l’inflammation ne sont pas bien connus. D’un point de vue cellulaire et moléculaire, le JI module le métabolisme cellulaire, la régulation épigénétique (ce qui module l’expression des gènes) et plusieurs acteurs clés impliqués dans l’autophagie (mécanisme de défense cellulaire permettant le recyclage des organites et des protéines défectueux). Il favorise le catabolisme (c’est-à-dire la dégradation) des acides gras et la production de corps cétoniques (produits de dégradation des lipides) qui ont des propriétés anti-inflammatoires. L’autophagie assure le bon fonctionnement et l’intégrité cellulaires. Elle régule le métabolisme cellulaire, la réaction inflammatoire et la réponse immunitaire. Son activation inhibe le plus souvent la réaction inflammatoire. A l’inverse, son inhibition aggrave la réaction inflammatoire en favorisant la différenciation des macrophages inflammatoires. Nos objectifs sont d’identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires associés à l’effet anti-inflammatoire du JI. Nous confirmerons l’implication de l’autophagie dans cet effet anti-inflammatoire, identifierons les modifications du métabolisme cellulaire et épigénétiques et les signatures métaboliques associées au JI et à l’effet anti-inflammatoire. L’objectif ultime est d’identifier la meilleure stratégie alimentaire permettant de limiter la réaction inflammatoire. Cette stratégie pourra alors être testée chez l’homme.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet permettra d’acquérir des nouvelles connaissances sur l’inflammation microcristalline et des effets bénéfiques du JI. Il permettra d’avoir une vision élargie des modifications métabolomiques (ensemble des produits de dégradation des macromolécules comme les lipides, des protéines et du glucose) associées au JI sur 6 tissus différents chez un même individu. Il identifiera aussi les modifications épigénétiques régulées par le JI et associées à la réduction de l’inflammation et leur transmission potentielle aux descendants. Il identifiera des signatures métabolomiques liées au JI et à l’inflammation. Il permettra de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les maladies inflammatoires basées sur des stratégies alimentaires.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Injection en sous cutané de 3 ml d’air sur animal anesthésié : 20 secondes pour l’injection, 1 poche/animal, la poche est gardée une semaine. Injection dans la poche de 1 ml de solution saline ou de cristaux: 20 secondes pour faire l’injection réalisée sous animal anesthésié, 1 seule injection réalisée sous antalgique (buprénorphine 50 µg/kg en sous-cutané). Jeûne intermittent : 24 heures de jeûne, 2 jours non consécutifs. Prélèvement sanguin et lavage de poche sous animal anesthésié (kétamine/xylazine 160 mg/kg et 6mg/kg) et après injection d’antalgique (buprénorphine 50 µg/kg par voie sous-cutanée), procédure sans réveil.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La création de poche sous la peau est réalisée sous anesthésie gazeuse, les souris ne montrent pas de comportement douloureux. Lors de l’injection des cristaux dans la poche, il se produit une réaction inflammatoire locale, non visible par l’inspection. Les souris sont mises à mort 6 heures plus tard, elles n’ont pas de comportement douloureux durant les 6 heures de stimulation. Le protocole de jeûne intermittent qui sera mis en place est utilisé dans la littérature et a montré des effets bénéfiques sur la longévité et les maladies métaboliques. Il n’est donc pas attendu d’effet nuisible avec ce régime.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure 4 pour prélèvement d’organe.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
il est difficile de reproduire in vitro les conditions qui miment un jeûne car les cellules isolées ne résistent pas à une culture sans apport nutritif. Nous testerons les différentes concentrations de cristaux à utiliser in vitro pour réaliser une seule concentration in vivo. Nous testerons in vitro des cultures sans sérum et des cultures avec des milieux appauvris en acides aminés et en nutriment. Les expériences in vivo permettront de confirmer les résultats obtenus in vitro en intégrant les résultats au sein d’un organisme entier.
2. Réduction
pour réduire au minimum le nombre de souris, nous réaliserons le maximum de tests in vitro afin de déterminer les temps optimaux de privation de nutriments. Nous utiliserons, lorsque c’est possible, le même groupe témoin (régime normal) pour chaque expérience de jeûne. Les expériences in vivo seront adaptées au fur et à mesure afin de limiter le nombre d’expérience et de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Ces adaptations et ces tests in vitro permettront de mener une seule expérience in vivo pour répondre à une question précise. Si les résultats obtenus lors des premières expériences ne confirment pas l’hypothèse initiale, les expériences suivantes qui découlaient de l’hypothèse initiale soit ne seront pas réalisées soit seront adaptées aux résultats obtenus.
3. Raffinement
les souris seront, à la réception dans l’animalerie, réparties de façon aléatoire par groupes de 10 dans un environnement enrichi (jeux, abris, substrats, cachette, blocs de bois). Une période d’acclimatation de 7 jours sera respectée avant toute intervention sur les animaux. Les animaux sont élévés dans un environnement calme et surveillés de façon quotidienne. En cas de lésions générées par des combats de dominance, l’animal recevra des soins locaux (désinfection, pommade hydratante) associés à des analgésiques. Si les lésions sont importantes, l’animal sera isolé, mis dans un environnement calme et des soins locaux et des analgésiques poursuivis. Si l’animal montre des signes de souffrance (stéréotypie, repli, baisse des activités, perte de poids, vocalisation), il sera isolé dans un environnement enrichi, recevra un traitement analgésique. Son alimentation sera mise à disposition directement dans la cage. En l’absence d’amélioration, l’animal sera mis à mort. Il sera réintégré dans la cage après récupération d’un comportement normal et guérison des lésions. Tout animal qui s’alimente moins ou qui perd du poids en dehors du jeûne sera exclu de l’étude pour ne pas induire de biais expérimental. En l’absence de reprise de poids après isolement et soins, l’animal sera mis à mort. Dans le modèle de poche à air, utilisé dans le laboratoire depuis plusieurs années, les procédures de création de poche et injection de cristaux sont très bien tolérées par les animaux. Nous n’avons pas observé antérieurement de modification des comportement des animaux ni de lésion des poches. Après les injections de cristaux, si l’animal présente des signes de souffrance, un traitement analgésique sera administré
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La réaction inflammatoire est complexe et dépend de nombreuses interactions cellulaires qui ne peuvent pas être évaluées uniquement par des tests in vitro. De même le jeûne intermittent a des répercussions dans l’organisme entier qui ne peuvent pas être appréhendées in vitro. Les expériences in vivo permettront de confirmer les résultats obtenus in vitro en intégrant les résultats au sein d’un organisme entier. C’est une étape de vérification indispensable avant l’évaluation chez l’homme. L’utilisation des souris est basée sur : 1/ La maîtrise du modèle de poche à air chez la souris par le laboratoire. 2/ Le modèle animal utilisé est reconnu sur le plan international. 3/ Le modèle utilisé est représentatif de la maladie humaine. 4/ Des découvertes majeures dans la goutte (inflammation déclenchée par les cristaux d’urate) ont été réalisées avec ce modèle. 5/ Des protocoles bien établis sur le jeûne intermittent dans cette espèce montrant des effets bénéfiques Les souris mâles seront utilisées à l’âge adulte entre 2 et 4 mois. Il s’agit de souris adultes pas trop âgées permettant 1/ d’éviter la modulation de la réaction inflammatoire liée au vieillissement et 2/ d’avoir des souris avec un système immunitaire et inflammatoire compétent. Les 4 souris femelles utilisées pour la génération des descendances seront âgées de 2 à 6 mois pour garder les mêmes caractéristiques que les mâles.