Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 11/01/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-160573)
3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par la bactérie de la tuberculose par voie nasale sous anesthésie, et reçoivent vaccins, cellules ou molécules par injections parfois répétées jusqu’à quatre fois. Le porteur indique une pathologie pulmonaire inflammatoire comme principale atteinte, et précise que le cumul des interventions, chacune jugée modérée, conduit à déclarer l’ensemble sévère. L’objectif est d’identifier les sous-populations de lymphocytes qui protègent contre la tuberculose, les animaux infectés étant tués car ils ne peuvent quitter la zone de biosécurité ni être réutilisés.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La tuberculose reste l’une des pathologies les plus mortelles avec près de 2 millions de décès par an. Il existe de nombreuses difficultés pour la diagnostiquer, suivre de façon fiable l’évolution des patients mais aussi et surtout la prévenir par la vaccination ou la traiter par des molécules thérapeutiques. Si l’importance du système immunitaire n’est plus à démontrer dans cette pathologie, la compréhension que nous en avons est encore limitée et n’offre pas les outils pour répondre aux problématiques évoquées plus haut. Exploitant la proximité entre les mécanismes associés à la protection chez l’Homme et la souris, le projet a pour but d’approfondir nos connaissances sur les cellules de l’immunité que sont les lymphocytes T afin d’apporter des éléments de réponses à ces problématiques. Très concrètement, l’objectif du projet est de comprendre quelles sous-populations de lymphocytes T sont associées à une protection dans le cas de l’infection par l’agent de la tuberculose Mycobacterium tuberculosis. Il visera à caractériser ces populations sur le plan phénotypique (les molécules qui les caractérisent), de leur localisation dans les poumons (notamment vis-à-vis des cellules infectées par la bactérie) et également sur le plan de leur propriétés fonctionnelles (les molécules anti-bactériennes qu’elles produisent). Le projet ambitionne également de comprendre si l’on peut favoriser la génération et/ou la persistence de ces sous-populations par des stratégies d’intervention vaccinales ou l’administration de molécules modulant la génération ou la détection de dommages pulmonaires préjudiciables à ces lymphocytes (regroupées sous le terme de thérapies ciblant l’hôte).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Il est attendu du projet un gain de connaissances fondamentales concernant l’identité des sous-populations lymphocytaires T les plus à même de protéger de l’infection. Ces résultats pourront à terme fournir des informations sur des tests à réaliser chez les patients afin de comprendre si leur évolution est favorable ou pas en fonction de l’évolution chez eux de la présence des cellules associées à la protection. Par ailleurs, les résultats obtenus sur les stratégies vaccinales proposées et sur l’efficacité des molécules administrées pour moduler la génération ou la détection des dommages pulmonaires offrira des possibilités translationnelles qui pourront être exploitées dans d’autres projets. Ceci est d’autant plus vrai que la majorité des molécules testées est déjà utilisée en thérapeutique humaine.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les procédures prévues incluent l’induction de la tuberculose chez les souris par administration de la bactérie responsable ainsi que l’administration de vaccins ou de molécules pharmacologiques visant à diminuer l’impact de la pathologie. Chacune de ces interventions peut être classée comme modérée mais l’effet cumulatif dans les procédures nous conduit à déclarer ces dernières sévères. Seront administrées les bactéries responsables de tuberculose (Mycobacterium tuberculosis, Mtb) ou vaccinales (BCG), des cellules immunitaire de type lymphocytes, des molécules permettant soit de détecter les cellules immunitaires, soit d’éliminer des cellules immunitaires soit de moduler la réponse immunitaire. S’agissant des bactéries Mycobacterium tuberculosis et BCG, chacune ne sera administré qu’une fois par voie intranasale (Mycobacterium tuberculosis ou BCG) ou sous-cutanée ou intraveineuse (BCG seulement) et systématiquement sous anesthésie. S’agissant des cellules, elles seront réinjectées une seule fois soit par voie intranasale soit par voie intraveineuse sous anesthésie appropriée. Les molécules administrées seront soit des anticorps ou des molécules pharmacologiques. Certaines seront administrées pendant 10 jours dans l’eau de boisson des souris ou par injection intrapéritonéale sans anesthésie, intranasale ou intraveineuse (sous anesthésie appropriée dans les 2 cas). Il y aura au maximum 3 injections sur une période de 10 jours. Selon les procédures, les animaux recevront au minimum une administration de bactéries et une injection intraveineuse d’anticorps en 3 semaines et au maximum 2 administrations de bactéries (BCG puis Mycobacterium tuberculosis) et jusqu’à 4 injections intraveineuses et/ou intranasale d’anticorps et de molécules pharmacologiques sur une période de 4 à 8 semaines.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les principales nuisances causées aux animaux résideront dans l’induction d’une pathologie pulmonaire liée à la réponse inflammatoire induite par l’infection par la bactérie Mtb. Une autre nuisance à un niveau moindre provient de l’administration intraveineuse ou intranasale de bactéries (BCG ou Mtb), cellules (lymphocytes protecteurs) et/ou molécules pharmacologiques et anticorps, parfois répétées (jusqu’à 4 fois).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort de façon éthique pour 3 raisons. Tout d’abord, étant infectés par un pathogène pour l’homme, ces animaux ne peuvent pas quitter la zootechnie de sécurité biologique ni être réemployés dans de nouvelles procédures. Par ailleurs, si nos procédures prévoient un terme à un temps plutôt précoce après infection et une pathologie peu développée et non mortelle (quelques semaines), le maintien des animaux à des temps longs (plusieurs mois) conduirait à une mort liée à la perte de fonction pulmonaire étant donné que les souris ne peuvent éliminer mais seulement contrôler plus ou moins efficacement le bacille tuberculeux. Enfin, pour notre projet nous devons analyser la totalité des cellules présentes dans les poumons.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Etant donné que les populations de lymphocytes d’intérêt sont assez rares, qu’elles sont pour certaines accessibles seulement dans les poumons et qu’il n’existe aucun modèle cellulaire ni de possibilité de culture ex vivo, nous devons utiliser un système intégré dans lequel la circulation sanguine, la présence de ganglions lymphatiques et les poumons sont nécessaires (ce qui exclue les modèles multicellulaires du type « organoide »). Dans un soucis de Remplacement, nous incorporerons néanmoins chaque fois que cela sera possible des étapes dans des modèles alternatifs. Notamment, une fois établie la diversité des sous-populations lymphocytaires déclenchées par l’infection, nous rechercherons leur caractère protecteur. Cela sera réalisé en exposant des macrophages infectés par la bactérie à ces populations dans des tests cellulaires in vitro. Seules les sous-populations protectrices in vitro seront par la suite testées in vivo en les administrant à des souris infectées.
2. Réduction
Afin de s’inscrire dans la logique de réduction, nous avons intégré 4 étapes dans notre raisonnement. Tout d’abord, certaines expériences réalisées font suite à des étapes de validation dans des modèles cellulaires : ainsi les expériences proposées sont réalisées au stade où les méthodes de remplacement de l’expérimentation animale ont été exploitées et s’avèrent suffisamment prometteuses pour utiliser le modèle intégré murin. Ensuite, certaines étapes de nos projets pourront en effet être suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des promesses offertes par les résultats. De plus, nous avons développé des approches expérimentales permettant d’analyser sur un même lot d’animaux, des paramètres qui étaient avant mesurés sur des lots d’animaux séparés (exemple : préparation d’ARN, cytométrie de flux et charges bactériennes peuvent maintenant être réalisées sur le même échantillon). Finalement, l’expérience des années précédentes nous a fourni des indications sur la taille minimale des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs.
3. Raffinement
Il existe 3 grandes catégories de sources de douleurs et/ou de stress dans nos procédures. La première est l’induction d’une pathologie pulmonaire par administration de la bactérie M.tb. Dans ce cas, notre façon de gérer la douleur se situe à 4 niveaux: la dose, faible; la souche bactérienne, peu virulente; la durée de suivi, très inférieure à la durée léthale chez la souris immunocompétente; le suivi quotidien. La deuxième cause de douleur/stress réside dans le mode d’administration des bactéries, molécules pharmacologiques ou cellules. Nous privilégions les modes d’administration peu on non traumatisants ou douloureux (eau de boisson ou injection intrapéritonéale chaque fois que cela est possible. Dans les autres cas, ces injections seront accompagnées des mesures appropriées (anesthésie/analgésie dans le cas d’administration intranasale ou intraveineuse ou sous-cutanée). La troisème source potentielle de stress/douleur fait référence aux suites de l’administration de vaccins (induisant une réaction inflammatoire) ou de molécules pharmacologiques ou des cellules. Dans la cas des vaccins, nous serons attentifs aux plaies éventuelles sur le site d’injection et à l’état général de l’animal dans les jours suivant l’injection. Pour les molécules pharmacologiques, les substances administrées sont attendues pour avoir des effets bénéfiques sur la pathologie. Toutefois, même si nous injecterons des molécules déjà utilisées chez la souris sans conséquences dommageables et pour lesquelles les doses pharmacologiques sont bien connues, nous exerçerons une surveillance quotidienne. Toutes les souris seront maintenues dans une zootechnie de sécurité biologique. Elles sont logées selon les normes éthiques en vigueur et bénéficient d’un enrichissement pendant la stabulation. Une surveillance quotidienne des animaux et une inspection de leur apparence (posture, pelage) sont effectuées tout au long de l’expérience par des membres du personnel formés. Nous disposons d’un comité chargé du bien-être des animaux sous la supervision d’un vétérinaire, qui assiste les expérimentateurs notamment pour gérer le stress ou la douleur des animaux.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Il existe de nombreux modèles de tuberculose chez l’animal. Du primate non-humain (le modèle le plus proche de l’homme) au poisson zèbre en passant par les rongeurs, chacun avec ses avantages et inconvénients. Nous avons opté pour le modèle de la souris car, en termes d’immunité, il est assez prédictif de ce qui se passe chez l’homme. En termes de pathologie et notamment de lésions pulmonaires, il a été longtemps peu représentatif mais l’identification d’une mutation (SP140) permettant le développement de lésions plus proches de celles de l’homme a largement comblé ce manque (tout en maintenant un statut immunocompétent à l’animal porteur de la mutation). Un avantage supplémentaire est la possibilité de travailler et d’utiliser des outils moléculaires très fins (permettant le suivi de cellules fluorescentes ou la détection de cellules très spécifiques d’antigènes mycobactériens), et ce, dans le même fond génétique (évitant ainsi les facteurs confondants). C’est ainsi que la base de notre projet prévoit d’utiliser les souris C57BL/6 porteuses ou non de la mutation SP140, qui pourront être analysées avec les mêmes outils moléculaires établis, très performants et informatifs tout en présentant des lésions et une sensibilité différentielle à l’infection. Cette possibilité unique n’est accessible dans aucun autre modèle animal.