Impact du microbiote sur le développement tumoral dans des modèles de mélanomes murins spontané ou induit

Le mélanome est un cancer qui se développe initialement au niveau de la peau (mélanome cutané) ou de l’œil (mélanome uvéal). Le mélanome cutané est le cancer dont le taux d’incidence a le plus augmenté entre 2010 et 2018 (+3,4 %). La mortalité due à ce cancer diminue notamment grâce à des avancées thérapeutiques importantes au cours de la dernière décennie. En effet, les immunothérapies permettant de renforcer l’action anti-tumorale des lymphocytes T constituent la première ligne de traitement du mélanome en France. Cependant 60% des patients résistent à ces traitements. Nous étudions une protéine qui pourrait jouer un rôle majeur dans cette résistance. Notre hypothèse est que cette protéine, surexprimée dans le microenvironnement tumoral, élimine des bactéries indispensables pour la réponse au traitement. Nous proposons d’identifier ces bactéries, puis d’évaluer si ces dernières potentialisent l’efficacité de l’immunothérapie. Alternativement, nous évaluerons l’efficacité thérapeutique d’un inhibiteur de notre protéine d’intérêt. L’objectif fondamental de ce projet est de déterminer l’impact de ces traitements sur les cellules immunitaires au site de la tumeur.

Nous avons mis en évidence le rôle d’une protéine dans l’agressivité du mélanome. Ce projet permettra de mieux comprendre le mécanisme d’action de cette protéine. Compte tenu d’une part de sa capacité à lyser des bactéries in vitro et d’autre part de sa surexpression lors du développement du mélanome, cette protéine pourrait modifier in vivo la composition des bactéries aux niveaux de l’intestin mais aussi de la peau, site du développement tumoral. Nous émettons l’hypothèse que le retard du développement tumoral chez les souris dont l’expression de cette protéine a été inactivée est dû à la présence de bactéries anti-tumorales et que ces bactéries sont spécifiquement éliminées chez des souris exprimant notre protéine d’intérêt. Nous déterminerons quel est l’impact de telles bactéries sur le développement tumoral et la mise en place d’une réponse immunitaire dans un modèle de mélanome induit par transplantation et dans un modèle de mélanome spontané. Nous déterminerons si ces bactéries anti-tumorales ou un inhibiteur de notre protéine d’intérêt augmentent l’efficacité d’un traitement par immunothérapie. Des essais cliniques récents supportent que des patients atteints de mélanome métastatique, initialement réfractaires à une immunothérapie, répondent au traitement après avoir reçu une transplantation des selles de malades répondeurs à ce traitement. A terme, nos travaux pourraient permettre de proposer deux nouvelles stratégies pour traiter le mélanome cutané chez l’homme. Une première stratégie consisterai à modifier la composition des bactéries, non plus de façon systémique, mais au niveau cutané. Alternativement, nous proposer d’associer à l’immunothérapie de référence un inhibiteur de notre protéine d’intérêt.

Prélèvement sur souris vigiles de 15-20 jours de bactéries cutanées par écouvillon et de fèces. Rasage des souris (5 minutes par souris), un jour avant l’injection en sous-cutanée des cellules de mélanome. Injection en sous-cutanée (estimation 5 minutes) ou en intra-veineuse (estimation 6 minutes) de cellules de mélanome. Ceci n’est réalisé qu’une fois par souris. Cinq mesures des tumeurs avec un pied à coulisse suite à la transplantation de cellules de mélanome en sous-cutanée. Cela prend environ 5 minutes par souris maintenues en contention. Gavage oral (5 minutes par souris) tous les 3 jours avec des fèces chez des souris avec un mélanome transplanté. Le gavage sera réalisé maximum 6 fois par souris. Application topique avec une pipette de bactéries sur la peau rasée de souris sous anesthésie. 5 dépots de bactéries sont prévus par souris. L’intervention durera le temps de pénétration des bactéries dans la peau puis le temps de réveil. Cela est estimé à 30 minutes par souris. Plusieurs souris seront traitées simultanément. Administration intra-péritonéale (estimation 3 minutes par souris) d’une immunothérapie tous les 5 jours à partir de J14 et gavage oral (estimation 5 minutes par souris) avec des bactéries tous les 4 jours à partir de J15 dans le modèle de mélanome spontané. Au total 10 injections de l’immunothérapie et 11 gavages par des bactéries sont prévus par souris. Gavage oral bi-quotidien (5 minutes par souris) avec un inhibiteur de notre protéine d’intérêt (100µl) pendant 26 jours. Au total 52 gavages par souris.

Les injections sous-cutanées, intra-veineuses, intra-péritonéales et par gavage oral peuvent occasionner stress et douleurs lorsque celles-ci sont pratiquées aux animaux. Le dépôt de bactéries sur la peau n’engendre pas de douleur. La croissance tumorale, spontanée ou induite par la transplantation des cellules de mélanome, peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs. Enfin la manipulation pour collecter les fèces chez des souris avant sevrage ou encore mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peut également induire un stress chez les animaux. La transplantation de cellules tumorales en intra-veineuse peut induire une perte de poids des animaux.

Les males reproducteurs seront tous mis à mort à l’atteinte des points limites. Tous les autres animaux seront mis à mort pour prélever des organes lymphoides secondaires (rate et ganglions) et des tumeurs primaires et des métastases.

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la réponse immunitaire anti-tumorale, de nombreuses voies étant conservées entre la souris et l’homme. En particulier, le modèle de mélanome spontané est relevant cliniquement par rapport à la pathologie humaine. Nos données préliminaires de co-hébergement de souris,contrôles ou déficientes pour la protéine qui nous intéresse, montrent le rôle du microbiote sur la progression tumorale ce qui justifie d’identifier des bactéries pro- et anti-tumorales chez ces souris. Dans notre modèle comme chez l’homme, le traitement de référence utilisé en clinique pour traiter le mélanome cutané métastatique n’est que partiellement efficace. Nous espérons améliorer son efficacité soit en modifiant simultanément les bactéries présentes aux niveaux intestinal ou cutané, soit en l’associant un inhibiteur de notre protéine d’intérêt. Les souris contrôles et déficientes pour la portéine qui nous intéresse auront entre 6 et 10 semaines au moment de la transplantation tumorale car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral et l’effet de la modulation du microbiote sur celui-ci. Les souris transgéniques que nous utilisons développent un mélanome primaire vers l’âge de 3 semaines qui métastase au niveau cutané vers 4 à 5 semaines. Les fèces seront donc prélevés sur des animaux de 15 à 20 jours, un peu avant la détection macroscopique de la tumeur primaire, dans la mesure où le microbiote influence très tôt le développement tumoral. Ces souris seront également traitées dès J14 pour étudier l’effet de la modulation du microbiote et de l’immunothérapie sur le développement tumoral. Finalement, elles seront traitées avec l’inhibiteur de notre enzyme associé ou non à l’immunothérapie soit à J14 soit à J60 pour étudier l’effet sur le développement tumoral dans des conditions prophylactique et thérapeutique.