Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 13/01/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-894329)
472 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie menée sous anesthésie sans réveil. Les souris désignées comme « donneuses » sont tuées lors d’un prélèvement de sang terminal, les « receveuses » reçoivent des transfusions de plaquettes hebdomadaires puis subissent une chirurgie abdominale sans réveil pour observer leur rate au microscope. L’étude cherche à comprendre le rejet des plaquettes transfusées chez les patients sous chimiothérapie. Le porteur affirme que ces observations dynamiques « ne peuvent se faire que sur modèle animal » et ne sont pas modélisables in vitro.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La prise en charge des patients sous chimiothérapie aplasiante nécessite un support transfusionnel plaquettaire important et itératif. Une des complications graves de ces transfusions multiples est l’état réfractaire aux transfusions plaquettaires (ERTP), c’est-à-dire le rejet des plaquettes transfusées par le receveur. La transfusion est alors inefficace et ne permet pas de prévenir les risques hémorragiques. Ce rejet est expliqué par la présence, chez le receveur, d’anticorps spécifiques qui entrainent l’élimination rapide des plaquettes transfusées. Le mode d’action de ces anticorps conduisant à l’élimination des plaquettes n’est pas bien compris. Nous proposons d’étudier les mécanismes d’élimination des plaquettes in vivo avec l’utilisation d’un modèle murin d’état réfractaire aux transfusions plaquettaires. Nous étudierons finement les mécanismes moléculaires mis en jeu grâce à l’utilisation de souris transgéniques expriment des protéines humaines qui pourraient être impliquées dans ces réponses. Nous souhaitons caractériser, grâce à l’utilisation d’un microscope permettant les observations intra-vitales, les interactions entre les plaquettes transfusées et la rate du receveur dans une situation d’état réfractaire aux transfusions plaquettaires.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les patients qui nécessitent un support transfusionnel important et itératif, notamment ceux sous chimiothérapie, sont susceptibles de développer un état réfractaire aux transfusions plaquettaires. Des anticorps produits par le receveur peuvent mener à l’élimination des plaquettes nouvellement transfusées entrainant ainsi une inefficacité thérapeutique de la transfusion. Identifier les mécanismes sous jacents de cette réponse immunitaire pourrait permettre de faire évoluer la prise en charge des patients nécessitant un support transfusionnel important. En effet, déterminer la cinétique et l’organe dans lequel les plaquettes sont éliminées nous apporterait des éléments de réponses quant aux mécanismes impliquées et nous permettrait ainsi de réfléchir à des nouvelles stratégies thérapeutiques pour éviter les etats réfractaires aux transfusions. Ceci permettrait une meilleure prise en charge des patients limitant ainsi les coups d’hospitalisation, la consommation des produits sanguins labiles et la surmortalité induit par les états réfractaires.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Aucun prélèvement ne sera fait sur animal vigile. Prélèvement artériel : prélèvement terminal (dure moins de 5 minutes) Prélèvement sanguin au niveau de la queue (prélèvements hebdomadaires pendant 5 semaines consécutives ; prélèvement dure moins d’une minute Transfusion en intra-veineux hebdomadaire pendant trois semaines consécutives, Procédure chirurgicale (pose d’une chambre d’observation abdominale) (procédure terminale sans réveil, durée de l’observation 30 minutes)
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Possible douleur suite à la transfusion en i.v., durée estimée à 1h post-injection. Les sites d’injections seront particulièrement observés pendant le suivi quotidien des animaux. Possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse pour le prélèvement à la queue, durée de 30 secondes avant endormissement Possible difficulté de mobilité/engourdissement au réveil de l’anesthésie gazeuse, durée estimée à 3-5min
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les souris « donneuses » sont par définition toutes mises à mort après le prélèvement sanguin car ce prélèvement artériel est terminal. Tous les animaux prévus dans la procédure d’alloimmunisation (souris receveuses) sont gardés en vie car utilisées dans les autres procédures. Après les expériences de microscopie intra vitale, tous les animaux sont mis à mort car c’est une procédure chirurgicale sans réveil (une fois la rate exposée et la chambre d’observation en place, on ne peut pas réveiller l’animal).
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le but de ce projet est de déterminer les mécanismes d’élimination des plaquettes transfusées. L’approche en temps réel sur l’élimination des plaquettes sanguines par la rate et/ou le foie et dans le sang ne peut se faire que sur modèle animaux afin d’observer des processus dynamiques entre le sang et ces organes. Ces approches de cytométrie en flux et de microscopie intravitale nécessitent un modèle in vivo et ne peut pas être modélisée par des techniques in vitro.
2. Réduction
Les nombres d’animaux utilisés lors des expériences seront minimalisés, avec la contrainte d’obtenir des observations suffisamment représentatives. Des tests sur des tissus fixés ont eu lieu dans un premier temps pour mettre au point les conditions expérimentales optimales de visualisation des plaquettes (cinétique, quantité de plaquettes, optimisation des marquages,) ce qui nous a permis de réduire au minimum le nombre d’animaux requis pour les observations in vivo.
3. Raffinement
Un soin particulier sera apporté afin de diminuer le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet : – Hébergement dans des cages munies de particules de bois et enrichie avec un carré en coton compressé afin depermettre aux animaux de réaliser un nid conformément à leurs besoins comportementaux – Installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie et pendant toute la durée d’observation sous le microscope. – Anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés. – Injection d’analgésique avant chaque procédure. – Mise en place d’une fiche de suivi pour suivre l’état des animaux et veiller à leur bien être tout au long de l’expérimentation. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Puisque nous souhaitons mimer la différence génétique entre un donneur et un receveur, nous devons travailler avec des animaux de fond génétique différent. La consanguinité des souris et la bonne connaissance de leur système immunitaire en font un modèle de choix. Nous avons donc choisi deux lignées de souris bien caractérisées : les souris « donneuses » seront de fond génétique C57Bl6 et le souris « receveuses » de fond génétique BALB/c. De plus, nous souhaitons éudier l’importance d’un récepteur exprimé par les plaquettes des souris « donneuses », nous utilisons donc des souris C57Bl6 modifiées génétiquement qui expriment ce récepteur ou d’autres souris qui expriment une protéine fluorescente pour pouvoir les visualiser quand elles sont transfusées dans la souris receveuse. Enfin, un microscope dédié aux observations intravitales sera utilisé sur le modèle murin. La taille de la souris est compatible et adaptée à l’équipement ce qui rend ce modèle totalement pertinent. Les animaux seront utilisés au stade adulte, pubère, agé de 8 à 25 semaines afin d’avoir un système immunitaire mature.