Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 16/01/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-207746)
612 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Selon les modèles, elles reçoivent des greffes de mélanome ou de tumeurs mammaires, ou subissent deux irradiations corporelles suivies d’une greffe de moelle osseuse, avec injections et prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer douleur, perte de poids et gêne à la mobilité, d’intensité croissante au fil de la procédure. Les retombées annoncées contre le vieillissement immunitaire et le cancer restent présentées comme une « preuve de concept » à moyen terme, l’objectif immédiat étant de tester une protéine censée régénérer le thymus.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Notre projet de recherche porte sur la régulation du développement des lymphocytes T (LT), acteurs clés du système immunitaire. Ces cellules se développent au sein du thymus, hébergeant la production et sélection appropriée des LT. Or, le thymus est un organe extrêmement sensible aux perturbations de la physiologie telles que les thérapies cyto-réductrices précédant une greffe de moelle osseuse ou le vieillissement. En effet, dans ces contextes physiopathologiques, cet organe subit une réduction drastique en taille et en fonctionnalité. Ce processus appelé « involution thymique » résulte en une diminution de la production de nouveau LT, réduisant ainsi fortement le renouvellement des LT de l’organisme. Par ailleurs, l’utilisation de thérapies cyto-réductrices chez des individus âgés aggrave l’involution lié à l’âge, réduisant ainsi de façon additive le renouvellement des LT. L’involution thymique résulte en une susceptibilité accrue notamment aux cancers, ainsi qu’aux rechutes tumorales dans le cas de thérapies cyto-réductrices et greffe de moelle osseuse chez des patients atteints de leucémies. Dans le cas de cancer et leucémies, le succès de la thérapie par blocage des points de contrôle immunitaire (ICBT) repose sur un large répertoire de lymphocytes T capable de reconnaître spécifiquement les cellules cancéreuses. Bien que ces traitements aient récemment amélioré les chances de survie des patients atteints de différents types de cancer, une grande partie des patients ne répondent pas en raison d’un répertoire de LT sous-optimal. L’appauvrissement et la senescence progressive de LT de l’organisme résultant de l’involution thymique contribue à ces réponses de moindre qualité. De manière intéressante, notre équipe a identifié que l’administration de la protéine X promeut la régénération du thymus et la production des LT au cours des thérapies cyto-réductrices et de l’involution associée à l’âge. Ainsi, l’objectif de notre projet est d’apporter la preuve du concept que la régénération thymique médiée par X renforce l’immunité des cellules T antitumorales et augmente l’efficacité des thérapies par blocage des points de contrôle immunitaire.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Du fait du vieillissement progressif de la population et de l’augmentation de l’espérance de vie, l’immunodéficience liée à l’âge qui est étroitement corrélée avec le processus d’involution thymique, devient une préoccupation de santé publique majeur. Notamment, de nombreuses études révèlent un lien étroit entre le vieillissement et là l’incidence des cancers. Ainsi, notre projet est susceptible d’avoir des retombées majeures dans la compréhension et la lutte contre le vieillissement immunitaire. A moyen terme, notre étude apportera la preuve de concept que le boost de la production de LT médié par la régénération thymique, et ainsi le renouvellement des LT périphériques, confère une protection supérieure contre le développement de tumeurs. De plus, notre approche de combinaison de la régénération thymique avec les ICBT devrait potentialiser l’efficacité de ces molécules thérapeutiques et ainsi améliorer plus fortement les réponses anti-tumorales dans les contextes d’hémopathies malignes et de tumeurs solides. Par ailleurs, notre étude pourrait à plus long terme permettre de définir des biomarqueurs du vieillissement immunitaire et améliorer la prise en charge des patients de façon ciblée. Ainsi, nous nous attendons à ce que les sujets répondant le moins aux ICBT soient les patients avec une immunosénescence prononcée pouvant nécessiter une régénération du développement des LT. Il est également envisageable à plus long terme que notre projet participe au développement des thérapies promouvant le vieillissement en bonne santé en corrigeant les défauts fonctionnels des processus biologiques liés à l’âge.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Pour les tumeurs solides (mélanomes et tumeurs mammaires), les souris (au nombre de 432) recevront la protéine X ou la protéine contrôle par injection intraveineuse sous anesthésie générale légère, 3 injections par animal sur 3 jours consécutifs. Trois semaines plus tard, les animaux recevront des cellules tumorales par injection intradermique (mélanomes) ou intra-mammaire (tumeurs mammaires) sous anesthésie générale légère (2 injections simultanées par animal, pour une intervention d’environ 3 minutes par animal). Les tumeurs seront mesurées tous les 2 jours de j8 à j20 sous anesthésie générale légère (2 minutes par animal). Pour les lymphomes, les souris (au nombre de 144) seront soumises à deux irradiations corporelles de 4minutes30 (5Gray) à 12heures d’intervalle, suivi d’une greffe de moelle osseuse (injection de cellules par voie intraveineuse sous anesthésie générale légère durant 2 minutes par animal). Les animaux recevront la protéine X ou la protéine contrôle par injection intraveineuse sous anesthésie générale légère, 3 injections par animal aux jours 2,4 et 6 après la greffe. Trois semaines après greffe, les animaux recevront une injection intraveineuse de cellules de lymphome sous anesthésie générale légère durant 2 minutes par animal. A partir du 10eme jour après l’injection des cellules de lymphome, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang sous anesthésie générale légère à la fréquence d’un prélèvement tous les 3 jours avec un maximum de 4 prélèvements. Dans les 3 procédures, la moitié des animaux recevra un traitement anti-tumoral (immunothérapie) et l’autre moitié un traitement contrôle (placebo) par injection intrapéritonéale (4 injections par animal avec 3 jours d’intervalle entre les injections)
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les nuisances possibles sont : – un stress lié à la manipulation et à la procédure d’irradiation. – une douleur lié aux injections (rétro-orbitales, intra-dermiques, intra-péritonéale) ainsi que aux prélevements sanguins mandibulaires. – une perte de poids, une gêne à la mobilité et/ou une douleur liées à la croissance tumorale et à la réponse immunitaire déclanchée. La probabilité d’apparition de ces nuisances et leur intensité sont susceptibles d’augmenter progressivement au cours de la procédure et devront être contrôlés.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront mis à mort pour analyse.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
A ce jour, aucune alternative non animale permet d’étudier l’effet de la régénération du thymus par le traitement RANKL en contexte de cancer. Notre projet nécessite une approche in vivo afin de mettre en relation les différentes composantes cellulaires et tissulaires impliquées dans la réponse anti-tumorale étudiée. En effet, une alternative ex vivo serait de cultiver des lymphocytes T purifiés de souris jeunes ou âgées (traitées ou non avec RANKL) en présence de cellules tumorales et d’étudier l’efficacité de ces cellules. Ceci sera réalisé au cours du projet. Toutefois, cette approche limitée ne récapitule pas l’organisation tumorale complexe observée in vivo, la capacité des lymphocytes T à être recrutées au site tumoral, à interagir avec le microenvironnement et les autres cellules immunitaires, à ralentir la croissance tumorale et à stopper la pousse tumorale. Par ailleurs, l’approche ex vivo à court terme ne permet pas de tester l’efficacité des thérapies anti-tumorales qui agissent sur les interactions entre lymphocytes T et cellules immunitaires et tumorales. Ainsi, le modèle murin, qui présente l’avantage d’avoir une physiopathologie proche de l’homme, permettra d’étudier avec le plus de précision possible les différents points de notre projet, à savoir la régénération des lymphocytes T par notre traitement, leur circulation dans l’animal, leur recrutement au site tumoral et leur mode d’action au sein du microenvironnement tumoral.
2. Réduction
Le choix du nombre de souris est réalisé en prenant en considération les variabilités inter-individuelles, de réponse au traitement, ainsi que de pousse des tumeurs. Ce choix vise également à réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Ainsi, des cohortes de 4 animaux par groupes seront utilisées pour le suivi de croissance tumorale et des cohortes de 3 animaux pour les analyses en points intermédiaires, avec un total de trois expériences indépendantes dans les deux cas. D’après la littérature et notre expérience passée, un nombre de 10 à 12 animaux par groupe (en tenant compte de la mortalité précoce) devrait fournir des résultats suffisamment robustes et interprétables. Afin de réduire le nombre de souris contrôles utilisées, un maximum de groupes différents seront constitués lors d’une même expérience. La même démarche sera suivie pour les analyses en point intermédiaire et en point final. Afin d’éviter les biais expérimentaux, les animaux seront randomisés en aveugle dans les différents groupes de traitement par un expérimentateur tiers. Par ailleurs, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, des tests fonctionnels in vitro seront menés sur des cellules isolées des mêmes tumeurs que celles analysées pour la composition de l’infiltrat immunitaire des tumeurs. Après la première expérience, le nombre d’animaux à utiliser sera ajusté en utilisant un logiciel (gpower) afin d’estimer le nombre nécessaire permettant une analyse statistique robuste.
3. Raffinement
Afin de réduire les nuisances, plusieurs mesures seront prises. Concernant le stress, les souris seront manipulées par un seul expérimentateur sauf pour l’étape de randomisation des groupes. Les animaux seront soumis à une anesthésiés générale légère par inhalation d’isoflurane avant chaque injection et mesure du volume tumoral. Les animaux bénéficieront par ailleurs d’une surveillance accrue quotidienne dès le début de la procédure expérimentale afin d’identifier tout signe de gène ou de douleur à l’aide d’une grille d’évaluation. De plus, le poids des animaux sera mesuré tous les deux jours, avec une surveillance accrue dès l’identification d’une perte de poids et un point limite de perte de poids de 20% du poids maximal. En cas de gène de mouvement pouvant générer un défaut d’alimentation ou de perte de poids importante, une alimentation hydratée spécifique sera déposée dans le fond de la cage. Les signes de douleurs seront évalués avec précision selon la grille d’évaluation, et des analgésiques seront administrés à l’apparition de signes de douleurs. Dans le cas des tumeurs solides, l’apparition de signes d’ulcération constituent un point limite. Un autre point limite sera le volume tumorale (répartis entre les deux tumeurs injectées par animal).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est le modèle de bases des divers projets de l’équipe, adapté à l’analyse du système immunitaire et à l’oncologie. Les souris seront de fond génétique C57Bl6/J sauf pour le modèle 4T1 qui se développe chez des souris de fond génétique Balb/c. Deux âges sont prévus (cf. procédures): – stade pre-involution thymique : souris âgées de 6 à 8 semaines d’âge – stade avancée d’involution thymique : souris âgées de 12 mois.