Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 02/02/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-255825)
1 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues d’une lignée qui devient aveugle par dégénérescence de la rétine, elles sont exposées à une lumière bleue jusqu’à huit heures par jour pendant une à quatre semaines et soumises à un test de préférence entre compartiment éclairé et compartiment sombre, pour étudier la photophobie. Le porteur indique que les souris adoptent un comportement de fuite face à la lumière bleue, et qu’elles sont mises à mort pour prélever la rétine et des structures cérébrales. Il affirme qu’aucune alternative in vitro ni in silico ne peut reproduire la complexité des circuits neuronaux en jeu.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les rétinopathies pigmentaires affectent environ 1,5 million de personnes dans le monde et se traduisent par une diminution progressive de la vue aboutissant à la cécité. Les patients perdent les bâtonnets puis les cônes dans un second temps avec l’apparition fréquente d’une photophobie. L’exposition chronique à la lumière artificielle de type LEDs pourrait jouer un rôle délétère dans l’épidémiologie et l’évolution des symptômes de la photophobie. Les cellules ganglionnaires rétiniennes photosensibles (ipRGCs) seraient capables de transmettre l’information douleureuse avec le complexe trigéminé via le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP). Bien que la découverte des cellules ganglionnaires rétiniennes semble aider à la compréhension de la photophobie, les mécanismes physiopathologiques de la photophobie liée à la rétinopathie pigmentaire restent encore de nos jours largement méconnus. Nous proposons donc dans ce projet d’élucider par quels mécanismes ce peptide lié au gène de la calcitonine et les cellules ganglionnaires rétiniennes photosensibles participeraient à la photophobie associée à une rétinopathie pigmentaire. Ainsi, nous proposons de combiner des études anatomiques et comportementales d’exposition des souris mâles à diverses bandes spectrales afin mieux comprendre ces mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans la photophobie liée à une dégénérescence rétinienne et d’évaluer la participation du peptide lié au gène de la calcitonine et des cellules ganglionnaires rétiniennes. Ces résultats pourraient conduire au développement de nouvelles évaluations d’étude de la prise en charge thérapeutique de la photophobie.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet a pour but d’élucider par quels mécanismes le peptide lié au gène de la calcitonie et des cellules ganglionnaires rétiniennes participerait à la photophobie associée à une dégénérescence de la rétine. Pour ce faire nous disposerons d’un modèle murin qui développe naturellement une cécité par la perte progressive des cellules dela rétine, que l’on comparera à un modèle sain. Nous souhaitons montrer que ces animaux pathologiques présentent 1/un comportement aversif lorsqu’ils sont exposés à une lumière bleue. 2/ Quel(s) rôle(s) le peptide lié au gène de la calcitonie et les cellules ganglionnaires rétiniennes joue dans la réponse à l’exposition à une lumière bleue et 3/ mettre en évidence comment le le peptide lié au gène de la calcitonine et les cellules ganglionnaires rétiniennes modulent des marqueurs d’activation et souffrance neuronales ainsi que des marqueurs d’inflammation chez la souris aveugle. En retraçant les différentes voies impliquées dans la photophobie depuis la rétine jusqu’au cerveau, nous espérons ainsi pouvoir non seulement mieux comprendre et décrire ce phénomène pathologique mais également identifier de potentiels marqueurs/voies à visée thérapeutique pour la prise en charge de la photophobie.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Dans le cadre de ce projet les animaux développant la pathologie de dégénérescence rétinienne ou leur contrôle seront exposés à différentes conditions de lumière (jaune ou bleu) durant des périodes de 8h/jour durant 7 jours (exposition aigue) ou 28 jours (exposition chronique). Certains groupes seront injectés avec différentes molécules/agents par injection intra-péritonéale sur animal vigile : 3 fois pour les groupes « exposition aiguë » (J5 à J7) ou 3 x 3 jours pour les groupes « exposition chronique » (de J5 à J7, de J12 à J14, de J19 à J21) Les animaux seront ensuite euthanasiés pour réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Exposition à la lumière bleue : Les souris pathologique et sauvage devront être exposées individuellement à la source lumineuse afin d’éviter toute interaction avec leur congénaires. Elles adoptent un comportement d’isolation/fuite face à la lumière bleue. L’injection des antagonistes et anesthésiques sera réalisée en intraperitoénale et l’analgésique en sous cutannée, cela induira une douleur mineure au niveau du site d’injection.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront analgésiés et anesthésiés puis euthanasiés en fin d’expérimentation comportementale afin de récolter les différents tissus qui serviront aux études neuroanatomiques et de biologie moléculaire.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
À l’heure actuelle, ce projet nécessite l’utilisation d’animaux car aucune alternative in vitro ne peut 1) mimer la pathologie de dégénérescence rétinienne et la photophobie qui lui est liée. 2) la complexité et l’intéraction des circuits neuronaux mis en jeu (rétine, ganglions trigéminés et système nerveux central) ne peuvent être étudiées et remplacées par un modèle in vitro. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de la photophobie chez l’Homme, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à l’aide d’un modèle experimental realisé sur les rongeurs (souris). De plus, une veille bibliographique réalisée confirme qu’à l’heure actuelle, aucun model in silico n’existe pour répondre à ces questions.
2. Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, notre étude étude sera longitudinale et utilisera plusieurs structures (rétine, ganglions trigéminés, tronc cérébrale, hypothalamus) de chaque animal soit les 1280 animaux compris dans cette étude. Nous avons également estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace grâce aux données des résultats obtenus dans une étude précédente. Le nombre d’animaux sera gardé le plus petit possible tenant compte de 1/ la variabilité préssentie des résultats expérimentaux et 2/ de la nécessité de valider statistiquement les résultats obtenus afin de les publier dans des journaux scientifiques. Pour chaque étude et test réalisés, nous comparerons statistiquement les lots de souris de taille raisonable entre eux.
3. Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. L’hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignés de souris. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : enrichissement dans les cages (maison, tube en carton) et maintien des animaux en groupe de 5 congénères afin d’éviter le stress de l’isolement. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La température de la zone d’hébergement est maintenue à 21°C et suit un cycle d’éclairage non inversé (12h /12h). Les animaux seront observés et manipulés quotidiennement afin de minimiser le stress et la douleur, qui seront évalués à l’aide de points limites validés en concertation avec les responsables de l’animalerie. Toute observation anormale sera notée et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie, nous permettant de modifier la procédure en cours en procédant à l’euthanasie de l’animal. Pour les sessions d’illuminations, afin de minimiser le stress et la variabilité lors du test de boite illuminée/noir les animaux suivront une session d’habituation au test durant 5 jours avant le début de l’exposition à la lumière bleue ou jaune. L’animal aura libre accès à l’ensemble du complexe dans une période de 5 minutes, c’est-à-dire les deux compartiments (illuminé ou sombre) et le couloir central reliant les deux compartiements. Dans sa globalité le projet ne présente pas de gestes très invasifs, seulement une injection en i.p pour l’administration des traitements (antagonistes) et l’analgésie/anesthésie en sous cutanné avec une douleur minime ressentie au site d’injection. Enfin les points limites suivant seront suivis de près afin de déterminer l’état général de l’animal et des traitements/mesures à appliquer : Apparence physique, comportement, changement du poids corporel.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souche Rd1 est un choix privilégié car ces souris développent naturellement une cécité par la perte progressive de leurs photorécepteurs, ce qui fait de cette souche un modèle parfait pour mimer la pathologie de rétinodégénérescence avec photophobie induite. La souche Rd1 étant naturellement mutante, nous somme contraint de la comparer à une souche sauvage comme les souris C57BL/6. De plus, le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l’animal de choix car (1) elle possède les structures oculaires et cérébrales adéquates, (2) nous avons accès à tous les outils génétiques requis. Les deux souches de souris seront utilisées aux stades de développement à 30 et 90 jours car les souris pathologiques Rd1 sont complètement aveugles à 90 jours et nous souhaitons voir l’effet du vieillissement dans la réponse aux traitements effectués.