Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 14/02/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-576109)
195 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour porter le récepteur humain du SARS-CoV-2 dans le muscle, elles sont infectées par injection intramusculaire, gavées de tamoxifène cinq jours, saignées tous les deux jours et soumises pendant six mois à des tests d’effort, grip test, tapis roulant et actimétrie. Le porteur n’attend pas de dommage musculaire important, seulement une fatigue, et reconnaît devoir d’abord mettre au point cette infection encore jamais tentée. Il indique compléter par de la culture cellulaire mais juge la souris nécessaire, le modèle devant aussi servir « l’industrie pharmaceutique » pour d’autres projets sur la COVID.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Si la grande majorité des malades infectés par le SRAS-CoV-2 se remettent de cette infection (98,7% au 09 mars 2022, https://COVID19.who.int/) ; certains d’entre eux continuent à présenter des symptômes, parfois des mois après leur guérison. Ce type de manifestations cliniques, qualifié de syndrome post-COVID (PCS), concerne 30 à 60% des malades, principalement des femmes. Le PCS touche plusieurs organes et demande une surveillance et un suivi à long terme des patients, ce qui en fait aujourd’hui un véritable problème de santé publique. Parmi les principaux symptômes observés, on note en troisième position les troubles musculo-squelettiques. Les exercices physiques permettent parfois de réduire ces symptômes suggérant une atteinte directe du muscle. Cependant, à notre connaissance, il n’existe aucune étude sur les effets à long terme de la COVID-19 sur le tissu musculaire. Depuis 2020, la littérature scientifique atteste de la pertinence et de l’intérêt des modèles rongeurs pour l’étude de l’infection par le SRAS-CoV-2 et de la physiopathologie de la COVID-19. Un modèle de souris transgénique HSACreERT2: ACE2(GFP)hACE2 a été développé exprimant le récepteur humain du SRAS-CoV-2, l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (hACE2), uniquement au niveau du tissu musculaire. Nous proposons de l’utiliser pour (i) caractériser l’infection du tissu musculaire par le SRAS-CoV-2 et (ii) comprendre les bases moléculaires de la physiopathologie musculaire de la COVID-19.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les résultats obtenus permettront d’établir une cartographie détaillée des conséquences fonctionnelles et physiopathologiques de l’infection du tissu musculaire par le SRAS-CoV-2. Cette étude jamais réalisée jusqu’à présent permettra de mieux comprendre les symptômes musculaires observés chez les patients COVID Long. Le développement de thérapies ciblées et la prise en charge adaptée des patients pourraient bénéficier de ces observations inédites. Si aucun effet n’est observé à la suite de l’infection directe du muscle, cela apportera néanmoins un élément de réponse à la compréhension du phénotype musculaire dans le cas des patients de COVID Long. Nous pourrons dans ce cas envisager d’orienter nos investigations futures vers le réseau vasculaire ou le système inflammatoire. De plus, notre modèle restera tout de même un outil important pour la communauté scientifique et l’industrie pharmaceutique dans le cadre d’autres projets sur les formes aigues ou persistantes de la COVID.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Pour la réalisation des infections virales, les animaux seront anesthésiés sous isofluorane (induction 4%; maintien 2%) et soumis à des injections intramusculaires du SARS-CoV-2. L’intervention sera faite une seule fois par souris et la durée de l’intervention est de 10 minutes (après endormissement des animaux). Le prélèvement du sang tous les deux jours sera fait sous anesthésie à l’isoflurane. La durée de la prise de sang sera d’environ 30 secondes. Pour réaliser les manipulations, le tamoxifène est administré par gavage pendant 5 jours à la concentration finale de 85 mg/kg de poids corporel. La séance de gavage dure environ 2 minutes pour chaque souris avec une fréquence d’une fois par jour pendant 5 jours. Les études functionelles seront realisées une fois par mois pendant 6 mois. La durée du grip test sera de 30 secondes et la durée de la séance du tapis roulant sera de 20 minutes. Pour finir, l’activité de déplacement mesuré par l’Activmètre aura une durée d’acquisition réglée sur 24/48 heures pour quantifier l’activité tout au long du cycle circadien.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Le projet porte sur l’infection du tissu musculaire par le SRAS-CoV-2. En raison de l’absence de données préalables, il est nécessaire de mettre au point l’infection expérimentale. Cette étape repose sur notre grande expérience des injections intramusculaires et de la virologie du SRAS-CoV-2. Toutefois, il n’est pas attendu de dommages musculaires importants chez la souris. En effet, seule de la fatigue musculaire est signalée chez les patients COVID Long et un phénotype similaire devrait être observé chez la souris infectée.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux sont mis à mort pour les prélevements prévus dans chaque procédure.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Notre projet s’intéresse à l’étude des processus biologiques associés aux interactions entre le virus SRAS-CoV-2 et les cellules ou tissus de l’hôte et de leur évolution au cours du temps (6 mois). De fait, l’analyse de ces interactions au sein d’un organisme, où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication, nécessite des observations chez l’animal et ne peut être substituée qu’en partie par des études in vitro. Des résultats préliminaires ont montré que les cellules musculaires humaines sont susceptibles à l’infection par le SRAS-CoV-2. De plus, nous avons démontré que le récepteur ACE2 est exprimé au niveau du tissu musculaire. La culture cellulaire restera un outil que nous utiliserons au cours de ce projet pour des tests préliminaires et complémentaires à l’utilisation des souris.
2. Réduction
Dans le but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation excessive d’animaux, le nombre d’animaux par groupe a été calculé sur la base de protocoles publiés et de l’expérience acquise précédemment. Un des enjeux est de pouvoir obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses prévues. Ce nombre de souris n’a pas été défini à l’aide de méthodes statistique mais est basé sur notre expérience dans l’obtention de différent matériel biologique pour chaque technique. Les conditions expérimentales de l’infection sont établies sur la base d’une approche par escalade de doses. Cinq souris par condition seront utilisées pour des analyses histologiques et virologiques. La sensibilité de ces techniques est importante et l’effet attendu est fort, ce qui permet de limiter le nombre d’individus. Pour les autres expériences, la sensibilité attendue est moindre, obligeant à augmenter la taille des groupes à 10 individus pour les analyses fonctionnelles. Afin de respecter la règle des 3R, les animaux seront utilisés pour plusieurs études (par exemple, analyses fonctionnelles et investigation de la physiopathologie de l’infection musculaire) et, quand cela est possible, un même tissu sera exploité pour différentes analyses (par exemple, un même muscle pour les analyses histologiques et les analyses moléculaires) dans le but de réduire au maximum le nombre des animaux. Des tests statistiques seront mis en œuvre.
3. Raffinement
Pour minimiser le stress induit aux animaux, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%, maintien 2%) avant inoculation intra-musculaire du virus. L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide permettant la réalisation de la procédure en un temps court et d’assurer un réveil rapide tout en minimisant l’hypothermie. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Les souris seront hébergées par 6 mois dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger. Des points limites (perte excessive >20%, lordose, dyspnée, poil piqué, difficultés locomotrices) seront utilisés afin de garantir le bien-etre des animaux après l’infection.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris (Mus musculus) constitue un outil essentiel pour la recherche par sa facilité de manipulation, sa petite taille, ses cycles de reproduction courts, et sa grande disponibilité. Cependant, la souris n’est pas sensible à l’infection par le SRAS-CoV-2, puisque la protéine spike “S” ne reconnaît pas le récepteur murin ACE2. Des stratégies d’insertion du gène humain ACE2 dans les modèles transgéniques ont été réalisées, mais son expression est ubiquitaire alors que chez l’homme, elle est restreinte, notamment aux voies respiratoires supérieures et inférieures. Afin de contourner ces différentes limitations et dans l’objectif de fournir à la communauté scientifique un modèle préclinique murin versatile, nous avons généré une lignée murine humanisée (ACE2(GFP)hACE2) exprimant le récepteur hACE2 au locus de mAce2 de manière conditionnelle et inductible. En effet, il n’existe pas à notre connaissance de knock-in inductible, tissu-spécifique et conditionnel de hACE2 chez la souris. Nos expérimentations concernent les jeunes adultes de 6 semaines, date à laquelle le muscle adulte est complètement formé.