Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 21/03/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-056929)
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dont 198 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie subit des brûlures superficielles au bois incandescent, des greffes de cellules leucémiques et des administrations des sécrétions de la grenouille kambo, pour tester un effet antileucémique. Le projet part de l’observation d’un seul patient guéri d’une leucémie après un rituel chamanique, que le porteur veut étayer expérimentalement. Il affirme que le kambo ne se dissout pas en culture et qu’un modèle immunocompétent est « indispensable », puis retient trois modèles murins de leucémie.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Ce projet fait suite à l’observation clinique d’un patient porteur d’une leucémie aiguë myéloïde (LAM), un cancer agressif des cellules hématopoïétiques dont le pronostic est extrêmement sombre. Ce patient a refusé le traitement conventionnel par chimiothérapie, mais a été guéri par un rituel chamanique amazonien appelé kambo, qui consiste à appliquer sur une brûlure superficielle de la peau des sécrétions cutanées de la grenouille Phyllomedusa bicolor. Le kambo est pratiqué en Amazonie mais depuis une vingtaine d’années, l’usage s’est répandu dans le monde entier, pour une variété de conditions médicales dans lesquelles les effets du kambo n’ont jamais été rigoureusement évalués. On estime qu’ environ 100 000 personnes reçoivent du kambo chaque année. En pratique, les patients sont brûlés au deuxième degré avec une baguette de bout de bois incandescente sur 5- à 10 points de 5-10 mm de diamètre. Les sécrétions de kambo forment une pâte qui est appliquée sur les brûlures. Après 1 heure, les effets s’estompent et les patients décrivent une sensation de bien-être intense. Les séances sont habituellement répétées plusieurs fois (5-10) tous les 3-7 jours. Les sécrétions contiennent de nombreux peptides bio-actifs, certains ayant des actions antitumorales. Il est donc possible que le kambo ait un intérêt thérapeutique dans la LAM. Sur les conseils de l’Agence nationale de sécurité du médicament, ce projet vise à trois conditions pour initier un essai clinique : 1/ apporter des arguments expérimentaux renforçant l’observation clinique; 2/ démontrer la bonne tolérance du traitement (étude anthropologique) ; et 3/ mettre au point un approvisionnement en kambo. La principale hypothèse pour expliquer les effets antileucémiques du kambo est que cette procédure permettrait au système immunitaire de reconnaître et éradiquer les cellules cancéreuses par l’induction d’une mort immunogène. De ce fait, un modèle murin immunocompétent est indispensable pour tester cette hypothèse. Trois modèles de LAM seront évalués compte tenu de l’hétérogénéité moléculaire des LAM, de l’agressivité différentielle des modèles et de la compétences des cellules immunitaires. Il est possible que l’administration transdermique après brûlure (méthode traditionnelle) contribue aux effets car il a été décrit que les brûlures activent les cellules de l’immunité. Une comparaison avec d’autres voies d’administration moins invasives sera évaluée afin de limiter au maximum la souffrance animale.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Trois bénéfices majeurs sont attendus : 1/ L’observation d’une guérison de leucémie aiguë myéloïde, pathologie agressive pour laquelle il n’y a jamais de guérison spontanée, chez un patient après réalisation de quelques séances de kambo suggère qu’il pourrait s’agir d’une nouvelle approche thérapeutique pour les patients atteints de LAM. Il s’agit là d’un enjeu clinique majeur, dans une maladie au pronostic particulièrement sombre (survie globale
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
1) Des prélèvements sanguins hebdomadaires sur souris vigiles seront réalisés dans l’ensemble des procédures (288 animaux). Les prélèvements sanguins seront réalisés par ponction veineuse en submandibulaire à l’aide d’une lancette. Un volume maximal de 50µL sera récolté à chaque prélèvement. Ce volume n’excédera pas 280µL sur 15 jours, volume maximal recommandé pour une souris de 20 grammes. Ces prélèvements débuteront chez des souris âgées de 8 semaines et chaque procédure n’excèdera pas une durée supérieure à 6 mois (24 semaines). 2) Injections par voie sous cutanée de l’analgésique. Pour les interventions de brûlures superficielles, il sera administrée 30 minutes avant la procédure puis 8 heures et 24 heures après la procédure (72 animaux). Lors des transplantations, il sera administrée 30 minutes avant la procédure (222 animaux). En terme de durée, son administration est rapide (moins de 10 secondes). 3) Induction de point de brûlure superficielle au niveau cutané : Les animaux de la procédure 2 (condition brûlure et brûlure + kambo : 72 animaux). La brûlure superficielle sera pratiquée niveau dorsal (très faible superficie 0,0016 cm2,
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
1. Nuisances modérées liées aux injections intra-péritonéales de l’agent myélo-ablatif. Le temps requis pour effectuer les injections est de l’ordre de quelques secondes. La greffe de cellules 24 heures après l’administration de busulfan permet d’éviter un état d’aplasie médullaire. 2. Nuisances modérées liées aux prélèvements sanguins hebdomadaires. Un volume faible de 50µL de sang sera ponctionné par prélèvement submandibulaire avec lancette, technique recommandée pour générer le moins de souffrance chez l’animal. Le temps requis pour effectuer cette procédure est de l’ordre de quelques secondes. Le volume sanguin ponctionné n’excédera pas 280µL sur 2 semaines comme recommandé. 3. Nuisances sévères liées à la réalisation de points de brûlure superficielle. Elles vont être réduites par l’administration répétée en 4 fois sur 48h d’analgésique (buprénorphine). Cet acte sera réalisé sous anesthésie générale. Les points seront suivis 5 jours par semaine afin de surveiller tout risque d’infection (jusqu’à cicatrisation de la plaie). A noter que chez l’humain, la surinfection des points d’application n’a jamais été rapportée, peut-être du fait de la présence de nombreux peptides antibactériens dans les sécrétions de Phyllomedusa bicolor. Nos essais préliminaires chez la souris montrent une cicatrisation complète à 5 jours, sans surinfection. 4. Nuisances modérées liées à la greffe intra-fémorale. Cette procédure permet de se substituer à l’injection de cellules leucémiques en intra-orbitaire et éviter le risque de développement de tumeur orbitaire. Ces nuisances seront limitées au maximum grâce à une procédure stricte couplant un analgésique (buprénorphine) et un anesthésiant (isoflurane). 5. Effets indésirables liés à l’infiltration leucémique et indiquant une souffrance modérée (réduction de l’activité, prostration, poil hérissé, yeux plissés ou bridés). Ces effets vont être prévenus par une analyse du taux d’infiltration leucémique (
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
L’ensemble des procédures requiert une mise à mort des animaux du fait que les analyses seront réalisées sur différents tissus (moelle osseuse, rate, ganglions).
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Dans ce projet, il est difficile de s’orienter vers des alternatives in vitro car le kambo n’est pas soluble dans du milieu aqueux (formation d’une pâte non dissoute ni dans du milieu de culture ni dans d’autres solvants). De plus, l’activité pharmacodynamique et la pharmacocinétique des peptides contenus dans les sécrétions de grenouille peut agir de manière indirecte sur les cellules leucémiques (activation des cellules de l’immunité innée et adaptative, cellules stromales) : il est donc nécessaire de préserver le micro-environnement médullaire ce qui ne peut être fait in vitro avec des lignées cellulaires. Au total, comme pour toutes les immunothérapies testées en oncologie, il est indispensable d’avoir recours à des modèles animaux immunocompétents.
2. Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation nous allons: – mutualiser au sein de l’équipe les ressources cellulaires post-mortem afin qu’un même échantillon puisse être exploité pour différents projets et ainsi éviter l’utilisation itérative de souris (tri des cellules GMP). – effectuer une étude statistique descriptive qui déterminera les différences qualitatives et quantitatives entre les groupes des souris. Cela permettra d’éviter la répétition de l’expérience et de réduire au minimum l’utilisation des animaux – optimiser le matériel issu pour production multiple (cellules en DMSO, acides nucléiques (ADN,ARN), lysats protéiques pour analyses rétrospectives et éviter la répétition de l’expérience). Nous utiliserons dans chaque expérience un nombre minimal mais suffisant d’animaux pour permettre une étude statistique exploitable.
3. Raffinement
Les souris auront un temps d’acclimatation de 7 jours minimum avant d’être incluses dans une procédure. Pour réduire au maximum la douleur associée au développement de la leucémie, des points limites prédictifs seront mis en place pour limiter les souffrances et le stress. La mise à mort sera pratiquée lorsque le taux de cellules leucémiques dans le sang sera de 80%, taux d’infiltration qui peut commencer à impacter le bien-être animal (BEA). Si des signes cliniques se déclarent avant (prostration, poil hérissé, perte d’activité, ataxie), l’animal sera mis à mort. Ces signes seront surveillés par un suivi régulier (5 jours par semaine du lundi au vendredi). Nous veillerons à optimiser et enrichir l’hébergement (blocs de cotons pour les besoins ludiques, maintien des groupes sociaux pour éviter le stress et l’isolement, portoirs ventilés adaptées, séparation des mâles et des femelles). Pour réduire la souffrance liée à la réalisation de gestes pouvant induire une douleur, les souris bénéficieront d’une anesthésie générale et de la mise en place d’un protocole analgésique puissant. Concernant les points de brûlure superficielle, ils seront suivis 5 jours après le geste pour mettre en évidence des signes d’infection cutanée (temps nécessaire pour la cicatrisation complète selon nos premiers résultats). Si nous mettons en évidence une infection cutanée, la plaie sera désinfectée 2 fois par jour jusqu’à disparition des signes d’infection. Si l’infection cutanée ne se résout pas par traitement au bout de 5 jours, les souris seront mises à mort. Le suivi des animaux permettra de visualiser la présence de signes de stress et de souffrance. A noter que nos résultats préliminaires n’ont pas mis en évidence ce type d’incident.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Ce projet s’intéresse aux leucémies aiguës myéloïdes (LAM). Au cours des dernières années, la communauté scientifique a généré des lignées murines génétiquement modifiées qui développent soit spontanément soit de manière inductible des LAM. Ces animaux sont donc des modèles de choix pour évaluer l’efficacité d’un traitement visant à éradiquer les cellules leucémiques. De plus, les mécanismes de leucémogenèse impliquent non seulement les cellules leucémiques mais aussi les cellules du microenvironnement (cellules stromales, cellules immunitaires). Les cellules immunitaires ayant un rôle déterminant dans l’effet antileucémique des traitements, il est indispensable d’avoir recours à des animaux immunocompétents pour tester des stratégies faisant intervenir le système immunitaire, comme c’est très probablement le cas avec le kambo. C’est pour cela que les modèles murins sont pertinents dans ce contexte d’étude.