Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 21/03/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-098725)
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte des cellules de mélanome humain sous la peau ou dans le sang, puis on les traite par des oligonucléotides et un gavage quotidien jusqu’à une tumeur de deux centimètres cubes. Le porteur prévoit la mise à mort dès ce point limite ou à la fin, puis des analyses moléculaires. Il présente le projet comme une preuve de concept ouvrant une collaboration avec l’industrie pharmaceutique et écarte les cultures cellulaires, jugées insuffisantes pour reproduire la tumorigenèse.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Ce projet vise à démontrer que l’inhibition de longs ARNs non codants in vivo altère la formation de mélanome et la progression des métastases, en association avec les traitements déjà existants. Ce projet est destiné à prouver que certains longs ARNs non codants sont de potentielles cibles thérapeutiques Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l’industrie pharmaceutique pour développer des inhibiteurs spécifiques pouvant être testés dans des essais précliniques
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Cette expérimentation doit permettre de caractériser les changements dans la formation et la croissance tumorales suite à l’inhibition d’un ARN longs non codant associée ou non à un traitement complémentaire déjà utilisé et ceci dans un contexte physiologique que ne permettent pas les cultures cellulaires in vitro. Ce projet devrait permettre la validation d’une nouvelle cible thérapeutique pour le mélanome cutané. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l’industrie pharmaceutique afin d’étudier l’effet de notre approche d’inhibition des ARNs longs non codants, dans l’objectif final d’identifier de nouveaux traitements pour le mélanome cutané.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Toutes les souris seront injectées une fois avec des cellules tumorales humaines (200 microlitres). Les injections de cellules par voie sous-cutanée ou intraveineuse rétroorbitale sont réalisées sous anesthésie gazeuse et durent une dizaine de secondes. Les injections sous-cutanée d’ASO (ASO : « Anti-Sense Oligonucleotides » : petites molécules d’ADN simple brin) (tous les deux jours, 100 microlitres) ou intrapéritonéales de luciférine (une fois par semaine, 100 microlitres) sont faites sur animal vigile et durent quelques secondes. Le gavage oral sera quotidien à raison de 100 microlitres, est réalisé sur animaux vigiles et dure une dizaine de secondes. Les traitements durent au maximum trois semaines.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’injection de cellules tumorales par voie sous-cutanée va provoquer la croissance d’une tumeur primaire à l’endroit de l’injection et/ou la formation de métastases distantes, notamment dans les poumons. La tumeur primaire pourra générer un inconfort physique lors des déplacements des souris. Cette tumeur primaire devrait apparaitre à partir de 5 jours suivant l’injection et croitre assez rapidement. La durée totale de l’expérimentation sera de trois semaines. Les souris seront sacrifiées en cas d’atteinte du point limite du volume tumoral de 2cm3. Les métastases ne seront pas visibles mais pourront entraîner une perte de poids, d’appétit et d’autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés. Lors des expériences précédentes d’injection de cellules tumorales dans le laboratoire, les souris ont dû être sacrifiées du fait de la taille de la tumeur primaire et non d’effets dus aux métastases. Les cellules tumorales injectées par voie intraveineuse devraient se fixer sur les organes de préférence métastatique, à savoir les poumons en premier. Les métastases ne seront pas visibles mais pourront entraîner une perte de poids, d’appétit et d’autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés. Le suivi des cellules du fait de leur luminescence permettra de suivre la croissance tumorale pour les deux voies d’injection. Les traitements subséquents devraient réduire la formation et la croissance des tumeurs.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Il est prévu de mettre à mort tous les animaux pendant ou à la fin du projet : l’injection de cellules tumorales devant conduire à la formation de tumeurs voire de métastases chez les souris, les animaux seront mis à mort pendant le projet si la taille de(s) tumeur(s) atteint les points limites, en cas de signes de souffrance ou à la fin du projet. Après euthanasie, des prélèvements seront effectués pour des analyses moléculaires.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’effet du traitement par des oligonucléotides antisens (ASO) sur la croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d’information requis.
2. Réduction
Le nombre total de souris expérimentales sera de 180 réparti comme suit : 1 cohorte de 30 animaux injectés par voie intraveineuse (IV) rétroorbitale avec 1 lignée de cellules tumorales puis traités ou non avec les ASOs, 1 cohorte de 30 animaux injectés par voie sous-cutanée (SC) avec 1 lignée de cellules tumorales puis traités ou non avec les ASOs, 2 cohortes de 60 animaux injectés par voie sous-cutanée (SC) avec 2 lignées cellulaires différentes, puis traités ou non avec les ASOs en présence ou en absence d’une thérapie ciblée complémentaire. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Le paramètre étudié sera la taille de la tumeur (mesurée avec un pied à coulisse) ainsi que sa vitesse de croissance pour les souris injectées par SC et le développement des métastases pulmonaires pour les souris injectées par IV. Les mélanomes humains sont des tumeurs hétérogènes et leur étude n’a pas permis d’isoler une lignée cellulaire modèle unique, il est donc nécessaire de tester plusieurs lignées cellulaires dans les deux voies d’injection. Pour l’analyse statistique, nous utiliserons le logiciel GraphPad Prism. Pour comparer deux groupes, un test t de Fisher à deux intervalles sera appliqué. Pour plus de deux groupes, une analyse de la variance à sens unique (ANOVA) sera suivie d’une analyse post hoc de Tukey pour comparer les moyennes entre deux groupes.
3. Raffinement
Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale, ce qui confortera le résultat des expériences. Les femelles et les mâles répondent de la même manière aux traitements, il ne devrait donc pas y avoir de biais expérimental du au sexe. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur primaire trois fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi) à l’aide d’un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l’atteinte de la taille limite de la tumeur de 2 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des lignées cellulaires utilisées. Nous surveillerons également quotidiennement l’état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. La migration des cellules métastatiques sera suivie par l’utilisation du système d’imagerie in vivo (IVIS) une fois par semaine. En plus du suivi de la taille de la tumeur primaire, la « painscore sheet » servira à l’évaluation de la douleur des animaux. Ce suivi permettra la mise en place d’une éventuelle analgésie (niveau 2) qui pourra être suivie de l’euthanasie si le score de douleur augmente encore (niveau 3).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
In vitro, nous avons validé nos techniques expérimentales et obtenu des premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques environnementales de la tumorigenèse in vivo et ne peuvent donc fournir le niveau d’information requis. L’utilisation du modèle de xénogreffe chez la souris ne peut être remplacée par d’autres méthodes expérimentales, il est fiable et facile à manipuler et déjà largement utilisé. De plus, les données que nous produirons à partir de nos tumeurs (cinétique tumorale, séquençage d’ARN, quantifications de protéines) seront comparées à celles collectées par notre laboratoire et nos collaborateurs dans des modèles similaires pour d’autres études. Nous utiliserons des souris ayant atteint le stade adulte (6 semaines) qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc ou intraveineuse rétroorbitale.