Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 29/03/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-972056)
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d’un gène de l’autophagie invalidé, elles subissent une série de tests de développement puis des tests comportementaux nommés, dont l’activité locomotrice, l’anxiété, la résignation et la communication, avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie pour prélever le cerveau. L’objet est d’étudier le rôle de l’autophagie dans les troubles du neurodéveloppement comme l’autisme, les retombées thérapeutiques étant renvoyées au long terme. Le porteur affirme que l’effet d’un tel défaut sur le comportement ne peut s’étudier autrement qu’in vivo.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 54 aux Etats-Unis pour l’année 2014 et 1 enfant sur 89 en Europe. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. Par ailleurs l’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier à différents âges le développement du système nerveux central chez un modèle souris pour lequel un gène de l’autophagie a été invalidé, par des approches complémentaires d’études du comportement et d’analyses des tissus prélevés. En particulier, nous étudierons le développement sensoriel et moteur chez le jeune animal pendant les trois premières semaines de vie, par la mise en place de tests successifs classiquement utilisés ; puis nous étudierons un ensemble de registres comportementaux individuels ou sociaux chez l’animal adolescent et adulte, tels que le niveau d’activité locomotrice, l’anxiété, les capacités cognitives, les comportements compulsifs, la résignation et les capacités de communication. Les échantillons prélevés nous permettront d’étudier les mécanismes d’autophagie et de mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant ce mécanisme cellulaire pour atténuer la survenue de ces troubles.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux sont soumis à des tests de développement ou de comportement non invasifs. Ils sont tous soumis à une procédure sans réveil de quelques minutes (perfusion intracardiaque sous anesthésie se finissant par l’euthanasie de l’animal).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
A notre connaissance, cette souris n’a jamais été étudiée d’un point de vue de son développement cérébral ou de son comportement. Le phénotype n’est à ce jour pas connu comme étant dommageable. Dans les procédures du présent projet, les animaux subissent exclusivement des tests non invasifs de développement et de comportement, jusqu’à l’euthanasie, pour laquelle un protocole d’anesthésie est mis en place.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue des procédures 1, 2 et 3, les animaux sont soumis à la procédure 4 (sans réveil). La procédure 4 décrit une perfusion intracardiaque réalisée afin de prélever les tissus d’intérêt. Les procédures 1, 2 et 3 sont classées en degré de gravité « modéré » et la 4ème est une procédure sans réveil. Les 3 premières procédures concernent chacune 120 animaux, la 4ème est réalisés sur l’ensemble des 360 animaux soumis à l’une des 3 premières procédures modérées. Nous comptons donc dans cette demande d’autorisation de projet 360 animaux en procédure modérée et 0 en procédure sans réveil. Les animaux ne sont donc pas maintenus en vie à l’issue de la procédure 4.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.
2. Réduction
Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 360 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, quand cela est possible, un même animal est utilisé successivement pour plusieurs tests de comportement, puis pour des études de biologie moléculaire et la réalisation de séries de coupes par cerveau nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D’une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement : La normalité de la distribution des data obtenues sera analysée par le test de Shapiro-Wilk, et des tests paramétriques (ANOVA et test a posteriori de Bonferroni pour les données issues des tests de développement et comportement ou test t de Student pour les analyses des échantillons) ou non paramétriques (test de Kruskal-Wallis puis Mann-Whitney) seront ensuite appliqués. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.
3. Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et une grille de suivi (annexe) est en place. Paramètres environnementaux : humidité comprise entre 45 % et 65 %, température constante entre 20 à 24 °C. L’éclairage est circadien (8h/20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Ils ont accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Le milieu est enrichi avec du matériel de construction de nid. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s’occupe bien d’eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de comportements anormaux (manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), l’état des animaux est surveillé plusieurs fois par jour. Un aliment enrichi et de l’eau sont mis à disposition directement dans la cage pour les animaux apathiques, surveillés 1 ou 2 fois/ jour. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans les procédures expérimentales (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture, perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids normal attendu selon la courbe de croissance standard de la souche C57BL/6Ncrl), alors il sera euthanasié par décapitation avant PND14 et dans une chambre à CO2 après PND14. Pour le protocole de perfusion intracardiaque suivi des prélèvements de tissus, un protocole d’anesthésie adéquat est mis en place (procédure 4). Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique, ici Irgm1, est souvent complexe et long à mettre en oeuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle Irgm1 KO existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement (voir 3.3.2). Plusieurs stades de développement seront analysés : nous nous intéressons en effet aux conséquences de la mutation sur l’élagage synaptique et sur la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, correspondant chacun à un temps d’euthanasie, seront étudiés : jeune (procédure 1 de PND4 à 17), adolescent (procédure 2 de PND25 à 34) et adulte (procédure 3 de PND70 à 89).