Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 12/04/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-641865)
1 566 poissons zèbres au stade larvaire vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont exposés vingt-quatre heures au lopéramide, un antidiarrhéique, puis tués par homogénéisation pour analyser leur microbiote et mesurer taille et poids hors de l’eau. Le porteur n’attend aucun effet délétère, la dose étant décrite comme non toxique dans la littérature, et prévoit de ne pas conserver les larves au-delà de onze jours. Il indique que l’effet sur la dynamique du microbiote ne peut être étudié qu’in vivo, le stade larvaire présentant selon lui un système digestif comparable à celui des mammifères.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La flore microbienne joue de nombreux rôles en santé humaine mais peut être affectée par diverses perturbations extérieures telles que les antibiotiques ou stress chimique. L’étude de l’impact de ces perturbations dont les médicaments sur le microbiote connait un intérêt grandissant afin de développer à l’avenir des approches complémentaires pour réduite leurs effets indésirables. Ces effets bien que décrits restent peu caractérisés du fait de la diversité et complexité de la flore intestinale chez les mammifères et des limites pratiques intrinsèques aux modèles in vivo correspondants (coûts d’hébergement, manipulation…). Dans ce contexte, la larve du poisson zèbre constitue un modèle de choix puisque la flore y est moins complexe, l’observation microscopique non invasive plus aisée, tout en arborant un système digestif et une réponse immunitaire innée comparables aux mammifères, en faisant ainsi un modèle pertinent pour étudier les interactions hôte-microbiote. Notre objectif est ici d’analyser l’impact du lopéramide, un médicament anti-diarrhéique couramment prescrit en clinique et utilisé pour mimer les dysfonctionnements intestinaux sur modèles animaux, sur la composition et la stabilité du microbiote naturel du poisson zèbre et d’identifier les éventuelles conséquences sur l’hôte.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
La flore joue un rôle important sur notre santé. La compréhension des interactions hôte-microbiote et les perturbations pouvant l’affecter sont indispensables au développement d’approches thérapeutiques et/ou préventives rationnelles. En effet, ceci s’intègre dans l’intérêt grandissant pour l’étude de l’impact de médicament couramment utilisés chez l’Homme sur le microbiote et le développement futur d’approches complémentaires pour contrer ou réduire les effets indésirables ainsi identifiés.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les poissons-zèbres au stade larvaire seront exposés pendant 24 heures au lopéramide, une molécule qui réduit le mouvement péristaltique intestinal. Cette procédure est considérée comme légère puisque cette molécule n’est pas létale à la dose utilisée ni même n’a jamais montré d’effets indésirables dans la littérature.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Aucun effet délétère du lopéramide n’est attendu car c’est une dose décrite précédemment comme non toxique. Néanmoins, une observation quotidienne des poissons sera réalisée et les poissons ne seront pas conservés plus de onze jours post-fertilisation pour limiter leur inconfort au vu de notre procédure d’élevage, à savoir des plaques 24-puits avec un poisson par puits contenant deux millilitres d’eau.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
L’ensemble des poissons utilisés dans cette étude sera mis à mort pour pouvoir analyser l’impact du traitement sur la composition du microbiote et ses éventuelles conséquences sur la croissance et/ou le développement des larves. La mise à mort des poissons est nécessaire car d’une part l’analyse du microbiote se fait par extraction après homogénéisation des poissons et d’autre part, l’impact sur la croissance (détermination du poids et mesure de la taille) ne peut se faire qu’hors eau, c’est-à-dire une fois les poissons mis à mort.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Tandis que l’impact du lopéramide sur les bactéries commensales fait l’objet d’une caractérisation in vitro, l’impact sur la composition et la dynamique de réponse du microbiote et ses éventuelles conséquences ne peut être étudié que dans un contexte in vivo. Le poisson zèbre est un modèle in vivo bien caractérisé et cette procédure implique de n’exposer au lopéramide que des poissons au stade larvaire de développement dont les systèmes digestif et immunitaire (réponse innée) sont organisés comme ceux des mammifères, un point déterminant dans le cadre de notre étude.
2. Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’être minimum tout en permettant l’application des approches statistiques choisies et est ainsi basé essentiellement sur des données précédemment publiées. Dans le cas des analyses de la composition du microbiote par séquençage 16S, le nombre de larves par groupe a été calculé à partir de donnés précédemment publiée, et a donc été fixé au nombre de 5 à chaque temps d’exposition pour chaque condition. Ce nombre permettra d’aborder la variabilité liée à ce type d’échantillon sans affecter la puissance statistique des tests choisis. L’analyse statistique pour la comparaison du microbiote par séquençage des larves au cours du temps s’appuiera ainsi sur l’utilisation d’un modèle comparatif du type modèle de Kruskal-Wallis. Les p-valeurs seront ajustées par une méthode type Benjamini-Hochberg afin de prendre en compte la multiplicité des tests. Pour l’analyse morphométrique des larves au cours du temps, le test statistique de Kruskal-Wallis non-paramétrique suivie de Wilcoxon sera appliqué, avec 10 larves par temps d’échantillonnage et par condition pour comparer les larves traitées au lopéramide contre celles contrôles exposées au DMSO.
3. Raffinement
La procédure consiste à exposer des larves de poissons-zèbres ayant une flore naturelle ou contrôlée à une dose non toxique de lopéramide puis à suivre l’impact sur la composition du microbiote au cours du temps et les conséquences éventuelles. Aucun effet délétère du lopéramide n’est attendu car c’est une dose décrite précédemment comme non toxique (Shi, 2014). Néanmoins, une observation quotidienne des poissons sera réalisée et les poissons ne seront pas conservés plus de onze jours post-fertilisation pour limiter leur inconfort au vu de notre procédure d’élevage, à savoir des plaques 24-puits avec un poisson par puits contenant deux millilitres d’eau. Nous nous appuierons également sur certains des critères présentés pour l’évaluation quantitative de points limites qui sont applicables dans ce modèle comme comme la prostration ou la nage anormale et certains aspects physiques. Les anomalies de développement et/ou morphologie seront ainsi recherchées. La détection d’un de ces points limites conduira à la mise à mort du poisson.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La flore intestinale joue un rôle important sur notre santé. La compréhension des interactions hôte-microbiote et leur réponse aux stress sont indispensables au développement d’approches thérapeutiques rationnelles complémentaires aux existantes pour le traitement de la diarrhée, et cela ne peut se faire sans le recours à l’expérimentation animale. Le Danio zébré est un modèle in vivo bien caractérisé (notamment du fait de son utilisation en biologie du développement), avec un génome connu et de nombreuses lignées transgéniques déjà disponibles. De plus, nos procédures impliquent de n’exposer au lopéramide que des poissons au stade larvaire de développement dont les systèmes digestif et immunitaire (réponse innée) sont organisés comme ceux des mammifères, un point déterminant dans le cadre de notre étude. Outre l’obtention de pontes, réalisée dans l’animalerie Zorgl’Hub, qui nécessite des poissons-zèbre adultes, mâles et femelles, mais non inclus dans ce projet car simplement géniteurs, nos procédures impliquent de n’exposer au lopéramide que des poissons au stade larvaire de développement. L’utilisation de poissons au stade larvaire de développement se justifie au niveau scientifique et éthique puisque ces derniers possèdent déjà un système digestif et une réponse immunitaire innée comparables à ceux des mammifères.