Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 12/04/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-722446)
48 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent pendant quatre semaines des instillations intra-trachéales d’un agent pro-inflammatoire sous anesthésie et, pour certains, une exposition continue à un air appauvri en oxygène simulant 4 300 à 5 000 mètres d’altitude, avant d’être tués par exsanguination pour prélever cœur et muscles. Le porteur décrit une baisse transitoire de prise alimentaire et d’activité, sans douleur attendue selon lui. Il affirme que ce dialogue entre organes ne peut s’étudier que sur « l’organisme entier » et retient le rat pour la quantité de muscle qu’il fournit.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le tissu musculaire squelettique est doté d’une plasticité particulièrement sollicitée en réponse à des contraintes comme l’entraînement, la réhabilitation, la nutrition ou l’environnement permettant une amélioration de la performance sportive mais aussi de la santé au sens large. De nombreux travaux montrent une corrélation entre la masse musculaire et la survie des individus âgés, qu’ils soient en bonne santé ou porteurs de pathologies chroniques. Ainsi, dans les pathologies chroniques, le maintien voire l’amélioration de la masse et de la fonction musculaires sont considérés comme des outils de santé, justifiant le recours à la réhabilitation par l’activité physique. Cependant, que ce soit dans le cadre de l’optimisation de la performance ou dans la prise en charge des patients, on note une fraction non négligeable de personnes ne répondant pas ou pas bien à de tels programmes qui peut aller jusqu’à 30% dans le cas de la maladie respiratoire chronique. Cette non-réponse est encore mal expliquée. A côté des mécanismes classiques de régulation de gènes d’intérêt dont l’expression peut varier fortement avec l’exercice, l’hypothèse d’un rôle significatif du micro-environnement musculaire sur le contrôle de ces adaptations, s’appuyant sur l’existence de régulations d’ordre épigénétique, semble privilégiée, que ce soit chez le sportif de haut niveau ou chez le patient. Ces modifications pourraient conduire à des difficultés à activer les voies de signalisation classiques contrôlant la masse musculaire (protéosynthèse, protéolyse) selon des critères qui restent à préciser (prédisposition, mode de vie, environnement, niveau d’activité physique). Ces critères agiraient via des modifications épigénétiques sur le développement musculaire et en particulier sur les limitations des capacités hypertrophiques du muscle en présence d’hypoxie et d’inflammation. Il convient maintenant de disséquer les mécanismes qui pourraient être à l’origine de ces réponses différentielles. Dans le cadre de la maladie respiratoire, ces échecs pourraient être liés à des modifications de la chromatine (ADN+histones) qui contrôleraient négativement la régulation de la masse musculaire mais dont on ne sait pas comment elle obéit au stress hypoxique et/ou inflammatoire associé. Notre objectif est de déterminer ces modifications pour ensuite proposer des solutions de contournement pour rendre plus efficace la réponse du tissu musculaire des patients au réentrainement à l’effort.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet vise à déterminer la signature épigénétique du tissu musculaire ainsi que ses signaux de réponse à l’exposition à l’hypoxie et/ou à l’inflammation d’origine pulmonaire, pouvant expliquer les niveaux de réponse variables du muscle à un stimulus hypertrophique observée dans des travaux précédents. Nos résultats permettront de relier les caractéristiques de l’épigénome associé à une contrainte environnementale (hypoxie et/ou inflammation) en fonction du type de muscle (oxydatif ou glycolytique) à des indicateurs métaboliques déterminés sur fibres isolées ou mitochondries isolées. L’objectif est ensuite d’utiliser des perturbations du métabolisme énergétique afin de modifier cet épigénome pour le rendre plus favorable, constituant ainsi un outil de personnalisation de la prise en charge de la fonction musculaire dans un contexte similaire d’hypoxie et d’inflammation comme chez le malade respiratoire.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux utilisés pour ce projet subiront soit des instillations intra-trachéales bi-hebdomadaires d’un agent pro-inflammatoire, sous anesthésie gazeuse de courte durée (inférieure à 2 min/session), pendant 4 semaines (groupes Inflammation seule et Hypoxie+Inflamation) représentant un total de 8 instillations. De plus, le groupe Hypoxie+Inflamation sera exposé en continu durant les 2 dernières semaines à un environnement appauvri en oxygène (similaire à une altitude de 4300m à 5000m) ainsi que le groupe Hypoxie seule. Après cette période de conditionnement, les animaux seront endormis (anesthésie gazeuse) et mis à mort immédiatement par exsanguination et prélèvement du coeur, suivis de prélèvements de divers organes ou tissus d’intérêt pour analyses ultérieures in vitro.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Le statut nutritionnel des animaux exposés à l’hypoxie continue peut être légèrement impacté avec une prise alimentaire diminuée dans les premiers jours en dépit d’un accès à l’eau de boisson et à la nourriture ad libitum mais qui revient ensuite à une quantité de nourriture consommée normale. L’activité locomotrice spontanée peut également être légèrement diminuée les premiers jours d’hypoxie pour revenir à la normale, facilitée en cela par l’hébergement qui se fait dans les mêmes cages que la stabulation normale, en groupe, avec enrichissement du milieu. L’instillation pulmonaire de LPS, génératrice d’une inflammation pulmonaire (avec présence de signes d’atteinte de l’épithélium pulmonaire) n’engendre pas de douleurs ou limitation physiologique chez l’animal au repos sur une période aussi courte (4 semaines). Le laryngoscope utilisé pour insérer la canule pour l’instillation de LPS est adapté à l’anatomie des animaux (diamètre, longueur) et n’est pas susceptible d’induire de gêne ou souffrance. L’exposition à l’hypoxie se faisant dans une enceinte accueillant les cages d’hébergement qui est installée dans une pièce d’hébergement où les paramètres environnementaux sont régulés, aucune nuisance relative à l’environnement thermique ou lumineux n’est attendu.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront mis à mort afin de prélever divers tissus et organes d’intérêt étudiés in vitro ensuite.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Nous voulons explorer les conséquences d’une perturbation de la disponibilité en oxygène associées à une inflammation pulmonaire similaires à celles engendrées par la maladie respiratoire, sur des tissus périphériques comme les muscles squelettiques en utilisant un modèle combinant une hypoxie et une inflammation environnementale reproduisant les principales conséquences de la maladie respiratoire chronique. Cette relation inter-organes n’est pas possible sur un modèle autre que l’organisme entier. En raison de la quantité de tissus nécessaire pour un rendement d’isolement de mitochondries musculaires ou de fibres perméabilisées suffisant, nous avons choisi le rat qui propose une taille adaptée, par rapport à la souris.
2. Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux pour atteindre le seuil de significativité lors de l’analyse statistique des résultats avec une puissance de test cible de 0.8. Les méthodes d’exploration utilisées introduisent une variabilité qui reste limitée à 5%. Les changements attendus sur les paramètres mesurés sont de l’ordre de + ou – 15% par rapport à la valeur moyenne contrôle. Avec ces différents critères pris en compte, notre approche statistique donne un calcul d’effectif de 10 animaux par groupe. Par mesure de précaution, afin de tenir compte des aléas expérimentaux, nous incluerons 12 animaux par groupe soit un total de 48. Nous profiterons de ce protocole pour prélever et stocker des tissus qui ne seront pas directement utilisés dans ce projet. Cependant, ils seront stockés pour éventuellement être analysés dans le cadre d’un projet portant sur le foie, évitant de reconditonner de nouveaux lots d’animaux.
3. Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe, en cages ouvertes, avec un enrichissement du milieu (cachettes, litière) dans des locaux où les paramètres d’ambiance (température, hygrométrie, lumière, cascades de pression) sont suivis et enregistrés en continu, avec remontée d’alarme en cas d’écart avec les valeurs de consigne. L’exposition à l’hypoxie sera réalisée dans le même matériel d’hébergement, dans une enceinte pouvant accueillir plusieurs cages de plusieurs animaux. L’instillation intra-trachéale se fera après une légère anesthésie gazeuse d’une durée maximale de 2 min/session et l’animal sera observé jusqu’à son réveil complet avec de retrouver ses congénères. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long du projet et évalué grâce à une grille codifiant les symptômes observés 2 fois par jour après chaque procédure ou 3 fois par jour en cas de symptômes cliniques jusqu’à leur disparition ou la mise à mort de l’animal. Les gestes techniques seront réalisés par des personnes compétentes et formées pour leur exécution. Ceux-ci comprennent l’observation de l’apparition éventuelle de signes cliniques (troubles du comportement, prostration, manque de toilettage) ou une perte de poids supérieure ou égale à 20% de leur poids de départ. Ils seront alors mis à mort et exclus de l’étude. Un examen post-mortem sera pratiqué pour identifier d’éventuelles lésions pouvant expliquer cet état afin de trouver des mesures de correction pour de futurs projets. Le volume à instiller sera limité à 1 µL/g de poids corporel.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Ce projet porte sur les conséquences d’une exposition environnementale à l’hypoxie et/ou à une inflammation pulmonaire sur le tissu musculaire squelettique. Le seul moyen d’étudier ce dialogue interorganes et l’influence d’un tissu ou d’un organe sur le fonctionnement d’un autre est d’utiliser l’organisme entier. Il n’existe actuellement aucune alternative scientifiquement validée. Le rat de laboratoire est l’espèce la plus adaptée car sa taille adulte permet d’obtenir des quantités de muscle adaptées aux mesures à réaliser, limitant le nombre d’animaux à utiliser par rapport au recours à d’autres espèces plus petites (souris..). De plus, la littérature scientifique montre que cette espèce présente des signes d’adaptation musculaire et cardiaque à ces facteurs environnementaux semblables à ce que l’on peut observer chez l’être humain dans un contexte de maladie respiratoire chronique, en faisant ainsi un modèle d’étude pertinent. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte moyen (âge en début de projet : 6 à 8 mois), de façon à se rapprocher de l’âge moyen d’apparition de la maladie respiratoire chez l’homme (âge adulte moyen) correspondant à l’entrée dans la 2ème partie de la vie.