Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 19/09/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-776236)
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de l’oreille interne puis une bio-impression assistée par laser via la fenêtre ronde de la cochlée, sous deux anesthésies générales, pour mettre au point une technique d’injection intra-cochléaire. Le porteur décrit la bio-impression et les mesures auditives comme ne générant « aucune douleur ou traumatisme », alors que la chirurgie reste classée en gravité modérée. Sur le remplacement, il affirme que ces mesures ne peuvent se faire sur des animaux non-mammifères, au système auditif jugé « trop éloigné » de celui de l’homme.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’oreille interne représente l’un des organes cibles les plus difficiles pour l’administration de médicaments. Les voies conventionnelles, telles que l’administration orale et les injections, ont une efficacité limitée, principalement en raison de la barrière hémato-cochléaire qui bloque la plupart des molécules provenant de la circulation sanguine. L’une des voies d’accès la plus étudiée et la plus prometteuse comme « porte d’entrée » de l’oreille interne repose sur la fenêtre ronde à la base de la cochlée (1.5 mm de diamètre environ). Elle constitue une membrane souple, relativement perméable, de 40 à 60 µm d’épaisseur et est composée de 3 couches cellulaires. Son rôle est de vibrer de manière opposée aux vibrations acoustiques qui entrent dans l’oreille interne, jouant ainsi le rôle de soupape de pression et permettant aux ondes sonores de se propager dans la cochlée. Cette membrane permet d’avoir un accès privilégié aux fluides internes de la cochlée. L’objectif du projet est donc de développer un nouveau dispositif permettant de délivrer un agent thérapeutique en intra-cochléaire, via la fenêtre ronde, de manière atraumatique et contrôlée. Pour cela, l’équipe s’est orientée vers la bio-impression assistée par laser, déjà utilisée au laboratoire dans des protocoles de régénération osseuse in situ chez l’animal, qui ne produit pas de souffrance apparente des animaux.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet permettra de développer une technique pour réaliser des injections de substances thérapeutiques dans l’oreille interne, avec une grande précision et sans risque de lésions des structures sensorielles cochléo-vestibulaires contrairement aux stratégies développées à ce jour.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les 4 groupes d’animaux (soit 100 souris) seront soumis à une procédure chirurgicale et aux mesures de PEAs. La bio-impression assistée par laser ne concernera que les groupes 2 à 4 (soit 90 souris sur les 100 prévues). Ces procédures seront réalisées sous anesthésie générale (mélange Kétamine-Xylazine) accompagnée d’une analgésie dans le cas de la chirurgie (Carprofène). Les procédures de mesure de PEAs pré-opératoire, de chirurgie et de bio-impression seront réalisées en continuité directe lors de la première anesthésie (10 min pour les mesures de PEAs, 15 min pour la chirurgie et 10 min pour la bio-impression, soit 35 min de procédure sur souris anesthésiées). Une seconde anesthésie sera réalisée, 48h à 7 jours après l’intervention (post-opératoire), pour mesurer les PEAs. A la fin de la seconde mesure de PEAs post-opératoire, les animaux seront mis à mort selon la procédure prévue. Ainsi, sur les 100 souris qui subiront la procédure chirurgicale et les mesures de PEAs (pré- et post-opératoire), 90 souris subiront également la bio-impression assistée par laser. Les 4 groupes d’animaux seront donc soumis à 2 anesthésies générales au total, pour une durée maximale de 35-40 min par anesthésie (cf. frise chronologique en annexe). Un délai de 48h minimum sera respecté entre les anesthésies.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La durée des procédures n’excède pas 40 minutes maximum permettant de limiter la durée de l’anesthésie. Un délai de 48h minimum sera respecté entre les anesthésies. Les procédures de bio-impression et de mesure des PEAs ne génèrent aucune douleur ou traumatisme chez l’animal, et seront réalisées sous anesthésie générale car elles nécessitent une immobilisation complète de l’animal. Lors de la chirurgie (niveau de sévérité modéré), un analgésique sera également utilisé pour limiter le niveau de douleur de l’animal.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront gardés en vie après les différentes procédures excepté après la seconde mesure de PEAs (post-op) où les animaux seront mis à mort selon la procédure prévue. Les tissus de l’oreille interne seront prélevés pour analyse.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’application de substances thérapeutiques sur la fenêtre ronde s’insère dans un projet d’application clinique future. Il faut dans un premier temps démontrer son efficacité et son innocuité sur un modèle animal. Par ailleurs, ces mesures ne peuvent se faire sur des animaux non-mammifères car leur système auditif est trop éloigné de celui de l’homme. Toutes les manipulations préalables de calibration par exemple seront effectuées dès que possible sur matériel inerte (gélose).
2. Réduction
Chaque souris sera utilisée pour toute la série de procédures (chirurgie, bio-impression assistée par laser et mesures de PEAs) afin d’en limiter leur nombre. Les souris seront donc soumises à 2 anesthésies au total : une première anesthésie pour la mesure pré-opératoire des PEAs, la chirurgie et la bio-impression puis une seconde anesthésie pour la mesure post-opératoire des PEAs (cf. frise chronologique en annexe). Nous utiliserons le plus petit nombre possible de souris par conditions de bio-impression, conformément aux limites biostatistiques nous permettant une fiabilité des résultats. Pour les tests statistiques, nous utiliserons essentiellement des tests non paramétriques (type Wilcoxon-Mann-Whitney) puisque les échantillons seront petits et que les pré-requis des tests paramétriques (distributions normales, variances égales) ne seront pas satisfaits. Le nombre total de 100 souris utilisées sur l’ensemble du projet permet un traitement statistique significatif des données obtenues en se laissant une marge de manœuvre en cas d’échecs. Une phase de mise au point de bio-impression in vivo sera nécessaire, nécessitant des animaux surnuméraires (pris en compte dans nos lots). Un nombre minimum de 15 souris/groupe de bio-impression sera nécessaire pour assurer la fiabilité des tests statistiques. Ainsi, en fonction des résultats obtenus, un nombre plus faible d’animaux pourrait permettre d’avoir des résultats statistiquement fiables.
3. Raffinement
Une analgésie adaptée sera appliquée en pré- et post-opératoire ainsi que des conditions de stabulation appropriées. Pour soulager l’inconfort et le stress des souris, nous hébergerons les souris dans une cage à milieu enrichi (tunnel carton, aspen bois, fibres de papier et abri) dans un local à ventilation, température et éclairage contrôlés. Pendant les différentes procédures, l’animal sera profondément anesthésié avec une surveillance des points vitaux (fréquence cardiaque et respiration, couleur des muqueuses, température corporelle). Des points limites seront définis afin de respecter le bien-être animal et pourront entraîner l’arrêt immédiat des manipulations. Trois expérimentateurs impliqués dans le projet possèdent l’expérimentation animale niveau concepteur (un expérimentateur supplémentaire fera la formation en mars 2022). Concernant les 2 expérimentateurs principaux (possédant l’EA concepteur), l’un a également suivi la formation chirurgie (octobre 2021) et l’autre suivra la prochaine formation chirurgie prévue en mars 2022. Concernant la formation continue, ces 2 expérimentateurs ont accumulé respectivement 26h sur 6 ans et 18h sur 4 ans (notamment sur le bien-être animal, la règle des 3R, les points limites, la gestion de la douleur…).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les mesures de PEA ne peuvent se faire sur des animaux non-mammifères car leur système auditif est trop éloigné de celui de l’homme. L’anatomie cochléaire est également similaire, et la fenêtre ronde est bien accessible. Les souris utilisées auront entre 2 et 4 semaines, c’est-à-dire à un stade de développement postnatal où l’appareil auditif a atteint sa maturité.