Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 25/09/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-083501)
75 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des sensibilisations cutanées hebdomadaires pendant six semaines, puis un gavage à l’éthanol trente minutes avant l’ingestion forcée de gluten, de façon à déclencher une réaction anaphylactique servant à étudier l’alcool comme cofacteur d’allergie. Certaines reçoivent aussi une puce implantée chirurgicalement dans l’abdomen, et le porteur décrit une baisse de température corporelle et des douleurs stomacales attendues. Il affirme que le modèle in vivo est « irremplaçable » pour reproduire la réaction allergique dans son ensemble.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les allergies sont très répandues et ont été classées comme quatrième pathologie en termes de morbidité par l’Organisation Mondiale de la Santé. Ainsi, l’allergie est considérée comme un enjeu majeur de santé publique. Coûteuses, les allergies altèrent également la qualité de vie des patients. Depuis une vingtaine d’années, une augmentation constante de la prévalence de cette pathologie et notamment de la forme sévère (dite anaphylactique) a été constatée. A l’heure actuelle, les mécanismes impliqués dans le développement de la réaction allergique et les causes spécifiques de l’augmentation de leur prévalence sont peu établis. Les quelques études publiées sur la survenue de l’anaphylaxie révèlent une implication majeure de cofacteurs tels que l’effort, l’alcool et les anti-inflammatoires non stéroïdiens. Dans le cas de l’anaphylaxie induite par l’effort et dépendante du blé (cas le plus répandu), l’hypothèse soutenue repose sur une altération importante de la fonction gastro-intestinale notamment marquée par l’augmentation de la perméabilité intestinale lors de l’effort. Ces modifications favorisent ainsi le passage des allergènes dans le sang. Chez les sujets souffrant d’allergie d’origine alimentaire, la réaction et les symptômes sont alors amplifiés pouvant entraîner le décès du sujet. Il a également été admis que la réactivité IgE de certaines fractions protéiques diffère lors de la réaction anaphylactique. L’objectif de ce projet est d’établir le mécanisme impliqué dans l’anaphylaxie induite par l’alcool et dépendante du blé. L’alcool est considéré comme étant le deuxième cofacteur intervenant dans les réactions de l’allergie alimentaire, mais de manière surprenante les mécanismes moléculaires par lesquels l’alcool amplifie la réaction allergique n’ont jamais été élucidés. Le blé a été choisi car c’est un allergène commun et connu pour être impliqué dans la réaction allergique sévère et notamment en présence de cofacteurs. Plus spécifiquement, l’étude se focalisera sur le gluten, un complexe protéique du blé, composé des allergènes majeurs de la céréale. Aussi lors de cette étude, un examen approfondi de le barrière intestinale sera menée afin de déterminer les modifications dues au cofacteur. La symptomathie et le mécanisme de la réponse immunitaire lors de la réaction anaphylactique seront également caractérisés en détail.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet a pour objectif d’apporter des connaissances sur le mécanisme impliqué dans l’anaphylaxie induite par l’alcool et dépendante du blé. De ce fait, la réponse immunitaire précise de cette physiopathologie sera élucidée. Les effets de l’alcool au niveau de la barrière intestinale dans le cas d’une allergie alimentaire au blé seront déterminés. Aussi, une étude sur les fractions protéiques intervenant dans cette physiopathologie sera effectuée. A terme, ce projet a pour but de permettre une compréhension plus approfondie de l’anaphylaxie induite par l’alcool et dépendante du blé pour améliorer la prise en charge des sujets atteints. Des solutions préventives et thérapeutiques pourront être proposées.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Lors de ce protocole, 5 groupes de 10 souris seront soumis à des sensibilisations percutanées hebdomadaires pendant 6 semaines. Les animaux seront alors anesthésiés tous les 7 jours pour la réalisation de la réalisation du geste. Aussi, sur ces souris, un total de 4 prélèvements de sang seront effectués avant le début des sensibilisations, après la 3ème sensibilisation, après la 4ème sensibilisation et après la 5ème sensibilisation. Elles seront effectuées 48h après les sensibilisations. Aussi, les souris subiront un gavage oral. Le groupe des 10 souris permettant d’évaluer l’impact du cofacteur seront gavées à l’éthanol 30 min avant le challenge au gluten. Quatorze souris de la procédure 1 subiront une chirurgie pour l’implantation de la puce Anipill (2 souris des groupes : CTL NA ; CTL SENS ; CTL CHAL et 4 souris des groupes : AA ; AA+EtOH). Elles seront anesthésiées par voie gazeuse, puis l’abdomen sera ouvert et une suture sera effectuée. Elles auront un suivi post opératoire.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Il est possible que les animaux aient des effets indésirables suite aux gestes pratiqués. En effet, lors des sensibilisations percutanées, une gêne peut être ressentie due à l’adjuvant utilisé (SDS) et à la répétabilité du geste (1 fois par semaine pendant 6 semaines). La phase de déclenchement de l’allergie alimentaire (challenge), peut également contribuer à des nuisances. Une baisse de la température corporelle des animaux est généralement observée. Aussi pour le groupe de souris étudiant l’effet du cofacteur dans l’allergie alimentaire au blé, la phase d’administration du cofacteur peut également être cause de stress et de gène au niveau de l’œsophage étant réalisé 30 minutes avant le challenge au gluten. Lors de cette étape, une baisse de la température corporelle pourra également être attendue ainsi qu’une baisse de l’état de santé général de l’animal. Les souris pourront aussi ressentir des douleurs stomacales liées à l’administration d’alcool et de gluten. La prise de température par voie rectale peut aussi entrainer un inconfort pour les souris. Aussi, des symptômes caractéristiques de l’anaphylaxie peuvent être observés. Généralement, les effets surviennent entre 0 et 30 minutes après le geste et peuvent persister pendant une trentaine de minutes.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort des animaux afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude immunologique et de la fonction gastro-intestinale.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire. Notamment, le cas de l’étude du mécanisme et de la symptomatie de la réponse allergique impliquant un co-facteur le modèle in vivo est irremplacable.
2. Réduction
Le protocole d’allergie alimentaire est régulièrement réalisé au sein du laboratoire. De ce fait, en se basant sur les études précédentes, le nombre de souris a été déterminé à 10 souris par groupe. Le nombre d’animaux réduit au minimum permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables pour la réalisation d’analyses statistiques de type test de Wilcoxon-Mann-Whitney ou test de Student. La valeur P-value de p
3. Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l’expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d’analgésie et d’anesthésie permet de minimiser l’inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées en nombre de 5 par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Aussi pour limiter l’inconfort lors de la prise de température, des puces seront placées chirurgicalement chez certaines souris (de 2 à 4 souris par groupe hormis pour le groupe contrôle alcool). Les mesures obtenues par les puces télémétriques Anipill seront comparées aux mesures prises par voie rectale pour évaluer la fiabilité des puces et pouvoir à termes favoriser l’utilisation des puces dans les protocoles. En parallèle de la procédure 1 et avant le challenge oral avec l’alcool, le groupe contrôle alcool réalisé sur un petit nombre de souris (n=10) déterminera exactement la dose d’éthanol la plus tolérable par les souris. Ainsi, cette procédure permet de limiter le nombre de groupe allergie alimentaire et cofacteur et de limiter des nuissances importantes sur les animaux.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Lors de cette étude, des souris femelles de souche Balb/c seront utilisées. Ces souches de souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Il n’existe aujourd’hui pas de méthodes alternatives pour analyser efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent adéquatement reproduire. Ainsi, l’expérimentation animale est un élément vital de ce projet afin de modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires seront réalisées. Les femelles Balb/c utilisées auront 3 semaines de vie à réception et auront 5 semaines de vie au début des procédures. Cinq semaines est l’âge idéal correspondant à des souris sevrées et adultes ayant un système immunitaire mature. Pour les souris avec une implantation d’une puce type Anipill, l’intervention chirurgicale sera effectuée à 4 semaines de vie permettant aux souris d’avoir un poids corporel correct.