Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 17/10/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-394990)
864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À cinq jours de vie, les souriceaux subissent une chirurgie du cou pour isoler la carotide et, pour une partie, une privation d’oxygène à 8 % pendant quarante-cinq minutes destinée à provoquer des lésions cérébrales proches de la paralysie cérébrale humaine, avec des séparations maternelles répétées. Le porteur reconnaît que ces séparations déclenchent des appels à la mère et cherche à tester des molécules neuroprotectrices, avec des tests comportementaux jusqu’à l’âge adulte. Il juge le recours à la souris « indispensable » pour suivre la plasticité cérébrale sur le cerveau entier.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La paralysie cérébrale (PC) est la première cause de handicap moteur de l’enfant. En France, elle concerne 4 nouveau-nés chaque jour, avec une vulnérabilité accrue chez les garçons. La prématurité, une hypoxie-ischémie (HI) et le stress sont des facteurs de risque de la PC, pouvant engendrer des lésions cérébrales. La problématique générale du projet est de valider chez l’animal des approches de neuroprotection périnatale, en comparaison avec les effets du MgSO4 (unique molécule, à effet neuroprotecteur partiel, recommandée en clinique). Un modèle expérimental chez la Souris permet d’induire ces lésions en réalisant une HI périnatale, tout en reproduisant les différences intersexuelles observées en clinique. La vulnérabilité cérébrale en période périnatale évolue rapidement, montrant des profils lésionnels dépendants de l’âge d’exposition et du sexe. En effet, la période de la naissance correspond à une phase tardive du développement cérébral (gliogénèse, migrations cellulaires, synaptogénèse, vasculogénèse). La compréhension des mécanismes lésionnels et de plasticité cérébrale sont un préliminaire aux études de neuroprotection. Celles-ci consistent à tester à court et long termes les effets de molécules pharmacologiques sur le comportement sensori-moteur et cognitif des souris ayant subi une HI néonatale, ainsi qu’à analyser leurs effets aux niveaux tissulaire, cellulaire et moléculaire.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les études cliniques ont permis d’affirmer qu’à court terme le MgSO4 diminue significativement les séquelles neuromotrices graves à type de paralysie cérébrale justifiant son administration en routine aux mères en menace d’accouchement prématuré. Le projet permettra d’étudier les effets mécanistiques et comportementaux du MgSO4 administré seul, en différenciant les sexes. D’autre part, des travaux récents du laboratoire rapportent que l’administration de MgSO4 chez le souriceau hypoxo-ischémié à P5 prévient à court terme, les déficits sensorimoteurs, l’inflammation et l’apoptose induits pas une HI néonatale. Cependant, il est remarquable qu’à long terme, le MgSO4 ne parvient pas à prévenir les troubles moteurs et cognitifs alors qu’il semble prévenir les modifications tissulaires induites par l’HI (désorganisation des fibres myélinisées du corps calleux). En clinique, aucun effet délétère du MgSO4 n’a été rapporté chez la mère ni chez le foetus. Cependant, des études précliniques ont alerté sur le fait qu’une dose élevée de MgSO4 pouvait entrainer des altérations de l’angiogenèse corticale. Ainsi, ce projet permettra également de tester les effets de l’association du MgSO4 avec d’autres molécules pharmacologiques. L’une des molécules qui sera étudiée dans le cadre de ce projet est le 4-Phénylbutyrate (4-PBA) qui a des propriétés neuroprotectrices, qui est un inhibiteur d’histone déacétylase (iHDAC) et qui est administré chez le nouveau-né en clinique pour traiter des troubles du cycle de l’urée.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les souriceaux subiront une procédure chirurgicale (uniquement isolement de la carotide ou hypoxie-ischémie) à 5 jours de vie (P5) afin d’induire des lésions cérébrales similaires à celles observées dans le cerveau de certains enfants nés prématurément entre 24 et 32 semaines d’aménorrhée. Tous les souriceaux subiront 4 isolements maternels, respectivement de 8, 10, 45 et 10 minutes, le jour où seront réalisés à la fois la chirurgie et les traitements. Ils ne seront isolés de la fratrie que pendant l’acte chirurgical et la phase de réveil (8 minutes en tout). La chirurgie impliquera de faire une injection sous-cutanée (d’analgésique), une incision de la peau du cou et du tissu sous-jacent afin d’isoler la carotide, puis de réaliser deux points de suture. Tous les animaux seront tatoués pendant l’anesthésie. Les traitements nécessiteront de réaliser 2 injections intrapéritonéales par individu. Les animaux des groupes hypoxo-ischémiés subiront une hypoxie à 8% d’O2 pendant 45 minutes. Les tests comportementaux réalisés chez le souriceau, la souris adolescente puis chez l’adulte visent à évaluer son développement sensorimoteur et ses capacités cognitives lors d’activité spontanées.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les phases d’isolement maternels provoquent systématiquement des appels à la mère de la part des souriceaux. Les manipulations des petits et de la mère se font quotidiennement dès 24h après la naissance et évitent ainsi des stress répétés lors des tests comportementaux. La molécule A peut provoquer une vasodilatation, bradycardie et myorelaxation, mais à la dose injectée, le comportement des souriceaux et de la mère envers ses petits n’est pas altéré. La molécule B ne provoque pas non plus d’altération du comportement des souriceaux ni de la mère envers ses petits. Du fait de la variabilité interindividuelle, certains animaux hypoxo-ischémiés présenteront à court et long termes des déficits sensorimoteurs et cognitifs très discrets, mis en valeurs par des tests comportementaux spécifiques. Les animaux restent autonomes et tout à fait mobiles. Ils maintiennent des interactions sociales. Les souriceaux étant retirés progressivement à la mère pendant la chirurgie, celle-ci n’est jamais totalement dépourvue de ses petits.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les souriceaux opérés sont maintenus en vie pendant une durée allant de 6 à 60 jours post-opératoires puis euthanasiés sous anesthésie profonde pour le prélèvement des cerveaux en vue des différentes expérimentations
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Il est indispensable pour notre étude d’avoir recours à l’animal, ici la Souris: 1) Le stress est connu pour être l’un des facteurs de risque de la PC. Les séparations subies par le couple mère-souriceau à P5 renvoient aux difficultés rencontrées par les parents d’enfants prématurés pour être en contact avec leur enfant en couveuse, intubés et portant de multiples sondes; 2) Plasticité cérébrale: celle-ci apparaît au cours du développement cérébral ce qui nécessite de travailler de façon longitudinale sur le cerveau entier. L’analyse à long terme des altérations comportementales, histologiques et neurochimiques et de la neuroprotection, nécessite de travailler sur l’animal au stade juvénile, adolescent et adulte; 3) Interactions intercellulaires: les altérations tissulaires induites par l’HI à P5 ciblent préférentiellement, mais pas seulement, la substance blanche cérébrale produite par les oligodendrocytes (OL). La prolifération, la migration et la différenciation des OL sont vasculo-dépendantes et fonction de l’activité neuronale. Une approche intégrée est donc indispensable dans le cadre de ce projet.
2. Réduction
Nous aurons 8 groupes de souris : 4 groupes contrôles et 4 groupes ayant subi une chirurgie. Chez les contrôles, comme chez les opérés, nous testerons les effets de deux traitements A et B, séparés ou combinés. Notre modèle de chirurgie reproduit les variabilités interindividuelles rapportées en clinique, nous contraignant à avoir des effectifs importants par groupe. Notre modèle chirurgical reproduit également les variabilités sexuelles rapportées en clinique. Dans un 1er temps, les groupes d’animaux seront constitués sans différencier les sexes. Ce n’est que dans le cas où des différences intersexuelles sembleraient apparaitre que le dédoublement des groupes sera fait afin de pouvoir analyser statistiquement les potentiels effets sexe. Les mêmes animaux réaliseront à la fois les études comportementales à court et à long terme et leur cerveau sera prélevé pour les études histologiques et/ou neurochimiques. Les données obtenues chez les groupes contrôles pourront être utilisées pour la mise au point de protocoles afin d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires.
3. Raffinement
Les chirurgies réalisées à 5 jours de vie seront effectuées dans une pièce isolée, au calme, avec seulement un ou deux manipulateurs expérimentés présents. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale. On pratique une hyperoxygénation avant anesthésie. Un analgésique sera injecté. Le souriceau sera maintenu sur une couverture thermique. Après la chirurgie, les souriceaux seront remis dans leur cage avec la mère dans un environnement calme permettant la nidification et les soins maternels et stabilisé. Les comportements des souriceaux et de la mère seront observés très attentivement et ceci de façon répétée pendant les 24 premières heures post-chirurgie. Un suivi post-opératoire quotidien sera réalisé : suivi du poids des animaux, observation de leur apparence, vérification de l’accès aux mamelles, léchage des petits. Chez l’adulte, l’indice de grimace facial sera utilisé pour évaluer le niveau de douleur et le comportement de l’animal sera régulièrement observé.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La Souris est une espèce couramment utilisée en Neurosciences. L’espèce est prolifique (cycle de reproduction court (21 jours)), à faible coût d’élevage, utilisée abondamment dans la bibliographie scientifique. Une Hypoxie-Ischémie (HI) réalisée chez la Souris à 5 jours de vie permet d’induire des lésions cérébrales similaires à celles observées dans le cerveau de certains enfants nés entre 24 et 32 semaines d’aménorhée. Ce modèle expérimental permet également de reproduire les différences intersexuelles observées en clinique. Les souris NMRI étant non consanguines, les données obtenues sont plus proches de ce que l’on observe chez l’Humain. L’inconvénient est que cela est à l’origine d’une plus forte variabilité interindividuelle que chez des souris consanguines, ce qui nécessite des effectifs plus importants pour le traitement statistique des données. Les souriceaux seront utilisés : – durant les deux premières semaines de vie (le stade de 5 jours de vie chez le souriceau correspond au stade 24-32 semaines d’aménorrhée chez l’Humain au cours duquel la substance blanche est particulièrement vulnérable). Durant ces deux premières semaines, des tests sensorimoteurs seront réalisés ainsi que des études histologiques et/ou neurochimiques. Le sevrage sera réalisé à 21 jours de vie si le poids corporel est supérieur à 10 grammes. – puis à l’adolescence (P30-P45), – puis à l’âge adulte (60 à 90 jours). Ce sont souvent les mêmes souriceaux qui seront utilisés aux différents âges car de potentielles corrélations seront recherchées entre d’une part les déficits comportementaux discrets et les altérations histologiques observés à long terme et d’autre part les altérations comportementales discrètes observées à court terme. Les souris femelles non utilisées dans le projet pourront être mises en reproduction, si besoin, à partir de l’âge de 8 semaines et pour une durée maximale de 6 mois. Entre le sevrage d’une portée et le prochain accouplement, un repos d’une durée de 14 jours est respecté pour les mères. Les pères seront mis en reproduction à partir de 8 semaines pour une durée totale de 1 an.