Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 24/10/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-330298)
2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules leucémiques, murines ou humaines, leur sont injectées, puis elles reçoivent des composés par de multiples voies avec suivi par bioluminescence sous anesthésie et prélèvements sanguins, dont l’amputation de l’extrémité de la queue, pour évaluer des candidats médicaments contre la leucémie. Le porteur décrit une dégradation possible, baisse d’activité, respiration difficile, perte de poids et impossibilité de s’alimenter à mesure que la leucémie progresse. Il juge le recours à l’animal « incontournable » au motif qu’aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la pharmacocinétique dans un organisme complet.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Ce projet consiste à évaluer de nouveaux traitements pour les leucémies, dont les besoins sont non satisfaits, chez la souris dans des modèles orthotopiques (i.e. injection de cellules cancéreuses au site correspondant à celui de la tumeur d’origine). Pour ces modèles, des cellules cancéreuses soit d’origine murine (syngénique) soit d’origine humaine (xénogreffe) seront inoculées à l’animal par voie systémique (i.e. intraveineuse ou intrapéritonéale). En fonction des cellules injectées, des souris immunocompétentes, immunodéficientes ou humanisées pour le système immunitaire seront utilisées. Les études consistent à administrer le ou les composé(s) à potentiel thérapeutique à des souris porteuses de tumeur, puis à mesurer l’évolution du cancer, les niveaux de biomarqueurs, les concentrations sanguines et/ou tissulaires du composé d’intérêt. Les mesures de concentrations du composé permettront d’établir un modèle entre la pharmacodynamie et pharmacocinétique du composé, indispensable pour la détermination des doses à utiliser dans les études d’efficacité, de toxicologie réglementaire et enfin de prédire les doses des phases de preuve de concept en développement clinique chez l’homme. Le suivi de l’évolution du cancer permettra d’évaluer l’efficacité du ou des composé(s). Celui-ci sera réalisé par imagerie non-invasive de bioluminescence sur animal anesthésié ou par cytométrie en flux sur des échantillons sanguins (prélèvement non terminal). Des prélèvements tissulaires post-mortem pourront être réalisés pour des analyses ex vivo complémentaires : histologiques, par cytométrie en flux…
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les leucémies sont des cancers du sang qui ne touchent pas seulement les enfants, mais également les adultes. Il existe plusieurs types de leucémie. La classification se fait selon la rapidité d’évolution de la maladie (aiguë ou chronique) et selon les cellules souches de la moelle osseuse à partir desquelles elle se développe (myéloïdes ou lymphoïdes). Toutes les leucémies prennent naissance dans la moelle osseuse et se caractérisent par une prolifération incontrôlée des cellules. Cette surproduction de globules blancs anormaux envahit la moelle osseuse, empêche les globules blancs normaux d’arriver à leur maturité pour assurer leur rôle. Les globules blancs anormaux finissent par se déverser dans le sang au détriment des globules blancs normaux. Environ 9 000 personnes sont touchées chaque année en France. Les leucémies représentent 29 % des cas de cancer diagnostiqués chez les moins de 15 ans et 14 % des cancers qui se développent à l’adolescence selon l’Institut National du Cancer. La proportion de personnes atteintes dans la population mondiale est de 1 à 2 cas pour 100 000 personnes. Si ces pathologies sont de mieux en mieux prises en charge, elles restent dévastatrices. En effet, selon leur type, les leucémies ne constituent pas un cancer de bon pronostic. La survie des leucémies aiguës est basse (survie de 19% pour les leucémies aiguës myéloïdes à 5 ans). Ce qui souligne l’inefficacité des traitements actuels et la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Les procédures qui constituent ce projet s’inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. A plus long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l’Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les gestes techniques concernant tous les animaux : • Tatouage (1 fois ; 2 min) sur animal vigile • Injection des cellules leucémiques (1 fois) sur l’animal vigile par injection intrapéritonéale (30 sec) ou intraveineuse via la veine caudale (30 sec) ou sur l’animal anesthésié par inhalation d’anesthésique gazeux par voie intraveineuse via le sinus rétro-orbital (30 sec) • Pesée (maximum 1 fois par jour sur la durée du protocole ; 30 sec) sur animal vigile. Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Administration intrapéritonéale (maximum 1 fois par jour sur la durée du protocole ; 30 sec) sur animal vigile • Suivi de la croissance tumorale par bioluminescence (maximum 3 fois par semaine sur la durée du protocole ; 15 min à 1h) sur animal anesthésié par inhalation d’d’anesthésique gazeux • Prélèvements de sang (30 sec) : la fréquence dépendra là encore des demandes clients mais elle sera adaptée en fonction du volume prélevé en accord la législation en vigueur Les sites seront la veine submandibulaire sur animal anesthésié par anesthésie gazeuse, ou veine caudale, ou amputation unique de la queue (coupe 1 à 2 mm sur l’extrémité non innervée de la queue) sur animal vigile. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique : la fréquence dépendra là encore des demandes clients mais elle sera en accord avec la législation en vigueur. Les voies envisagées sur animal vigile seront les voies (30 sec) : per os, intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse via la veine caudale ou intramusculaire. Les voies possibles sur animal anesthésié par inhalation d’anesthésique gazeux seront intradermique (1 min) ou intraveineuse via le sinus rétro-orbital (30 sec).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Ces modèles peuvent engendrer une dégradation de l’état de santé de l’animal pouvant se traduire principalement par une diminution de l’activité motrice mais peuvent aussi également survenir une respiration difficile, une perte de poids, une pilo-érection et/une altération des fonctions normales (impossibilité de s’alimenter). Ces effets apparaissent potentiellement au fur et à mesure de l’évolution de la leucémie. Les animaux peuvent être également soumis à des anesthésies répétées ce qui peut constituer une nuisance.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des études afin notamment de prélever des organes d’intérêts qui feront l’objet d’analyses (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques …). Les modèles décrits ne permettent pas la réutilisation des animaux.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Principalement 2 approches sont utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basée sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux de laboratoire, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les modèles in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorales. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.
2. Réduction
L’évolution de la leucémie sera suivie au cours du temps par imagerie de bioluminescence ou prélèvement sanguin non-terminal. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal simplement anesthésié, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, d’une manière générale, les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in sillico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex : un récepteur, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base principalement sur les données de la littérature et peuvent également se baser sur les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux.
3. Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards règlementaires de la directive n°2010/63/UE. Les locaux d’hébergement font l’objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d’hébergement et d’animaux sentinelles. Les animaux seront groupés sans des cages contenant de l’enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire. Les procédures générant inconfort ou stress se feront systématiquement sous anesthésie. En cas d’apparition de signe de douleur, un analgésique adapté est donné par voie SC ou en gel alimentaire pour couvrir une période de 24 h. Si les signes devaient perdurer ou si l’utilisation de l’analgésique n’est pas possible (interaction médicamenteuse pour les animaux sous traitement), l’animal serait euthanasié. Au fur et à mesure des données collectées, des points limites prédictifs et spécifiques pour chaque modèle seront définis basés sur l’intensité de bioluminescence et/ou le % des cellules leucémiques et/ou normales. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Une fiche de suivi des signes cliniques a été mise en place. Elle permet d’établir un score pour évaluer l’état général de l’animal et en fonction du total des scores des mesures sont appliquées. Ainsi, à partir d’un total de 2, les gavages seront suspendus (si applicable), à partir d’un score de 4, un suivi vétérinaire sera mis en place avec une surveillance renforcée des animaux et des mesures complémentaires seraient prises telles que aliment humide au sol, ajout d’enrichissement… et à partir d’un total de 6, l’animal sera euthanasié. De plus, si un animal atteint un des points limite établis, il sera immédiatement euthanasié.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. Des données sur les modèles de leucémie chez la souris existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références etc.). La souris est un modèle d’étude de choix car : 1/ sa petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (ou plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie), et 2/ la biodisponibilité des souris immunodéficientes (nécessaires pour l’utilisation de cellules humaines). Adulte : les données de la littérature indiquent clairement que les rongeurs adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine du cancer.