Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 17/01/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-739693)
243 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent en sous-cutané un biomatériau libérant du glucose, sont suivies par imagerie sous anesthésie répétée, et 80 d’entre elles subissent une thoracotomie pour visualiser les vaisseaux, avant mise à mort à des temps échelonnés jusqu’à huit semaines. Le porteur indique que la chirurgie d’implantation peut entraîner douleur, stress et infection, et que la taille de certains implants peut gêner l’animal. Il affirme qu’aucun modèle in silico ou in vitro ne reproduit l’environnement complexe de l’implantation et vise à terme une alternative aux autogreffes osseuses.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif du projet est de limiter la mort des cellules souches post-implantation dans le cas des défauts osseux dont la taille est trop importante pour permettre une réparation osseuse spontanée (défaut osseux de taille critique). Les autogreffes osseuses où le greffon est prélevé directement sur le patient sont la référence clinique. Cependant, ces greffons présentent des inconvénients tels que le recours à une deuxième chirurgie, et une quantité et qualité osseuses limitées. Une alternative développée est donc d’implanter des cellules souches dans le défaut osseux afin qu’elles induisent la formation osseuse soit en se différenciant en cellules osseuses soit en attirant les cellules osseuses environnantes. Malgré des résultats prometteurs, la réparation osseuse reste moins efficace qu’avec de l’autogreffe, à cause de la mort massive des cellules souches implantées (90%) observée lors des 15 premiers jours post-implantation. En effet, l’environnement dans lequel sont implantées les cellules souches est très peu vascularisé et caractérisé par un manque d’oxygène, de glucose et une accumulation de déchets métaboliques. Au laboratoire, nous avons démontré que le manque de glucose était le facteur responsable de cette mort cellulaire. L’objectif de ce projet est donc de limiter la mort des cellules souches transplantées afin de pouvoir augmenter leur contribution à la réparation du tissu lésé et à terme de remplacer les autogreffes. La stratégie développée par le laboratoire consiste donc à placer les cellules dans un biomatériau leur fournissant du glucose en quantité suffisante jusqu’à revascularisation du tissu. Le biomatériau comprend de l’amidon et une enzyme. Le glucose est ainsi fourni par dégradation de l’amidon sous l’action de l’enzyme. La preuve de concept de cette stratégie a déjà été établie in vitro et in vivo sur des temps courts, sans permettre cependant une survie cellulaire à long terme (28 jours). Une 2e version du biomatériau a donc été développée afin d’assurer une libération de glucose sur des temps plus longs. L’enzyme est cette fois-ci encapsulée dans des microparticules afin de ralentir sa libération et donc son effet sur l’amidon. Après une série de tests in vitro démontrant une survie des cellules souches sur du plus long terme, nous devons maintenant valider l’intérêt de cette 2e version du biomatériau sur la viabilité et fonctionnalité des cellules souches in vivo.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ces expérimentations permettront dans un premier temps de tester la capacité de notre biomatériau d’assurer la survie des cellules souches transplantées dans un environnement physiologiquement pertinent et plus complexe que ce que permettent les études in vitro. Des résultats positifs permettraient de poursuivre les études en implantant cette fois-ci le biomatériau au sein d’un défaut osseux de taillle critique (chez la brebis, par exemple). L’objectif à long terme est ainsi de proposer une alternative aux greffes osseuses autologues qui présentent des limites comme le volume prélevable du greffon, sa qualité lorsqu’il s’agit de patients âgés ainsi que la nécessité d’avoir recours à un 2e site chirurgical. De plus, dans un cadre plus général d’ingénierie tissulaire ou de thérapie cellulaire, ce projet apportera une réponse au problème majeure que pose la mort massive de cellules transplantées qui sont confrontées à des conditions d’ischémie (transplantation de neurones dopaminergique pour Parkinson, transplantation de cellules souches pour les infarctus du myocarde).
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Pour tous les animaux (243 souris) : Mise en place des biomatériaux en sous cutané sous anesthésie générale et antalgie (1x, durée 20-30 min). Pour les animaux de l’étude 1 (43 souris) : Acquisition du signal fluorescent sous anesthésie générale gazeuse (8x, durée 5min, sur 4 semaines). Mise à mort des animaux au temps terminal de l’étude par anesthésie gazeuse suivie d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min). Pour les animaux de l’étude 2 (100 souris) : Acquisition du signal bioluminescent sous anesthésie générale gazeuse (5x, durée 2x5min, sur 4 semaines). Mise à mort des animaux au temps terminal de l’étude par anesthésie gazeuse suivie d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min). Pour les animaux de l’étude 3 (80 souris) : Infiltration du réseau vasculaire par un agent radio-opaque par thoracotomie sous anesthésie générale et antalgie (1X, durée 30 min). Pour les animaux de l’étude 4 (20 souris) : Mise à mort des animaux au temps terminal de l’étude par anesthésie gazeuse suivie d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min). .
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La chirurgie d’implantation en sous-cutané peut entraîner de la douleur et du stress chez l’animal. Une autre complication éventuelle est l’infection cutanée. Enfin, la taille de certains implants peut entraîner une gêne de l’animal. Les anésthésies (gaz anesthésiant) nécessaires à l’imagerie non invasive en fluorescence et en bioluminescence vont entrainer du stress au moment de la contention et de la perte de conscience. Les animaux subiront également plusieurs injections sous-cutanées pour la gestion de la douleur, l’anesthésie et l’imagerie en bioluminescence.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Après implantation, suivi par fluométrie ou par bioluminescence, les animaux impliqués dans les procédures 2 et 3 seront mis à mort au temps terminal prévu (4 semaines) afin de pouvoir explanter les biomatériaux et approfondir les résultats par des analyses histologiques ou histochimiques. Tous les animaux concernés par la procédure 4 seront mis à mort suivant des temps prédéfinis (1, 2, 3 et 4 semaines) afin de suivre la formation des vaisseaux sanguins au cours du temps, car la visualisation des vaisseaux sanguins par agent de contraste nécessite la mise à mort de l’animal. Les animaux de la procédure 1 non impliqués dans les procédures 2,3 et 4 seront mis à mort à 4 et 8 semaines afin de pouvoir explanter les biomatériaux et quantifier la formation osseuse par examen radiologique de l’explant.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’environnement post-implantatoire choisi est un milieu très peu vascularisé et complexe dont de nombreux facteurs (pH, oxygène, osmolarité, etc.) peuvent affecter la survie et la fonctionnalité des cellules implantées. Bien que certains de ces facteurs soient bien caractérisés (oxygène) d’autres n’ont pas ou peu étaient explorés (glucose, pH, etc.). Il n’est donc pas possible à ce jour de reproduire cet environnement post-implantatoire dans des modèles in silico ou in vitro. De plus, de nombreuses intéractions cellulaires (avec les cellules vasculaires ou les cellules de l’inflammation, par exemple) et moléculaires (par sécrétion d’alarmine, d’hormones ou de facteurs de croissance) peuvent également affecter le devenir des cellules implantées. Bien que des modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des intéractions cellules-cellules, ils n’incluent que 2 ou 3 intéractions (cellules souches/macrophages, par exemple) et ne capturent pas toute la complexité moléculaire et cellulaire de l’environnement post-implantatoire. Pour toutes ces raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la survie des cellules stromales mésenchymateuses en vue d’une réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.
2. Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, les études 1 et 2 seront des études de suivi longitudinal : les mêmes animaux seront imagés au cours du temps (et non un animal/temps). L’étude 1 permettra de sélectionner les groupes dans lesquels l’enzyme restera sur site d’implantation au moins 7 jours sans fuir hors du site. Ces groupes sélectionnés seront donc ensuite utilisés pour l’étude 2. Pour les études 3 et 4, seuls 2 profils sélectionnnés lors de l’étude 2 seront utilisés. Il s’agit du profil permettant la survie cellulaire la plus longue et du profil présentant une augmentation de la population cellulaire en début d’implantation. De plus, la comparaison avec le biomatériau de 1ère génération se fera en se basant sur les résultats historiques des études précédemment réalisées au laboratoire. En prenant en compte les variations de résultats observées dans nos études in vivo précédentes en site sous-cutané, nous affecterons 10 implants/groupe afin d’avoir un pouvoir statistique suffisant. Pour les analyses, un test statistique (test paramétrique) sera utilisé afin d’étudier l’effet de la composition des biomatériaux, l’impact de la durée d’implantation et leurs intéractions.
3. Raffinement
Une période d’acclimatation et de désensibilisation de 7 jours sera accordée aux animaux avant leur entrée dans le protocole expérimental. La souffrance liée à l’implantation sous-cutanée sera limitée par analgésie pré- et post-opératoire toutes les 12 heures pendant 24h. Un gel nutritif sera ajouté lors des 3 premiers jours post-opératoires pour faciliter la prise de nourriture et l’hydratation des animaux. Suite à la procédure chirurgicale, des points surveillés et scorés sur le comportement, l’aspect général (perte de poids) et les signes cliniques spécifiques à l’acte chirurgical (infection du site d’implantation) permettront d’objectiver la douleur ou la gêne de l’animal deux fois par jour pendant les 3 premiers jours post-opératoires, puis deux fois par semaine jusqu’aux points terminaux. En cas de manifestations douloureuses et/ou d’inconfort l’analgésie sera augmentée ou prolongée. Si ces manifestations sont réfractaires aux soins adaptés et/ou si le score des points surveillés dépasse le seuil limite défini en amont du projet, l’animal sera retiré de l’étude. Pour les protocoles d’imagerie non invasifs, les souris seront anesthésiées par voie gazeuse puis installées dans la chambre d’imagerie pour acquérir le signal fluorescent ou bioluminescent in vivo. Lors de ces acquisitions, les souris seront maintenues sous anesthésie au masque. Un gel oculaire sera appliqué pour éviter un éventuel déssèchement occulaire.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle animal choisi est la souris immunodéficiente non consanguine. Le modèle souris est le mieux connu en termes de caractérisation génétique et immunologique. De plus, la fine épaisseur de la peau murine atténuant peu le signal, ce modèle permet d’utiliser des appareils d’imagerie non invasive, tel que la fluorescence ou la bioluminescence, pour un suivi longitudinal des implants. L’utilisation de souris immunodéficientes permet d’éviter une réaction immunitaire averse (rejet) lors de greffes d’origine humaine et ainsi d’évaluer le potentiel de cellules d’origine humaine. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes de 10 semaines pour avoir des animaux entre 25 et 30 g et qui permettent d’avoir un potentiel de néovascularisation et de néoformation osseuse optimal.