Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 17/01/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-862486)
117 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées et, pour une partie, une fenêtre d’observation implantée dans l’abdomen suivie de séances d’imagerie de deux heures sous anesthésie. Le porteur indique que la pose de la fenêtre et la perte de perméabilité intestinale peuvent provoquer douleur, perte de poids, diarrhée et déshydratation, toutes les souris étant tuées pour analyses. Il présente les retombées, sur le syndrome du côlon irritable ou la maladie cœliaque, comme des applications potentielles à long terme d’une recherche avant tout fondamentale.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’intestin joue un rôle essentiel dans l’absorption des nutriments qui proviennent de notre alimentation. Aussi, du fait de son contact direct avec l’environnement, il est susceptible d’être soumis à des attaques bactériennes et biochimiques qui peuvent compromettre l’étanchéité de la barrière intestinale. Cette barrière est formée par une unique couche de cellules, cellules épithéliales, qui tapissent l’intestin. Pour maintenir l’intégrité du tissu, l’ensemble de l’épithélium est remplacé en 3 à 5 jours (chez la souris). Ce renouvellement est permis par la division des cellules souches qui se trouvent dans des invaginations du tissus appelées cryptes. À la sortie des cryptes, les cellules se différencient en cellules épithéliales (sécrétoires, absorbantes, et entéroendocrines). L’intestin est un bon modèle d’étude de la migration cellulaire car les cellules différenciées vont ensuite migrer pour enfin être éliminées dans la lumière intestinale. L’objectif général est de comprendre les processus physiologiques au niveau du tractus gastro-intestinal.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Nous pensons identifier un nouveau mode de régulation du colon. Nous prévoyons aussi que notre projet contribue à expliquer comment la barrière intestinale est maintenue intacte. En général, notre étude sera bénéfique pour la communauté scientifique intéressée par l’intestin. Les avantages à long terme seront de mieux comprendre comment l’intégrité de la barrière intestinale est maintenue, avec des potentielles applications pour des pathologies comme le syndrome du côlon irritable ou la maladie cœliaque.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Une premier lot d’animaux recevra une injection d’un produit non douloureux dans l’abdomen à raison d’une fois par jour pendant 1 à 5 jours (durée du geste inférieure à 10 sec). Alternativement, de 2 h jusqu’à 72 h avant la mise à mort, les souris recevront une unique injection d’un produit non douloureux dans l’abdomen (durée du geste inférieure à 10 sec) Dans un second lot, les souris recevront une injection d’un produit non douloureux dans l’abdomen à raison d’une fois par jour pendant 1 à 5 jours (durée du geste inférieure à 10 sec) et seront mises à mort après un jour de repos. Enfin un dernier lot d’animaux recevra une injection d’un produit non douloureux dans l’abdomen à raison d’une fois par jour pendant 1 à 5 jours (durée du geste inférieure à 10 sec). Nous implanterons ensuite une fenêtre abdominale sur les souris anesthésiée (durée du geste 20 minutes) pour réaliser des sessions d’imagerie sur souris anesthésiées (durée d’imagerie 120 minutes par jour, pendant 2-3 jours).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Suites aux interventions subies par les animaux, des conséquences directes et courtes sont à prévoir : – Douleur liée à l’injection intrapéritonéale – Stress lié à la contention pour l’injection intrapéritonéale Suites aux interventions subies par les animaux, des conséquences indirectes et longues (i.e. jusqu’à la mise à mort sont à prévoir : – Douleur, perte de poids, inflammation à la suite de la pose d’une fenêtre d’observation – Douleur, perte de poids, diarrhée, déshydratation et/ou constipation liées à la perte de perméabilité de l’intestin
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’intestin est un organe complexe qui implique de nombreux composants : bactéries, circulations sanguine et lymphatique, neurones, muscles, système immunitaire etc. Les objectifs de ce projet étant d’identifier le mode de fonctionnement du tissu ainsi que le maintien de son intégrité. La réduction à un système in vitro pourrait nous affranchir de découvertes pertinentes qui seraient liées à la complexité des interactions présentes dans l’intestin. Par exemple, comme la perturbation de l’étanchéité intestinale peut avoir des conséquences sur le système immunitaire, notre projet est étudiable seulement grâce à des études in vivo, impossible à remplacer par des approches in vitro. Cependant, certains aspects liés à l’intégrité de la barrière intestinale pourraient être explorés in vitro. À cette fin, nous générerons des organoïdes qui permettront de réduire le nombre de souris utilisées . De plus, nous utiliserons des méthodes substitutives partielles comme des explants de tissu observés ex vivo.
2. Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est ajusté au plus bas mais compatible avec l’obtention de résultats statistiquement fiables, soit entre 3 et 5 souris par expérience . Tous les animaux, quel que soit leur génotype et leur sexe seront utilisés, ce qui permet d’avoir à la fois des animaux contrôles et des animaux d’intérêts. Pour réduire la variabilité de l’échantillon, nous utiliserons autant que possible des compagnons de portée. Des expériences pilotes seront réalisées afin d’optimiser le niveau de perte d’adhésion entre les cellules épithéliales et la membrane basale. Ces expériences utiliseront des animaux des deux sexes et les tissus extraits seront utilisés à la fois pour l’histologie et l’extraction de protéines afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les croisements de souris seront optimisés pour produire tous les génotypes. Nous produirons un stock d’organoïdes à partir des mêmes souris pour les études in vitro de fonctionnalisation. Ces organoïdes peuvent être étendus, presque indéfiniment, afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet et ainsi optimiser le nombre d’animaux. La prolifération et la migration des cellules seront étudiées dans la même souris. Ces souris seront également utilisées pour l’histologie et l’immunofluorescence. Cela permettra de réduire le nombre de souris nécessaires pour ces procédures. Notre analyse post-mortem sera faite à l’aveugle, ce qui assure l’impartialité des résultats obtenus.
3. Raffinement
– Pour les injections d’un produit non douloureux dans l’abdomen, une surveillance sera mise en place tous les jours jusqu’à la récupération post-mortem des tissus. Durant cette période, la mise au point de points limites permettra la détection de signes précoces de détresse ou de mal être avant que cela n’impacte les souris ou le projet. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point limite, les animaux seront mis à mort – Pour la chirurgie, une gestion de l’analgésie-anesthésie est mise en place : les souris recevront des analgésiques en préopératoire ainsi que des anti-inflammatoires après la chirurgie. Nous utiliserons une anesthésie générale gazeuse. Durant le temps de la procédure nécessitant une anesthésie, un gel lacrymal empêchera le dessèchement oculaire et l’animal sera maintenu sur un coussin chauffant ou une chambre chauffante de manière à maintenir la température corporelle dans les constantes normales. L’animal est ensuite transféré dans une cage isolée (afin d’éviter toute lésion par une autre souris) et placée sur un tapis chauffant jusqu’à son réveil. De l’anti-inflammatoire sera ajouté à l’eau de boisson. Les animaux seront surveillés de près et mis à mort dès l’atteinte d’un point limite tel que décrit dans la grille de score.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris de laboratoire est largement utilisée car ce modèle apporte plusieurs avantages : la maîtrise de son élevage, sa reproduction facile et rapide qui permet l’obtention de cohortes d’animaux d’un génotype approprié, la relative facilitée de modification génétique. De plus, les bases de données d’expression de la souris, les lignées de souris et les protocoles déjà établis permettraient d’étendre facilement ce projet à l’avenir en utilisant des modèles déjà existants, ou de comparer les résultats du projet à différents ensembles de données provenant d’autres projets. Par ailleurs, la souris est très proche de l’Homme au niveau génétique mais aussi métabolique et immunitaire, c’est donc un excellent modèle d’étude de perméabilité intestinale ainsi que migration cellulaire, la structure de l’intestin étant similaire à celle de l’Homme. Des animaux adultes seront utilisés car nous somme intéressé par la migration cellulaire et les jonctions inter-cellulaires dans des processus physiologiques, lorsque le développement de l’animal est terminé.