Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-04-05 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-546546)
370 rats vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacun subissant soit quatre membranes artificielles implantées sous la peau du dos, soit une perte de substance créée dans le fémur et fixée par une plaque vissée. Trente rats pour la première phase, cent dix pour la deuxième, deux cent trente pour la troisième. Après l’opération, ils sont placés seuls en cage jusqu’à sept jours, le temps que la douleur et la boiterie s’atténuent, et le porteur prévoit une hyperthermie possible par infection, une perte de poids et des anomalies de cicatrisation pendant une quinzaine de jours. Les bénéfices décrits concernent des patients humains, une seule chirurgie au lieu de deux et un retour plus rapide au travail, quand l’atteinte porte, elle, sur des fémurs de rats ouverts puis prélevés.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Note de l'OXA. Cette question est celle du formulaire européen de résumé non technique. Elle est posée au laboratoire qui demande l'autorisation, et sa réponse est écrite avant que la première procédure commence (arrêté du 1er février 2013, art. 5). Ces objectifs servent à justifier l'utilisation des animaux devant le comité d'éthique. Aucun document public ne dira ensuite s'ils ont été atteints : la directive permet aux États de faire mettre à jour le résumé avec les résultats de l'appréciation rétrospective (directive 2010/63/UE, art. 43), la base européenne prévoit de les recevoir, et aucune entrée française n'en porte (base ALURES).
La gestion des pertes de substances osseuses critiques (supérieur à 5 cm) est une préoccupation quasi quotidienne en chirurgie orthopédique et traumatologique. Elle peut être prise en charge par la technique de la « membrane induite ». Cette technique consiste à placer une entretoise en ciment (PMMA ou polymethylmetacrylate) dans la zone de perte de substance osseuse. Une réaction autour du ciment permet la formation d’une membrane (en 2 à 3 mois environ) qui servira de réceptacle à une autogreffe osseuse prélevée sur le patient. Malgré les avancées permises par cette technique, il s’agit d’une procédure nécessitant le développement de cette membrane dans un délai assez long, requérant donc 2 interventions, retardant tout autant la récupération de l’autonomie du patient. De plus, la qualité de la membrane induite par l’organisme reste variable et dépendante du patient (âge, fumeur, comorbidités…), elle est hélas parfois quasi inexistante, friable et fragile, limitant les chances de succès et entraînant donc d’autres procédures chirurgicales plus agressives. L’immobilisation du patient et la mise en décharge plusieurs semaines présente des conséquences physiques lourdes à savoir : Amyotrophie, enraidissement articulaire mais aussi des conséquences socio-économiques avec une hospitalisation à deux reprises, souvent supérieures à 48-72h et un retard au retour aux activités personnelles et professionnelles (coût social de la perte d’activité). Ainsi, l’objectif de ce projet est d’être dans la mesure d’évaluer in vivo de membranes artificielles synthétiques, implantables, autorisant une consolidation osseuse en une chirurgie tout en ayant une maniabilité compatible avec le terrain chirurgical orthopédique et traumatologique. Ces membranes artificielles auront pour rôle d’être un soutien à la formation de la membrane induite naturellement par le corps mais également de servir de soutien à la greffe osseuse qui serait réalisée en un seul temps opératoire, optimisant donc la technique initiale sur les plans orthopédiques, rééducatifs mais aussi socio-économiques pour les patients.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Note de l'OXA. Le formulaire européen demande les bénéfices « susceptibles de découler » du projet. Il appelle donc une projection, et il l'obtient : ce que le laboratoire écrit ici est ce qu'il espère, avant d'avoir commencé. Deux chercheuses ont repris six corpus d'études précliniques déjà menées et pesé les dommages réellement infligés aux animaux contre les bénéfices cliniques réellement obtenus : moins de 7 % de ces études ressortaient défendables (Pound et Nicol, 2018).
Les bénéfices attendus de ce projet sont les suivants : – Limiter les échecs de la technique de la membrane induite dans sa forme actuelle en implantant un dispositif artificiel permettant de soutenir la formation de cette membrane induite, qui aurait donc des caractéristiques plus propices à la consolidation osseuse. – Limiter le nombre de chirurgies : en effet, il est impossible chez l’homme et chez l’animal de simplement greffer de l’os lorsque la perte osseuse est trop importante, cela résulte en une résorption du greffon et donc en un échec de la technique. Implanter une membrane artificielle aux propriétés supérieures permettrait de surseoir au temps de formation de la membrane induite, réduisant la chirurgie en 1 seul temps au lieu de 2. – Retirer le temps de formation de la membrane. Chez le rat, cette membrane se forme en 4 semaines mais chez l’homme celle-ci se forme en minimum 6 semaines (conditions idéales du jeune homme sans comorbidités) voire plusieurs mois (en moyenne 3 mois). Ce temps de formation chez l’homme, très long, limite grandement les capacités de mobilisation du membre concerné et donc la rééducation (avec pour conséquence une perte de musculature, un enraidissement articulaire), la reprise des activités professionnelles et personnelles. Les matériaux employés par les membranes artificielles ont pour objectif de maintenir l’autogreffe viable en 1 seul temps chirurgical, le temps d’obtenir une une consolidation osseuse indépendamment de la formation de la membrane induite et donc des comorbidités des patients et de la gravité de leur affection. – Au final : Limiter le temps d’immobilisation du patient, sa mise en décharge et ses conséquences : Perte musculaire, enraidissement articulaire, limitation des conséquences socio-économiques à savoir une double hospitalisation, souvent d’une durée supérieure à 48-72h, limiter le temps avant retour aux activités professionnelles et personnelles et donc limiter le coût socioéconomique de ces pathologies orthopédiques. – Accélération de la consolidation osseuse : les membranes artificielles, ayant des caractéristiques angiogéniques et ostéogénique ont pour objectif associé d’obtenir une consolidation du defect dans un délai plus rapide.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Note de l'OXA. La formule « en règle générale » autorise une réponse générale, et c'est l'un des points sur lesquels les examens de qualité trouvent ces documents défaillants. Cruelty Free International a établi en 2018 que les résumés allemands et britanniques, les seuls examinés à ce jour, décrivaient mal ce qui est fait aux animaux et ce que ceux-ci pourraient éprouver (Taylor et al., 2018). L'adoption d'un modèle commun européen a nettement amélioré le premier point, à peine le second (Taylor et al., 2024).
Le nombre d’animaux se base sur une analyse de la littérature sur les mêmes modèles de defect femoral et d’implantation sous-cutanées du rat. La première phase du projet requiert 30 rats, la seconde 110 et la 3ème 230 (au maximum). Les résultats des matériaux étudiés permettront d’ajuster le nombre de rats nécessaires à l’étape 2 puis 3. La première phase consistera en l’implantation sous-cutanée de 4 membranes artificielles dans le dos des rats. Il s’agit de l’unique procédure chirurgicale réalisée par rat. L’objectif principal sera d’évaluer la capacité des matériaux à générer une membrane au propriétés histologiques supérieures à celle produite dans les groupes contrôles. Cette étape est la moins agressive et permettra de diminuer les nuisances animales. Le temps chirurgical est de 30 minutes pour les 4 implantations par rat. Pour la 2ème phase de l’étude, le groupe contrôle comportera 10 rats et 10 groupes de matériaux maximum seront analysés. L’objectif principal sera d’évaluer la capacité des matériaux à produire une membrane aux propriétés histologiques supérieures à celles produites dans le groupe contrôle. Une seule procédure sera réalisée par rat : la création d’un defect osseux fémoral et une stabilisation par plaque vissée (ostéosynthèse). Cela autorisera un appui sur le membre opéré juste après l’intervention. Cette procédure sera réalisée en 1h. Pour la 3ème phase de l’étude, une groupe contrôle de 15 rats sera requis et chaque groupe d’étude comportera 10 rats (10 groups maximum). L’objectif est d’étudier la consolidation en présence des membranes d’interêt comparé à la technique habituelle. L’analyse se fera à 2 points temporels différents. Le groupe contrôle comportera 15 rat car ce groupe requierts 2 chirurgies, augmentant le risque de complications. Cela correspond à ce qui est réalisé chez l’homme (temps de formation de la membrane induite autour du ciment). La greffe osseuse sera réalisée au cours de la 2nd chirurgie, 4 semaines plus tard. Les groupes d’étude ne comporteront qu’une seule chirurgie car il s’agit d’un des objectifs majeurs de ce projet (1 seul temps chirurgical). La greffe osseuse osseuse sera prelevée lors du même temps chirurgical et consistera au prélèvement de 2 à 3 vertèbres de la queue du rat, fragmentées et intégrées au defect osseux fémoral. La chirurgie est réalisée en 1h. Toutes ces chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale (gazeuse) associée à une analgésie multimodale.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Note de l'OXA. C'est l'endroit du document où les animaux devraient apparaître, et c'est celui qui résiste. Cruelty Free Europe a mesuré en 2024 que cinq des six éléments attendus sur les dommages prévus progressaient depuis l'adoption d'un modèle commun européen. Les effets indésirables sont le sixième : 41 % des résumés allemands et 48 % des britanniques les décrivent complètement. Les auteurs relèvent aussi des effets présentés comme minimes sur des projets classés modérés ou sévères (Taylor et al., 2024). Ces deux pays sont les seuls dont les résumés ont été examinés. Les résumés français relèvent du même modèle européen, et leur qualité n'a jamais été mesurée.
Le projet est pourvoyeur de plusieurs nuisances et effets indésirables qui seront recherchés, anticipés et traités en cas d’apparition. En premier lieu, plusieurs données générales seront analysées notamment : – Douleur de palier modéré à sévère étant donné qu’il s’agit d’une chirurgie avec incision cutanée pour la phase 1 et orthopédique avec réalisation d’un defect osseux pour les phases 2 et 3, la douleur est également prévisible et sera surveillée tout au long de l’étude, particulièrement la 1ère semaine post-opératoire. – Hyperthermie : pouvant être due à une infection post-opératoire, ce risque est présent au moins les 15 premiers jours, le temps de la cicatrisation cutanée. Elle sera recherchée par la mesure de la température de l’animal. – Perte de poids : par douleur et/ou difficulté de mobilisation due à la chirurgie sur le membre inférieur de l’animal (phases 2 et 3), entrainant une restriction alimentaire et hydrique, la durée prévisible est 7 jours d’après les modèles retrouvés dans la littérature, les rats retrouvant une mobilité habituelle après ce délai. Elle sera dépistée par la pesée régulière de l’animal. – Anomalie de la cicatrisation cutanée : désunion, saignement, hématome, écoulement suspect (infection), ce risque est présent au moins les 15 premiers jours, le temps de la cicatrisation cutanée. Il sera recherché par l’inspection de la cicatrice en période post-opératoire. – Limitation de la mobilité de l’animal dans les suites opératoires : bien que la chirurgie permette la déambulation, une diminution de la mobilité dans les modèles similaires est observée la première semaine post-opératoire (phases 2 et 3 notamment). – Altération de l’état physiologique par stress postopératoire de l’animal : trouble de la posture, du toilettage, dépilation, durée prévisible de 7 jours post-opératoire. Cela sera limité par la médication antalgique associée à ce protocole de recherche.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Note de l'OXA. Le formulaire demande de justifier ce sort, non de le décrire. L'analyse dommage-avantage que la directive impose au comité d'éthique porte sur « la souffrance, la douleur et l'angoisse » infligées aux animaux (directive 2010/63/UE, art. 38). Quand ce sort est la mise à mort, celle-ci ne figure donc pas parmi les dommages que le comité met en balance avec les bénéfices annoncés. L'OXA écrit « mise à mort » plutôt que « sacrifice », qui emprunte au registre du don consenti, ou « euthanasie », qui désigne une mort décidée dans l'intérêt de celui qui meurt.
A l’issue de chaque étape de ce protocole il sera réalisé une euthanasie car il est nécessaire de prélever les membrane formées et les fémurs opérés pour analyse comparative. Les méthodes d’euthanasie employées seront le surdosage d’anesthésique, réalisé sur animal préalablement sédaté (anesthésie gazeuse) ou l’inhalation de CO2 par incrémentation progressive.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Note de l'OXA. La directive demande au résumé « une démonstration de la conformité » aux exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (directive 2010/63/UE, art. 43). C'est donc le demandeur qui démontre sa propre conformité, dans le document même qui sollicite l'autorisation. Cette démonstration peut prendre la forme d'une affirmation qu'aucune méthode de substitution n'existe, que le document n'a pas à sourcer. Ces trois exigences sont par ailleurs subordonnées à l'objectif du projet : elles cherchent à remplacer les animaux dans un projet donné, elles n'interrogent pas ce projet.
Le principe de la membrane induite repose sur la réaction de l’organisme à la présence d’un matériau (le ciment en PMMA) sur le lieu de l’implantation, provoquant une réaction tissulaire à corps étranger, vascularisée et riche en facteurs de croissance. Dans notre travail, différents biomatériaux auront pour vocation à remplacer le PMMA pour optimiser cette réaction. Le but étant de former une membrane « induite » optimisée autour du matériau. Il s’agit d’une réaction complexe mêlant à la fois une réaction immunitaire « à corps étranger », une hypervascularisation locale et une stimulation de la formation d’os sur un organisme vivant. Dans la membrane induite, il est retrouvé des éléments cellulaires de ces 3 lignées (immunitaire, vasculaire et osseuse) avec une différenciation qui a lieu sur plusieurs semaines avant d’obtenir une membrane induite mature. Il n’est pas retrouvé dans la littérature de modèle in vitro, ex vivo ou in silico permettant de reproduire l’ensemble des éléments et des étapes menant à la formation de la membrane induite et cela empêche l’analyse in vitro. La seule analyse préalable, permettant de réduire l’agressivité chirurgicale est l’implantation sous-cutanée, suffisante pour analyse la réaction tissulaire immunitaire et la formation de vaisseaux et limitant drastiquement la sévérité du geste sur l’animal. Néanmoins, avant réalisation des études sur animal, des analyses in vitro de cytotoxicité et cytocompatibilité sur les des cellules osseuses, vasculaires et immunitaires seront menées sur les matériaux sélectionnés pour remplacer le PMMA actuel afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux nécessaires à l’analyse in vivo.
2. Réduction
Note de l'OXA. La réduction dont il est question ici porte sur le nombre d'animaux par groupe expérimental, calculé pour que l'analyse statistique tienne. Le total annoncé dans la fiche est une estimation portant sur une autorisation de cinq ans au maximum (code rural, art. R214-123) : il ne dit pas combien d'animaux seront effectivement utilisés, et il ne se rapporte pas à une année.
La détermination du nombre d’animaux se base sur une analyse de la littérature étudiant le même modèle animal, sur le même sujet d’étude. 5 études d’implantation sous cutanée dans la littérature ont également été analysées. Le nombre moyen d’animaux par matériau analysé était de 10 pour l’implantation osseuse (10 échantillons par groupe). Pour l’analyse en implantation sous-cutanée, 5 échantillons de membrane induite étaient utilisés en moyenne par groupe. Une seule (defect osseux) étude publiée réalisait une analyse de puissance basée sur les résultats histologiques, avec un niveau de puissance de 80% et retrouvait un nombre requis minimal de 8 rats par groupe. En se basant sur ces différentes études et leurs résultats, un nombre de 10 rats par groupe a été sélectionné. La stratégie de réduction s’applique également dans le design de l’étude puisque pour limiter au maximum le nombre d’animaux nécessaires, la première phase consistera à étudier la formation de la membrane induite après implantation sous-cutanée du matériau et la seconde phase après réalisation du defect osseux. L’implantation sous-cutanée permet également d’implanter plusieurs matériaux (jusque 4) sur un seul rat ce qui n’est pas possible en implantation osseuse. L’ensemble des membranes artificielles aura eu préalable une analyse de cytotoxicité et de cytocompatibilité in vitro. Ces analyses ne permettent pas de reproduire le procédé in vivo de formation de la membrane induite qui intègre simultanément des phénomènes immunitaires, vasculaires et osseux. Cependant elle permettra de vérifier sur chaque lignée l’absence de cytotoxicité limitant l’implantation chez l’animal. De même, ce projet est réparti en 3 phases car à l’issue de chaque phase, des résultats inférieurs aux groupes contrôles entraîneraient le retrait du matériau lors des étapes suivantes de l’étude. Cela permettra de sélectionner les matériaux ayant les meilleurs résultats à l’issue de chaque étape tout en limitant l’agressivité chirurgicale des procédures.
3. Raffinement
Note de l'OXA. Le raffinement nomme une amélioration technique de la procédure, sans dire ce qu'elle change pour l'animal qui la subit. La réglementation impose d'atténuer la douleur, dans une limite qu'elle inscrit elle-même : « pour autant que cela soit compatible avec la finalité de la procédure expérimentale » (code rural, art. R214-109). Ce qui reste de souffrance après cette limite est autorisé. Le raffinement ne porte par ailleurs que sur la procédure : les souffrances de la captivité elle-même, confinement, bruit, lumière, manipulations d'entretien, ne relèvent d'aucun des trois R.
En premier lieu les conditions de vie des animaux respecteront un cycle de 12h jour/nuit en alternance. Le milieu de vie sera dans une salle à flux d’air contrôlé, avec une température contrôlée (21°C). Les animaux disposeront d’un accès à l’eau et à l’alimentation à volonté, selon des aliments standards (pas de modifications du régime alimentaire habituel). Le milieu de vie sera enrichi et consistera en un sol dur comportant une litière, disposant de moyens d’exploration et de cachettes (tunnels en cartons par exemple, ou petits dômes en papier maché etc.). Des éléments permettant la nidification seront présents également, (cylindre de coton, carré de cellulose, rondelles de peuplier compressé), enfin des éléments permettant aux rats de ronger seront présent (morceaux de bois). Avant l’intervention, les rats seront placés en cages, avec 3-4 rats par cages afin de respecter leur comportement social. Cependant, après la chirurgie et devant les conditions diminuées de déambulation et de douleur post-opératoire (notamment phases 2 et 3), ils seront placés en cage seuls, pour une durée minimale mais pouvant aller jusqu’à 7 jours. Il s’agit du temps requis avant reprise d’une déambulation habituelle et sans douleur à l’issue de la procédure. Plusieurs éléments seront analysés pour contrôler le bien-être des animaux à savoir : le poids avec mesure bihebdomadaire pendant 7 jours post-opératoire puis une fois par semaine, la température à la recherche d’une hyperthermie, mesurée tous les jours en post-opératoire (recherche d’une infection post-opératoire). Une analyse de la plaie post-opératoire (désunion, saignement, hématome) sera quotidienne les 7 premiers jours postopératoire. Une évaluation quotidienne de la capacité de déambulation de l’animal qui doit progressivement devenir normale en 7 jours pour les phases 2 et 3. Enfin une analyse comportementale sera réalisée notamment la posture, la position des oreilles, l’enfoncement des yeux mais aussi si un manque de toilettage est constaté (à l’aide de l’échelle d’évaluation des expressions faciales du rats, édité par la NC3Rs). Les sources d’eau et de nourriture seront placés à des lieux accessibles à proximité de la zone de repos et stabilisés pour qu’ils ne soient pas renversés facilement.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Note de l'OXA. Le dossier d'autorisation demande de justifier l'origine des animaux, leur espèce, leur nombre estimé et leur stade de développement (arrêté du 1er février 2013, art. 5). La justification attendue est technique : elle porte sur l'adéquation de l'espèce à l'objectif poursuivi. Ce que l'appartenance à une espèce autorise à faire subir à un individu est une question morale, et le formulaire ne la pose pas. L'appartenance à une espèce, prise seule, ne fonde pourtant pas de différence de statut moral entre des individus également capables de souffrir.
L’espèce choisie pour cette étude est le rat. Il s’agit dans la littérature de l’espèce animale la plus utilisée. Dans une revue systématique publié en 2022, 70% (28/40) des études animales évaluant la membrane induite étaient réalisées sur un modèle de rat. Sur ces études sélectionnées et utilisant un defect fémoral (24 études), 20 étaient réalisées sur le rat. Le choix de cette espèce permet donc d’obtenir des résultats comparables avec la littérature. En outre, l’élevage de ces animaux est plus rapide et plus facile, avec des coûts considérablement réduits. Les rats seront à un stade adulte de leur développement, correspondant à 10 semaines de vie avec un poids de 400-450 gr. Cela correspond à l’âge d’un humain adulte d’environ 18 ans. En effet, la technique de la membrane induite est le plus fréquemment utilisée chez le jeune adulte dans le cadre d’accidents à haute cinétique de la voie publique (moto, voiture etc.). De plus, l’utilisation des moyens d’ostéosynthèse chez des rats non matures et plus jeunes expose à des difficultés techniques matérielles (moyen d’ostéosynthèse non adapté à la taille des fémurs de rats plus jeunes).