Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 05/06/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-504439)
La restriction hydrique s’arrête quand le poids descend sous 85 % de celui mesuré avant privation, seuil vérifié deux fois par jour. 812 souris et 568 rats sont privés d’eau pour être poussés à chercher des gouttes, 428 d’entre eux dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les autres un niveau modéré. Une partie subit des lésions excitotoxiques du striatum par une chirurgie de une à deux heures, qui provoquent une hypophagie de 24 à 48 heures, ou des injections de virus dans le cerveau suivies de une à quatre injections de CNO, et les rats courent sur tapis roulant pour accéder aux récompenses. Tous sont tués pour examen histologique du cerveau, le porteur affirmant qu’il n’existe pas d’alternative non animale tout en construisant des modèles mathématiques qui simulent leur comportement.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Dans leur vie quotidienne, les humains et de nombreux autres animaux sont continuellement confrontés au dilemme d’effectuer/optimaliser des actions qui conduisent à l’obtention de récompenses (exploiter) ou de naviguer plus aléatoirement dans leur environnement pour acquérir de nouvelles connaissances sur des sources de récompenses alternatives, au risque de perdre du temps et de l’énergie (explorer). La compréhension des mécanismes qui contrôlent ce compromis entre exploitation et exploration est lacunaire, à la fois au niveau comportemental (quels sont les paramètres qui contraignent le comportement exploratoire versus exploitatif des animaux et quels aspects de leur comportement sont modulés) et des circuits neuronaux impliqués. Le but de ce projet est donc double. Tout d’abord, il sera de mieux caractériser le comportement d’exploration et d’exploitation de souris et de rats dans des situations expérimentales relativement éthologiques (compte tenu des contraintes associées aux expériences en laboratoire). Dans ce projet nous proposons de développer deux nouvelles tâches dites de « foraging » dans lesquelles des rongeurs doivent adapter leur balance d’exploration/exploitation (rester ou partir) en réponse à des manipulations de la dynamique des récompenses (timing et quantité) et de l’effort nécessaire pour exploiter et explorer. Ensuite, nous proposons de tester l’hypothèse selon laquelle différentes régions et circuits cellulaires le long de l’axe corticostriatal jouent un rôle clé dans la modulation du compromis entre exploration et exploitation, en contrôlant la sensibilité des animaux au temps et à l’effort. Plus précisément, nous examinerons comment l’activité des neurones de projection du striatum dorsomédian contrôle le comportement exploratoire et est finement régulée par la plasticité des entrées corticales et des circuits inhibiteurs locaux. De même, nous examinerons le rôle des neurones de projection du striatum dorsolatéral dans les phases d’exploitation et leur modulation par la plasticité des entrées corticales et des circuits inhibiteurs locaux.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les mécanismes qui contrôlent les comportements d’exploitation et d’exploration sont généralement mal compris, et pourtant, ils régissent non seulement la manière dont les êtres humains prennent des décisions et dépensent de l’énergie (la leur lorsqu’ils font des efforts physiques et celle produite par la biosphère), mais aussi le fonctionnement de nos sociétés de consommation, qui est actuellement remis en question en raison de la surexploitation de certaines ressources. Notre projet sur la souris et le rat n’a pas la prétention d’être directement transférable au comportement humain, mais il semble que certains principes qui gouvernent le compromis entre exploration et exploitation soient communs chez les mammifères, en particulier les notions d’effort et de coût du temps, qui poussent parfois les animaux à gaspiller leur énergie sans bénéfice apparent immédiat et qui favorisent les récompenses immédiates. Ce projet utilise des rongeurs pour pouvoir effectuer des manipulations fines de contraintes comportementales (effort demandé, complexité des décisions, contraintes temporelles) dans des conditions relativement éthologiques. Ces manipulations sont cruciales pour comprendre comment ces contraintes influencent le compromis exploitation/exploration. Ensuite, l’utilisation du rongeur va également nous permettre de pouvoir faire le lien avec des circuits neuronaux qui peuvent être impliqués dans certains comportements pathologiques. En effet, notre équipe s’intéresse au rôle des circuits cortico-striataux dans les prises de décisions et le contrôle moteur, et le dysfonctionnement de ces circuits a été associé non seulement à des pathologies telles que la maladie de Parkinson (qui est caractérisée par un mélange de déficits moteurs et motivationnels) mais aussi à un grand nombre de comportements compulsifs (boulimie, etc.). Notre projet a donc pour objectif de mieux comprendre le fonctionnement d’une région du cerveau impliquée dans un grand nombre de maladies. Enfin, nous développons une approche éthologique du comportement animal qui se fonde sur le comportement de recherche de nourriture (foraging) qui est commun aux rongeurs et aux humains. Le développement de nouveaux tests comportementaux peut déboucher sur une amélioration générale de l’étude et la compréhension du comportement des rongeurs en laboratoire et une meilleure translation des résultats obtenus vers l’être humain.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux vont subir des tests de comportements (foraging). En général les animaux feront 2 à 3 sessions par jour. Pour les souris les sessions durent 10 à 15 minutes. Pour les rats 1h. Les tests de comportements s’étaleront sur plusieurs semaines sans jamais excéder 2 mois chez la souris et 4 mois chez le rat avec des pauses le week-end. Certains animaux vont aussi subir une chirurgie pour réaliser des lésions excitotoxiques. Ces chirurgies dureront entre 1 et 2 heures. Certains animaux vont aussi subir une chirurgie pour injections des virus permettant des expériences de chémo-génétiques (DREADDS). Ces chirurgies dureront environ 1 heure. Pendant les expériences de comportement, ces animaux recevrons des injections IP de CNO pour activer les DREADDS et moduler l’activité des neurones ciblés. Entre 1 et 4 injections (espacées d’au moins 3 jours) seront effectuées en fonction des protocoles et des questions posées .
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La manipulation d’une souris ou d’un rat par un expérimentateur est une source de stress de courte durée. De même, l’exposition à un nouvel environnement est généralement une source de stress passagère. L’utilisation d’un tapis roulant peut également être une source de stress. Les tests de comportement de foraging (recherche de nourriture) que nous développerons sont basés sur la recherche de gouttes d’eau. Pour reproduire les conditions naturelles de foraging, ces tests nécessitent une restriction hydrique, ce qui entraîne inévitablement un stress. Indépendamment de la durée des expériences de comportement, la restriction hydrique sera limitée à 5 jours consécutifs, avec des pauses de 2 jours les week-ends, où les animaux auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. La durée des expériences de comportement variera en fonction des protocoles, entre 2 semaines et 2 mois. Les chirurgies permettant l’injection de virus (manipulations chémogénétiques) seront réalisées sous anesthésie générale profonde (voir détails plus bas) et nécessiteront des traitements pour limiter au maximum les douleurs post-opératoires. Les lésions neurotoxiques du striatum réalisées sous anesthésies générales sont connues pour induire une hypophagie pendant 24 à 48 heures après la chirurgie. Les expériences de manipulations chémogénétiques nécessiteront des injections intra-péritonéales de CNO.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort afin de faire des examens histologiques de leur cerveau. Ces examens sont nécessaires pour quantifier l’expression des virus injectés (procédure #4) et la taille des lesions excitotoxiques (procédure #3 ) lorsque les animaux ont terminé les tests de comportements (procédures #1-2), ainsi que pour vérifier l’absence de malformation anatomique (les 4 procédures). Pour les souris destinées aux expériences d’ électrophysiologie in vitro, la mise à mort est nécéssaire pour prélever le cerveau et réaliser les tranches.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Il n’y a pas d’alternative non-animale pour comprendre les mécanismes contrôlant le compromis exploration/exploitation. Nous allons cependant utiliser des modèles mathématiques pour analyser et simuler le comportement des animaux. Nous pourrons donc tester la validité de ces modèles et les modifier/améliorer. L’avantage des modèles est qu’ils permettent de réaliser des expériences in silico et de limiter le nombre d’animaux (voir ci-dessous). Ils permettent une quantification des données plus rigoureuse.
2. Réduction
Sans résultats préliminaires, il est impossible de prédire la taille des effets et donc le nombre d’animaux. Cependant en utilisant des analyses statistiques non paramétriques et des tests générant des intervalles de confiance (permutation et/ou bootstrap) et en se basant sur nos expériences antérieures, des groupes entre 8 et 20 animaux (moitié mâle, moitié femelle) devraient être largement suffisants. Clairement, nous ne nous attendons pas à ce que tous les animaux se comportent de la même manière. L’utilisation de modèles mathématiques pour capturer le comportement permet de bien caractériser cette variabilité interindividuelle et de faire des analyses de corrélations entre variables neuronales et comportementales. Là encore, un nombre d’animaux compris entre 8 et 20 doit permettre de voir apparaître des tendances de corrélations et le nombre d’animaux sera ajusté (si besoin un avenant sera fait).
3. Raffinement
Stress lié à la manipulation des animaux pendant les tests de comportement. Les animaux seront habitués progressivement à l’expérimentateur. Des sessions de familiarisation à l’environnement sont prévues. Pour les expériences chez le rat, la seule difficulté sera d’entraîner les animaux à traverser ce couloir lorsque le tapis roulant est en marche. Les animaux seront entraînés progressivement en commençant par des vitesses lentes. Le Stress lié à la restriction hydrique sera limité de deux manières. Les animaux recevront une quantité suffisante d’eau tous les jours. La durée et la difficulté des sessions comportementales seront adaptées à leurs besoins hydriques. Le poids des animaux sera vérifié quotidiennement, le matin et le soir, pour garantir qu’il reste stable et ne descende pas en dessous de 85 % du poids de l’animal avant la restriction hydrique. En cas de dépassement de cette limite, les animaux auront accès à de l’eau par leur biberon en quantité ad libitum, et ils ne reprendront les tests que si leur poids est supérieur à 85 % du poids avant la restriction. Pour les animaux subissant des injections intra-cérébrales de virus ou des injections d’agents excitotoxiques , les douleurs seront limitées par une chirurgie sous anesthésie générale, complétée par des antalgiques locaux et des analgésiques pré/post-chirurgie. Les rongeurs seront surveillés très attentivement en postopératoire pendant quelques heures (isolement avec lampe et couverture chauffante). Des injections de buprénorphine seront réalisées, en tenant que leur effet n’excède pas 12h. La cicatrisation et l’état général de ces animaux seront suivis attentivement tous les jours. Les points limites seront respectés si une souffrance est détectée (voir description des procédures). Suite aux lésions excitotoxiques du striatum, les animaux présentent typiquement un hypophagie pendant 48h. De la nourriture plus appétente est proposée dans la cage (croquettes mouillées, gelée énergétique). Pour limiter le stress associé aux injections IPs: 1) Avant les injections, les animaux seront habitués aux procédures 2) Si approprié (surtout pour les rats), les animaux seront brièvement anesthésiés (Isoflurane) et l’injection sera réalisée sur l’animal endormi. 3) Nous réduisons au minimum le nombre des injections intrapéritonéales.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris sera utilisée car il existe des lignées transgéniques qui permettent de cibler des circuits neuronaux spécifiques pour les manipulations chémo-génétiques. Les souris sont des « natural foragers ». De plus, une partie du projet nécessite d’étudier la plasticité cortico-striatale après l’expérience d’une tâche de foraging avec différentes balances d’exploration/exploitation, avec des préparations ex-vivo établies chez la souris. Le projet s’intéresse à manipuler l’effort que doivent fournir les animaux pour obtenir des récompenses à l’aide d’un tapis roulant et d’examiner l’effet de ces manipulations sur les décisions et le contrôle de locomotion. Ces manipulations sont facilement réalisables sur le rat. Dans le futur, nous pourrions être amenés à faire des enregistrements d’activité électrophysiologique sur l’animal en comportement ce qui plus facile à faire chez le rat (stabilité des implants). Il est donc important que le travail comportemental soit fait sur cette espèce. Pour les expériences purement comportementales (avec on sans perturbations neuronales), les souris seront de jeunes adultes entre 8 et 14 semaines (handling à 8 semaines, durée maximale des tests de comportements : 6 semaines). Les rats auront entre 8 et 10 semaines au début des expériences (handling). La durée des tests comportementaux variera entre 1 et 2 mois (en fonction des paramètres manipulés). Certains rats les tests comportementaux avant et après lésions donc ils auront 6 mois à la fin de l’expérience. Les souris qui passeront les tests de comportement et qui seront utilisées pour les expériences d’électrophysiologie ex-vivo auront entre 5 et 7 semaines au moment des enregistrements électrophysiologiques et seront donc entraînées dans le test de foraging de P30-P45. L’utilisation de souris plus jeunes est nécessaire afin de maximiser le succès des expériences d’électrophysiologie ex-vivo (quantité et qualité des enregistrements en patch-clamp ex-vivo).