Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 28/03/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-886334)
9 128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue : 992 femelles gestantes, 3 325 nouveau-nés âgés de 2 à 15 jours et 4 387 embryons prélevés au dix-huitième jour de gestation. Les femelles subissent une ouverture de l’abdomen de trente minutes pour une injection d’ADN dans le cerveau ou l’œil de leurs embryons, geste dont le porteur indique qu’il peut rompre le sac embryonnaire et conduire à la mort in utero ou à la naissance d’un petit non viable. Les nouveau-nés reçoivent une injection de marqueur dans les deux yeux, ou sont anesthésiés par le froid et opérés sans réveil. 8 960 de ces animaux subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour un travail de recherche fondamentale sur la formation des circuits visuels et moteurs.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Notre système nerveux est un réseau complexe au sein duquel une connectivité précise entre les neurones est essentielle au bon fonctionnement du système. Cette connectivité neuronale est établie au cours du développement embryonnaire par une succession de processus incluant : (i) la migration neuronale, une étape qui détermine la position des neurones dans le système nerveux, (ii) le guidage axonal, un processus permettant aux axones en croissance d’atteindre les cibles avec lesquelles ils doivent établir des connections, et enfin une dernière étape permettant l’élimination des connexions surnuméraires ou inappropriées. Le dysfonctionnement d’une ou plusieurs de ces étapes est à l’origine d’un spectre de maladies neurodéveloppementales allant des malformations cérébrales aux maladies psychiatriques et est à l’origine de certaines maladies neurodégénératives. Au cours du développement embryonnaire, le comportement des neurones et de leur axone en croissance est dicté par un environnement très complexe incluant des signaux chimiques (molécules de guidage), physiques (cellules et axones voisins, vaisseaux sanguins) et mécaniques (rigidité du tissu). Si de nos jours, ces signaux environnementaux sont pour la plupart connus, les mécanismes intracellulaires qui adaptent le comportement des axones en croissance à ces signaux restent largement ignorés. Notre projet vise à décrypter ces mécanismes en se concentrant sur deux acteurs cellulaires essentiels au développement neuronal: les molécules de signalisation et le squelette neuronal. Pour cela, nous utilisons une approche expérimentale combinant (i) le développement d’outils innovants pour moduler ces signaux et régulateurs du squelette neuronal, (ii) l’utilisation de systèmes biologiques complémentaires (systèmes acellulaire, cultures cellulaires et modèles murins) ainsi que (iii) des techniques de chirurgie (électroporation in utero) et d’histologie permettant étudier les conséquences sur le développement des circuits neuronaux d’une modulation de ces signaux et régulateurs du squelette. Ce projet permettra de découvrir de nouveaux mécanismes essentiels à l’établissement des connectivités neuronales, d’apporter un éclairage nouveau sur l’origine de certaines pathologies visuelles (Ambliopie) et neurologiques et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour préserver ou rétablir une connectivité fonctionnelle dans certaines conditions pathologiques (glaucome).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
En décryptant les mécanismes cellulaires qui dictent les changements morphologiques et comportementaux des neurones en développement, notre projet apportera un éclairage nouveau sur les mécanismes fondamentaux régissantla formation des circuits visuels et moteurs au cours du développement embryonnaire ainsi que sur l’origine de certaines pathologies visuelles (albinisme, Ambliopie) et neurologiques (maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives). Il devrait également fournir de nouveaux outils et nouvelles cibles thérapeutiques pour pour prévenir/freiner la dégénérescence axonale et/ou rétablir des connectivités neuronales fonctionnelles dans certaines conditions pathologiques (ex : glaucome).
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Au cours de notre projet les animaux seront soumis à différentes interventions. Parmi elles : (I) une injection unique de marqueurs neuronaux dans les deux yeux sous anesthésie et analgésie. Cette intervention concerne des nouveau-nés âgés de 3 ou 15 jours et sa durée est de 20 minutes. (II) Une Injection in utero d’une solution d’ADN dans le cerveau ou l’œil d’embryons à 18 jours de gestation. Cette injection nécessite une chirurgie abdominale (laparotomie) sur des femelles gestantes préalablement analgésiées et anesthésiés. La procédure dure 30 min. (III) Une étape de chirurgie sans réveil pour l’animal sur des souriceaux âgés de 2 à 15 jours analgésiés et anesthésiés. Cette procédure a une durée inférieure à 30 min.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’anesthésie par le froid des nouveaux nés peut entrainer un stress thermique. Il existe un très léger risque de réaction inflammatoire de courte durée (48 h) suite à l’injection intraoculaire des molécules permettant de marquer les axones rétiniens. Un faible risque de détresse respiratoire et de mortalité est également associé à l’anesthésie générale. Lors de la procédure d’électroporation in utéro, la rupture du sac embryonnaire entourant l’embryon peut conduire à la naissance d’un embryon sous développé et non viable en période postnatal voir même à sa mort in utero. De plus, dans le cadre de l’électroporation in utero, la femelle gestante pourrait éprouver une gêne, des douleurs et/ou du stress suite à la chirurgie abdominale. De plus, des problèmes au niveau de la mise bas pourrait survenir du fait de la manipulation des embryons lors de la procédure.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux de chaque procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire et adaptée à l’âge de l’animal et ce afin de réaliser des analyses histologiques sur les embryons et nouveau-nés.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons chaque fois qu’il le sera possible des modèles cellulaires pour remplacer ou minimiser l’utilisation des modèles animaux. Notamment, nous effectuerons toutes les expériences de préselection des molécules d’interêt de notre étude sur différents modèles de cellules en culture. Seules les molécules les plus prometteuses seront ensuite analysées in vivo. Cette approche in vivo reste indispensable à la validation de l’importance des molécules étudiées pour le façonnage des connections neuronales et/ou de leur potentiel thérapeutique, les modèles in vitro ne pouvant pas récapituler la complexité des signaux chimiques (molécules de guidage), physiques (cellules et axones voisins, vaisseaux sanguins) et mécanique (rigité du tissu nerveux) guidant les axones en développement.
2. Réduction
La dissection des mécanismes cellulaires régissant l’établissement des réseaux neuronaux est complexe et requière grand nombre de conditions expérimentales. Afin de réduire au maximum les approches in vivo chez l’animal, nous utilisons des approches in vitro basées sur différents modèles cellulaires pour faire une pré-sélection de molécules ou gènes candidats. Sur la base de ce crible, nous avons pu réduire au maximum le nombre de lots expérimentaux nécessaires pour valider la pertinence de ces candidats pour la formation des circuits neuronaux in vivo. Ainsi, le nombre total d’animaux utilisés dans le cadre de ce projet sera de 9128. Ce nombre inclus 992 femelles gestantes, 3325 nouveau-nés âgés de 2 à 15 jours et 4387 embryons à 18 jours de gestation. Cette estimation se base sur des études précédentes de l’équipe utilisant des approches expérimentales équivalentes et des tests statistiques prédictifs. Ces analyses, nous permettent de réduire et d’estimer à 10 le nombre d’animaux par condition expérimentale requit pour obtenir des résultats statistiquement robustes compte-tenu de la variabilité inter-individus. L’analyse de nos données sera faite à l’aide de tests statistiques adaptés.
3. Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Pour les animaux provenant de l’extérieur 5 jours d’acclimatation seront respectés avant expérimentation. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées avec enrichissement selon les conditions respectant la règlementation en vigueur. La nourriture et l’eau sont disponibles à volonté. La température (entre 20 et 24 degrés), l’hygrométrie (entre 45 et 55 pourcents) et l’éclairage sont contrôlés et conformes à la règlementation. La Structure Chargée du Bien-être Animal et le personnel qualifié de l’animalerie veillent au respect des règles et assurent une surveillance quotidienne des animaux. Les chirurgies sont réalisées par des personnels titulaires des formations adéquates et sont réalisées sous analgésie pré et post-opératoire et anesthésie générale. Pendant la chirurgie, les animaux sont maintenus sur coussin chauffant pour éviter toute hypothermie. Leurs yeux sont protégés par un gel lubrifiant pour prévenir la sécheresse oculaire. Le réveil se fait dans une chambre thermostatée à 30 degrés sous surveillance, avant le retour dans leur cage initiale. Après réveil, les animaux sont surveillés une fois par heure pendant 2 heures, puis tous les jours par les expérimentateurs ou le personnel de l’animalerie pour détecter d’éventuelles complications post-chirurgicales ( points limites) et réaliser les gestes nécessaires et adaptés (soin ou euthanasie). Une surveillance quotidienne des nouveau-nés sera également faite dès la naissance. En cas de détection de signes de souffrance, de rejet par la mère ou d’absence de lait dans l’estomac les petits seront euthanasiés. Après l’électroporation in utero, les femelles ayant subi une chirurgie au niveau de l’abdomen s’occupent moins bien de leur portée. Ainsi, des femelles gestantes sur lesquelles aucune procédure ne sera réalisée seront utilisées comme mères adoptives afin d’augmenter les chances de survie des petits électroporés. Enfin, afin de réduire le nombre d’animaux exclus des analyses statistiques pour électroporation non-optimale, une femelle gestante sauvage sera dédiée au raffinement de l’électroporation dans certains lots expérimentaux pour optimiser le ciblage des neurones d’intérêt.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’Homme génétiquement, anatomiquement et physiologiquement. De plus, l’organisation des circuits visuels et des circuits moteurs contrôlant la motricité volontaire est bien conservée entre la souris et l’humain, contrairement à d’autres vertébrés (zebrafish, poulet). La souris est aussi un modèle utilisé de longue date pour l’étude du système nerveux et visuel. De nombreuses données sont donc disponibles dans la littérature sur lesquelles notre étude peut se reposer. Encore, la souris reste le modèle de choix pour la génération d’animaux transgéniques (permettant l’étude de la fonction d’un gène dans un tissu d’intérêt ou à l’échelle de l’organisme entier) ou de modèles de pathologies humaines (visuelles, neurologiques) comme celles étudiées dans notre projet. Pour l’étude du système visuel comme pour le système moteur, nous nous intéresserons principalement aux stades embryonnaires et post-nataux afin d’étudier comment la connectivité neuronale entre la rétine et le cerveau ou le cerveau et la moelle épinière se met en place pendant le développement embryonnaire et se raffine en période post-natale. Nos études seront donc menées sur des embryons au 18ème jour de gestation et sur des nouveau-nés âgés de 2, 3, 8 ou 15 jours. Cette analyse temporelle, nous permettra d’identifier à quelle étape de ces processus développementaux la formation de ces circuits neuronaux, nos molécules de signalisation ou gènes d’intérêts jouent un rôle déterminant.