Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 13/05/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-984205)
Issus de l’élevage interne du laboratoire, dix couples de xénopes adultes reçoivent chacun deux injections hormonales dans les sacs lymphatiques pour déclencher la ponte, puis retournent aux aquariums quatre mois au moins avant d’être réutilisés, jusqu’à trois fois par an. Leur descendance fournit les 11 938 œufs, larves et juvéniles exposés pendant quatre jours à deux mois à des graphènes et à des nanopesticides au cuivre, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce mettre « à l’étude » la culture d’organoïdes pour remplacer un jour ces animaux. Les vingt adultes sont les seuls à rester en vie, les larves et les juvéniles n’étant pas réveillés, un même individu servant à mesurer la toxicité sur plusieurs organes.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’augmentation rapide de l’utilisation des nanoparticules dans divers domaines industriels et technologiques soulève des questions sur leur impact environnemental, notamment sur les écosystèmes aquatiques. Ce projet explore les interactions environnementales et les risques associés à deux types de nanoparticules : les graphènes et les nanopesticides à base de cuivre. Les graphènes, grâce à leurs propriétés exceptionnelles comme la conductivité électrique et la résistance mécanique, sont de plus en plus utilisés. Cependant, leur interaction avec les organismes aquatiques peut induire des effets toxiques, perturbant la survie, la croissance et la reproduction de ces organismes. Les nanopesticides à base de cuivre, innovants en agriculture, augmentent l’efficacité des pesticides tout en réduisant les doses nécessaires. Toutefois, le cuivre, toxique à haute concentration, peut exacerber ses effets toxiques. Les nanoparticules de cuivre peuvent s’accumuler dans les sédiments, perturbant les communautés microbiennes et les cycles biogéochimiques, nécessitant une évaluation rigoureuse de leur écotoxicité et de leur comportement environnemental.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les bénéfices attendus de la réalisation du projet sont de déterminer les impacts sur la société et l’économie, en invitant les industriels, gestionnaires et consommateurs à protéger l’environnement des rejets de contaminants émergeants tels que les nanoparticules, avec la prise en compte du concept « une seule santé » résumant l’idée que la santé humaine et la santé animale sont interdépendantes et liées à la santé des écosystèmes dans lesquels l’homme et l’animal co-évoluent. Selon les résultats obtenus dans le présent projet, des préconisations d’emploi des graphène et nanopesticides pourront être données par le biais d’une approche « Sécurité dès la conception » et pourraient permettre de faire avancer la réglementation en matière de nanoparticules et notamment auprès des industriels et des consommateurs. D’un point de vue de l’évaluation réglementaire des risques au sein des agences françaises et internationales, des prérogatives pourront également être apportées pour mettre à jour ces recommandations « nano » dans le cadre de la mise en place des essais d’évaluation de la toxicité.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux adultes sont soumis à une injection hormonale (adultes). L’injection hormonale chez un adulte dure de quelques secondes à quelques minutes en prenant en compte la prise en main. Il y a 10 couples et 2 injections par animal (dans les 2 sacs lymphatiques) donc 20 injections chez les mâles et autant chez les femelles. Tous les autres animaux, œufs, larves ou juvéniles de 3-6 mois, seront exposés par groupe aux différents graphènes et nanopesticides pour une gamme de concentration et à différents temps de traitement : cela représente 1320 larves (procédure 2 ; durée 12 jours), 3520 larves (procédure 3 ; durée 21 jours), 1350 larves (procédure 4 ; durée 12 jours), 4500 œufs (procédure 5 ; durée 2 mois), 750 larves (procédure 6 ; durée 4 jours), 498 juvéniles (procédure 7 ; durée 12 jours).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Chez l’adulte, les nuisances ou effets indésirables peuvent être le stress liée à leur capture dans la paume de la main de l’expérimentateur au moment de l’injection hormonale et l’injection elle-même (nuisances légères). Chez les larves, les nuisances ou effets indésirables, sont liées au stress potentiel lors de leur capture pour réaliser les différents lots et la durée de leur exposition (quelques jours à 21 jours) en présence de nanoparticules et nanocomposites. Les procédures sont effectuées sur larves euthanasiées. S’agissant d’une évaluation du risque des nanoparticules et nanocomposites, seuls les résultats des analyses des biomarqueurs étudiés chez ces animaux exposés pourront renseigner des effets potentiels avérés, à l’issu du projet (possiblement, les nanoparticules et nanocomposites induiront des effets sur les marqueurs physiologiques, génétiques et sur le microbiote intestinal). Afin de réduire le nombre d’adultes xénopes, les expérimentations seront regroupées autant que possible sur les individus issus d’une même ponte. De plus, pour réduire le nombre de têtards, les conditions témoins seront mises en commun dans la mesure du possible. Des essais de toxicité chez les invertébrés daphnies (ou limnées) permettront de définir les gammes de concentrations à utiliser lors des expositions des larves de xénopes, en visant des concentrations subléthales pour éviter toute mortalité aigüe des têtards. Les concentrations environnementales auxquelles nous travaillerons étant qualifiées de faibles, aucune toxicité aiguë particulière n’est attendue.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les adultes reproducteurs sont réintégrés à l’élevage et se reposent au moins 4 mois avant d’être réutilisés pour réaliser une nouvelle fécondation. Les larves et les juvéniles ne sont pas réveillés car pour réduire le nombre d’animaux, on utilise le même animal pour étudier la toxicité sur les organes.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’objectif de notre projet est d’analyser les effets toxiques des nanoparticules et nanocomposites au cours du développement et sur l’axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien. A l’heure actuelle, il n’existe pas d’approche alternative permettant le remplacement du modèle animal dans notre contexte expérimental. Les gammes de concentration utilisées pour chaque procédure chez le xénope seront préalablement établies par des tests de toxicité des nanoparticules et des nanocomposites réalisés chez la daphnie et/ou la limnée (un crustacé et un mollusque). Parallèlement, la faisabilité de la culture d’organoïdes pour tester l’effet des composés (nanoparticules et nanocomposites) sera mise à l’étude dans le but de remplacer l’utilisation des animaux dans le futur.
2. Réduction
Les reproducteurs utilisés proviennent d’un élevage interne et les larves issues des pontes seront utilisées dans différentes procédures ==> Pas d’importations supplémentaires de nouveaux géniteurs d’où une réduction du nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’individus utilisés dans chaque procédure est calculé selon un minimum requis pour pouvoir conclure statistiquement sur de potentiels effets délétères, avec des tests statistiques permettant d’étudier les données, leur cohérence et les différences entre les conditions expérimentales. Au cours des expositions des larves, les lots d’animaux témoins seront mutualisés autant que possible pour l’analyse des résultats obtenus avec les différentes nanoparticules testées. Enfin, seules les concentrations sans toxicité aiguë obtenues seront mises en œuvre grâce aux résultats des essais sur invertébrés daphnies et/ou limnées qui permettent donc également une réduction du nombre de xénope.
3. Raffinement
Les reproducteurs qui sont injectés en vue de la reproduction servent au maximum 3 fois par an (période de récupération > 4 mois). Le laboratoire dispose de son propre élevage, ce qui rend la gestion de reproduction très facile et donc limite le stress aux animaux (une seule et même personne réalise les injections et réalise la maintenance des xénopes du stade œuf au stade juvénile). Dans le but de réduire le stress des reproducteurs, les conditions d’élevage ont été raffinées. Des refuges aquatiques de type tuyau de cachette en céramique ont été installés depuis de nombreuses années au sein de chaque aquarium. Plusieurs mesures seront également prises pour minimiser les souffrances et douleurs aux larves et juvéniles : les milieux d’exposition seront renouvelés pour éviter une désoxygénation trop importante ainsi que toute accumulation de déchets azotés toxiques (nitrates, nitrites, ammoniaque), des filtres en ouate sont intégrés à chaque aquarium et renouvelés régulièrement pour limiter la toxicité potentielle des composés azotés formés.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les larves et juvéniles de grenouilles xénope sont particulièrement pertinents pour les études écotoxicologiques pour plusieurs raisons. Premièrement, le xénope est un modèle bien établi en écotoxicologie en raison de sa sensibilité aux polluants et à divers stress environnementaux. Les amphibiens aquatiques, comme les larves de xénope, ont une peau perméable fine et très vascularisée, ce qui les rend particulièrement vulnérables aux contaminants présents dans les milieux aquatiques. De plus, leur développement relativement rapide et bien caractérisé permet de détecter les effets toxiques à différents stades de leur croissance. Les juvéniles, quant à eux, offrent une opportunité d’étudier les effets à plus long terme des contaminants, incluant des impacts potentiels sur la survie, la croissance et la reproduction. Ils sont utilisés ici en raison de leur mode d’alimentation (carnivore, alors que la larve est herbivore) qui permet d’étudier les effets trophiques d’une contamination. Enfin, les xénopes sont faciles à élever en laboratoire, permettant des études contrôlées et reproductibles. Leur élevage est parfaitement codifié. Le xénope est pertinent dans le cadre de notre projet car il possède un taux d’éclosion élevé, une disponibilité tout au long de l’année après un traitement hormonal des reproducteurs, un développement embryonnaire puis larvaire rapide et l’alimentation des larves est facile. Ces caractéristiques font des larves et juvéniles de xénope des modèles idéaux pour évaluer les effets écotoxicologiques des nanoparticules et autres contaminants dans les environnements aquatiques. Les reproducteurs xénopes seront utilisés au stade adulte, sexuellement mâtures tel que le nécessite la reproduction. Les larves sont utilisées 2 à 3 semaines après l’éclosion pour la plupart d’entre eux et d’autres au stade oeuf (48 h après l’injection). Les juvéniles seront âgés de 3 à 6 mois. Les larves sont utilisées à ces stades précis pour différentes raisons : les stades larvaires sont particulièrement sensibles à la présence de polluants, car directement exposés à l’environnement aquatique via l’alimentation par apport d’eau et via les branchies et la peau, ces stades larvaires 50-51 sont facilement repérables car ils correspondent à l’apparition du bourgeon de la patte postérieure et l’anesthésie n’est pas nécessaire pour le visualiser.