Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 10/03/2026
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-654381)
Vingt xénopes adultes nagent six mois dans une eau contenant un mélange de six perturbateurs endocriniens, puis reçoivent deux injections hormonales à vingt heures d’intervalle pour être reproduits. Avec leurs descendants sur deux générations et 1 728 larves, 1 828 animaux sont concernés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la quasi-totalité. Le porteur écrit que les concentrations employées ne provoquent pas de stress connu, après avoir indiqué que ces substances peuvent entraîner une surmortalité et des malformations de la colonne vertébrale. Les mâles sont tués au moment de la ponte pour prélever leurs testicules, les femelles après récupération des œufs, et toutes les larves après prélèvement de leur cerveau.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Des études récentes suggèrent que les effets transgénérationnels induits par des polluants tels que les perturbateurs endocriniens (PE) sont impliqués dans le déclin des populations d’amphibiens en altérant la capacité des animaux à se reproduire. Ce projet a pour ambition d’étudier les effets d’une exposition à un mélange de 6 PE présents dans le milieu naturel utilisés à des concentrations environnementales tout au long de la vie des animaux de la 1ère génération, puis les répercussions transgénérationnelles de cette exposition sur les 2 générations suivantes non exposées chez l’espèce Xenopus tropicalis. Les effets seront évalués à chaque génération en regardant l’impact de cette perturbation sur le développement et le comportement de la descendance des animaux exposés (première génération) et non exposés (les 2 générations suivantes). Les effets au niveau thyroïdien et au niveau du développment des animaux, en particulier les effets neuro-développementaux, ainsi que les effets sur la reproduction et la transmission des effets entre génération seront étudiés. Ces animaux seront comparés à des animaux élevés dans les mêmes conditions mais non exposés aux PE, comme contrôles.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet vise à mieux comprendre les impacts des perturbateurs endocriniens (PE) obésogènes sur les amphibiens et leur conséquence dans le déclin de leurs populations. D’un point de vue scientifique, la recherche générera de nouvelles connaissances et technologies dans les domaines de la physiologie animale, de la perturbation endocrinienne, de l’épigénétique et de l’écotoxicologie. D’un point de vue global, la protection de la biodiversité et de la santé humaine est essentielle. Le concept « EcoHealth » est aujourd’hui mis en avant dans nos sociétés. Sous plusieurs aspects, notre projet s’inscrit parfaitement dans ce concept. Toutes les données générées par ce projet multidisciplinaire seront disponibles pour les organisations qui gèrent la biodiversité ou sont impliquées dans l’évaluation des risques chimiques (OFB, ANSES) et aideront les décideurs à protéger la qualité de l’environnement naturel et à améliorer la santé des écosystèmes.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les xénopes adultes de la première génération (F0) seront exposés à un mélange de 6 perturbateurs endocriniens dilués dans l’eau des aquariums durant 6 mois. Les xénopes adultes des 2 générations suivantes (F1 et F2) seront maintenus en eau normale durant 3 mois. Toutes les reproductions des animaux seront réalisées au cours de ces périodes. Pour la fécondation in vitro, les animaux adultes males et femelles reçoivent deux injections d’hormone à 20 heures d’intervalle. Ces étapes ne durent pas plus de 30 secondes à chaque fois. Les femelles commencent à pondre environ 2 heures après la seconde injection. Les mâles sont euthanasiés à ce moment pour prélever leurs testicules. Les femelles sont soumises à un massage doux pendant 1 à 2 minutes pour récupérer les œufs qui seront fécondés par leur mise en présence avec une solution contenant les spermatozoïdes. Dans le cas de non ponte, les femelles pourront être de nouveau stimulées en respectant un repos minimum de 2 mois entre deux stimulations. Les larves obtenues des descendances des 3 générations produites seront élevées jusqu’à la fin du développement larvaire puis soumis à ce stade à un test de comportement (analyse de la mobilité sur une période de 12 minutes).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les concentrations du mélange de perturbateurs endocrinien (PE) utilisées sont celles des normes de qualité environnementales. Il se peut cependant que les effets des PE puissent entrainer une surmortalité ou des malformations. Au stade larvaire des déformations de la colonne vertébrale sont décrites comme pouvant survenir lors d’un stress. Nous effectuons une stimulation hormonale sur femelles vigiles. Les nuisances attendues sont essentiellement de type inconfort/stress et douleur légère et transitoire. Une douleur légère et transitoire peut être induite par l’injection.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les adultes males et femelles utilisés pour réaliser les fécondations in vitro seront euthanasiés en fin de procédure. Des tissus seront récupérés pour analyse. L’ensemble de ces animaux étant destiné à une étude multigénérationnelle suite à l’exposition de la première génération à un mélange de perturbateurs endocriniens, il n’est pas possible de réétuliser ces animaux en raison de cette exposition. Toutes les larves utilisées pour étudier les effets direct et transgénérationel du mélange de 6 perturbateurs endocriniens sont euthanasiés en fin de procédure. Des prélèvements d’organes (cerveaux) seront réalisés sur chaque larve en vu de faire des analyses immunologique et d’expression de gène sur ces animaux pour regarder les effets neurodéveloppementaux de l’exposition aux perturbateurs endocriniens.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les outils informatiques permettant de faire des prédictions ne peuvent pas reproduire toute la complexité d’un organisme vivant. De la même façon, les expériences réalisées sur des cellules en laboratoire (tests in vitro) ne tiennent pas compte du fonctionnement global, notamment des effets hormonaux ou du développement, qui ne peuvent être observés que chez un animal entier. Dans notre étude, nous cherchons à comprendre comment un mélange de substances peut perturber le système hormonal. Ce type de phénomène dépend des interactions entre plusieurs organes, ce qui ne peut pas être étudié uniquement sur des cellules isolées. C’est pourquoi une approche « in vivo », c’est-à-dire sur des animaux vivants, est nécessaire. Nous avons choisi d’utiliser des grenouilles, car notre objectif est d’évaluer l’effet d’un mélange de produits tel qu’il pourrait exister dans leur environnement naturel. Cette méthode permet d’obtenir des résultats plus fiables et représentatifs des conditions réelles d’exposition.
2. Réduction
Le projet concerne 1828 animaux. 100 grenouilles adultes (20 animaux de la génération F0, 40 animaux de la génération F1 et 40 animaux de la génération F2) seront utilisées. Pour chaque étape, nous utilisons 5 mâles et 5 femelles afin de réaliser différents types de croisements. Un prélèvement d’organes (cerveau, thyroide…) sur les individus euthanasiés sera effectué. Au total, 1728 larves seront utilisées dans le projet. Ce chiffre correspond à 480 larves par génération, multipliées par 3 expériences répétées (soit 1 440 larves). Nous ajoutons une marge de 20 pour cent pour tenir compte de la mortalité naturelle des têtards. Le nombre de larves utilisé est le nombre minimal pour ne pas mettre en péril les manipulations et avoir des résultats statistiquement fiables : – Pour le comportement, un minimum de 20 animaux testés par condition experimentale est nécessaire pour mesurer une mobilité interprétable et comparable. – Pour l’analyse immunologique, 10 animaux par condition experimentale permettront de tester plusieurs marqueurs immunologiques pour observer les effets du mélange de perturbateurs endocriniens sur le développement neuronal. – Pour l’analyse de l’expression des gènes, 10 animaux par condition experimentale permettront de disposer de suffisamment de materiel génétique (cerveaux) et d’avoir suffisamment de réplicats biologiques pour les analyses. Le nombre de réplicats techniques permettra de prendre en compte la variabilité inter-experimentation généralement associée aux études réalisées sur les animaux vivants. La taille des effectifs a été établie avec un calcul de puissance afin de prendre en compte la robustesse des résultats tout en limitant le nombre d’animaux. La comparaison des groupes sera réalisée via des tests statistiques permettant une interprétation fiable des résultats.
3. Raffinement
Les protocoles d’exposition permettent de reproduire les conditions naturelles (exposition dans l’eau) pour confirmer et transposer les résultats obtenus à court terme sur le terrain. Ce mode d’exposition est non invasif et n’induit pas de souffrance, contrairement à l’injection dans l’abdomen souvent utilisée en toxicologie. Les grenouilles sont élevées dans des aquariums contenant de l’eau filtrée, déchlorée, oxygénée et maintenue à une température de 26 degrés. Des capteurs mesurent en continu la température, le pH et la qualité de l’eau. Les aquariums sont aménagés avec des tubes, plantes, billes, même si les animaux préfèrent rester au fond. Les déchets et restes de nourriture sont retirés chaque jour, et les parois nettoyées toutes les deux semaines. Avant toute expérience, les animaux s’acclimatent à leur environnement pendant un mois. Ils sont nourris trois fois par semaine à satiété, avec des granulés et des vers de vase. La manipulation s’effectue à la main ou à l’épuisette, sans mouvement brusque. Leur comportement et leur état de santé sont suivis tout au long des protocoles grâce à une grille d’observation. Les concentrations de perturbateurs endocriniens utilisées correspondent aux normes environnementales et ne provoquent pas de stress connu. Toutefois, en cas de signe de stress, le traitement est suspendu et les animaux euthanasiés. Lors des fécondations in vitro, les injections peuvent entraîner de légères douleurs. Les Xenopus sont sortis de l’eau uniquement le temps de l’injection puis isolés dans un bac d’eau déchlorée jusqu’au lendemain. Chez les femelles la ponte est repérée grâce à la dilatation du cloaque, et les œufs non fécondés sont recueillis par massage doux. Les femelles qui ne réagissent pas ne sont pas utilisées. Après la ponte, elles sont replacées en aquarium isolé pendant 48 heures avec surveillance de l’alimentation. Les expérimentateurs observent quotidiennement les animaux. Les points limites de stress déclenchant une euthanasie incluent : perte d’appétit, mouvements anormaux, apathie, dégradation de la peau, état de choc, inconscience ou blessures.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le choix de l’espèce Xenopus tropicalis est justifiée par trois raisons majeures : 1) son temps de génération court pour un amphibien (environ 10 mois du stade œuf à adulte mature) permet l’étude de l’effet de polluants tels que les perturbateurs endocriniens sur plusieurs générations 2) c’est une espèce non invasive ni en danger ou voie d’extinction et qui est facile à maintenir en laboratoire. C’est un modèle déjà étudié dans notre laboratoire et 3) Le xénope est un vertébré tétrapode non-mammifère et un modèle important pour l’étude du développement des vertébrés. Le génome de Xénopus tropicalis montre d’importante similitude avec le génome humain et c’est une espèce sur laquelle les études sur le génome sont aisées. Les animaux adultes seront utilisés afin d’être reproduits sur 3 générations pour obtenir à chaque génération une descendance qui sera utilisée pour faire une analyse multigénérationnelle des effets de l’exposition des animaux de la première génération à un mélange de perturbateurs endocriniens. Les larves obtenues pour chaque reproduction seront utilisées à un stade qui se situe à la fin du développement larvaire, car à ce stade, les organes sont bien différenciés, ce qui permet d’étudier la physiologie et la morphologie des animaux. Sur ces larves, un test comportemental (par une analyse de leur mobilité à chaque génération) et une analyse des tissus neuronaux après euthanasie et prélèvement des cerveaux seront réalisés, dans le but de voir les effets neurodéveloppementaux de l’exposition aux perturbateurs endocriniens à travers les différentes générations.