Procédures légères

Les 40 brebis donneuses sont transportées deux heures, reçoivent une éponge vaginale et dix injections, puis sont tuées pour que les embryons soient collectés dans leur utérus. 120 brebis receveuses subissent une chirurgie sous anesthésie générale pour le transfert de ces embryons mâles, et 30 des gestantes passent tout le dernier mois de gestation à 30 °C le jour, avec un risque d'avortement ou de mise bas précoce selon le porteur. 220 moutons sont ainsi utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour mesurer l'effet de la chaleur in utero sur les spermatozoïdes des descendants. Les 60 agneaux mâles subissent cinq prises de sang et des collectes de semence, sont suivis jusqu'à neuf mois environ puis tués pour prélever leurs testicules et leur prostate, tandis que les brebis receveuses retournent au troupeau.

Objectifs

Dans un contexte de changement climatique, ce projet vise à étudier les conséquences d’une exposition à des températures élevées pendant la fin de la gestation sur le développement de la descendance chez les ovins. L’hypothèse posée par l’étude est qu’une exposition à la chaleur pendant la vie fœtale peut modifier le fonctionnement du placenta et affecter le développement de différents organes chez la descendance. Une attention particulière sera portée au développement de l’appareil reproducteur mâle, car des altérations de la qualité ou de la quantité des spermatozoïdes pourraient avoir des conséquences sur la fertilité et les performances de reproduction. Les analyses porteront notamment sur des mécanismes épigénétiques, qui permettent à notre environnement d'influencer le fonctionnement de certains gènes, sans modifier notre ADN. L’étude repose sur la comparaison d’animaux présentant des capacités différentes de tolérance à la chaleur, élevés dans des conditions climatiques contrastées. Les objectifs scientifiques sont de caractériser les effets du stress thermique sur le fœtus, d’évaluer ses conséquences à long terme sur le développement de la descendance mâle et d’identifier les mécanismes biologiques favorisant l’adaptation aux fortes températures et leur origine. Ce projet se déroulera sur 4 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à mieux comprendre les conséquences de l’augmentation des températures liée au changement climatique sur les animaux d’élevage. Plus particulièrement, il étudie l’impact d’une exposition à la chaleur pendant la gestation sur le développement fœtal, le poids à la naissance, la croissance des individus et les capacités de reproduction des animaux à l’âge adulte. Les chercheurs souhaitent déterminer si une exposition à des températures élevées avant la naissance peut avoir des effets durables sur le développement des animaux. Ils étudieront également les mécanismes naturels qui permettent à certains animaux de mieux résister à la chaleur que d’autres et chercheront à savoir si cette capacité d’adaptation dépend principalement de la mère ou des échanges entre la mère et le fœtus pendant la gestation. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre comment les animaux s’adaptent aux fortes chaleurs et comment ces adaptations peuvent influencer leur santé et leurs performances de reproduction. À plus long terme, ces connaissances pourraient contribuer au développement de stratégies permettant de limiter les effets négatifs des épisodes de chaleur sur les animaux d’élevage et ainsi aider les filières agricoles à faire face aux conséquences du changement climatique.

Procédures

Les donneuses d’embryons subiront un transport de 2 heures entre l'EU1 et l'EU2, une pose d'éponge par voie intravaginale, une série de 8 injections par voie intra-musculaire et 2 injections intra-veineuses sur animal vigile (EU1). Si les inséminations sont faites avec de la semence congelée, une laparoscopie sera réalisée sur chacune des brebis à inséminer (EU4). Le temps d’intervention de cet acte se compte en minutes (3 à 5 min par brebis). Concernant les receveuses, une pose d'éponge par voie intra-vaginale, une injection par voie intra-musculaire et 2 injections intra-veineuses sur animal vigile et une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie pour le transfert d’embryons (30 minutes) seront réalisées (EU2 et 3). Durée de chaque injection : quelques secondes. 3 prises de sang seront effectuées sur l’ensemble des 60 mères gestantes (à 110 jours, 125 et ~147 jours de gestation). 30 de ces brebis gestantes subiront un stress thermique en bâtiment à ambiance contrôlé durant tout le dernier mois de gestation (30°C en journée et 25°C la nuit). Les descendants mâles subiront 5 prises de sang (naissance, 1, 3, 6 et 9 mois) et des collectes de semence (3 éjaculats par mâles à partir de 8 mois d’âge ; EU2). La durée d'une prise de sang est d'une à deux minutes, contention comprise et celle de la collecte d’un éjaculat de quelques minutes.

Impact sur les animaux

Le transport entre l'EU2 et l'EU1 et la découverte d’un nouvel environnement pourra engendrer un stress transitoire chez les femelles. Certains effets indésirables liés à l’anesthésie et la chirurgie peuvent survenir (hypothermie et douleurs post-opératoires). Le stress thermique pourrait entrainer une hyperthermie sur les brebis avec des difficultés de régulation de température corporelle et respiratoire dues également au dernier stade de gestation. Un risque d’avortement ou de mise-bas précoce pourrait survenir. Un petit hématome pourrait apparaitre à la jugulaire, lié aux quelques prises de sang effectuées. Enfin, le stress généré par l’ensemble des manipulations pourrait également apporter une nuisance supplémentaire.

Devenir

Pour des raisons de compatibilité avec les objectifs de l’étude, la collecte des embryons sera réalisée sur les utérus post-mortem. Les 40 femelles donneuses d'embryons seront donc euthanasiées. Les 120 embryons mâles collectés seront remis en place dans 120 femelles receveuses synchronisées. Toutes celles non gestantes, qui ne seront donc pas intégrées à la suite de la procédure (stress thermique) retourneront au sein du troupeau d’origine (N~60). Toutes celles qui seront gestantes entreront dans l’étape suivante de la procédure (N~60). En fin de procédure, ces mères pourront retourner dans le troupeau d’origine après Le SEVRAGE des descendants. Les descendants mâles seront mis à mort à la fin de l’expérimentation afin de collecter les organes nécessaires à l’étude fonctionnelle de l’impact du dérèglement climatique. L’étude portant sur divers organes, dont les testicules et la prostate, une approche par biopsie n’est pas compatible. Leur retour au sein du troupeau n’est également plus possible (reproduction compromise).

Remplacement

Il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant d’étudier de manière fiable les conséquences d’une exposition à la chaleur pendant la gestation sur le développement des animaux après leur naissance et jusqu’à l’âge adulte. Les objectifs du projet nécessitent d’évaluer les interactions complexes entre la mère, le placenta et le fœtus, ainsi que leurs effets à long terme sur la croissance, la santé et la reproduction de la descendance. Les modèles cellulaires ou les cultures de tissus disponibles aujourd’hui ne permettent pas de reproduire l’ensemble des mécanismes biologiques qui se déroulent au cours de la gestation ni d’évaluer leurs conséquences sur l’organisme entier. Ils ne permettent notamment pas d’étudier les effets de la chaleur sur les échanges entre la mère et le fœtus, ni les répercussions de cette exposition sur le développement futur de l’animal. L’utilisation d’animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet et améliorer les connaissances sur les conséquences du changement climatique pour les animaux d’élevage.

Réduction

Le nombre d’animaux a été optimisé de façon à obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. En ce sens, le nombre d’animaux inclus dans ce projet a été déterminé de manière à obtenir des résultats scientifiquement fiables tout en limitant au maximum leur utilisation. Les connaissances actuelles ne permettent pas encore de prédire précisément les effets d’une exposition à la chaleur pendant la gestation sur le développement futur des animaux. De plus, certaines caractéristiques biologiques étudiées présentent naturellement une forte variabilité entre individus. Le projet prévoit donc le suivi de 60 descendants mâles issus de mères réparties dans différents groupes expérimentaux, avec ou sans exposition à la chaleur pendant la fin de la gestation. Cette organisation permettra de comparer les effets des conditions étudiées tout en tenant compte de la variabilité naturelle observée entre les animaux. Le nombre d’animaux a également été calculé pour compenser les pertes pouvant survenir au cours de l’expérimentation, notamment lorsqu’une gestation n’aboutit pas ou lorsqu’un animal ne peut pas être inclus dans toutes les étapes du suivi. Afin d’obtenir les 60 descendants nécessaires à l’étude, 120 femelles receveuses seront incluses dans le protocole. 40 femelles donneuses seront également nécessaires pour produire les embryons transférés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe, conformément à leur comportement naturel, dans des espaces adaptés avec une litière paillée et différents enrichissements permettant de favoriser leur confort et leurs comportements habituels. Les interventions chirurgicales nécessaires à l’insémination intra-utérine (éventuelle) et au transfert des embryons seront réalisées sous anesthésie générale avec une prise en charge adaptée de la douleur avant, pendant et après l’intervention. Des mesures complémentaires seront mises en place pour assurer le confort des animaux, notamment le maintien de leur température corporelle pendant et après la chirurgie. Les techniques utilisées sont choisies afin de limiter au maximum le caractère invasif des interventions et de favoriser une récupération rapide. Les prélèvements sanguins seront réalisés par du personnel qualifié et expérimenté selon des méthodes couramment utilisées en élevage. Ces actes sont de courte durée et n’entraînent qu’une gêne légère et temporaire. Les animaux seront habitués à la présence des soigneurs et manipulés dans des conditions visant à réduire leur stress. Après chaque prélèvement, une récompense alimentaire leur sera distribuée. L’état de santé et le comportement des animaux seront surveillés quotidiennement pendant toute la durée du projet. En cas d’apparition d’un problème de santé ou de signes de douleur, un traitement approprié sera administré sous la supervision du vétérinaire référent afin de limiter au maximum toute souffrance.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisis en raison de leur reproduction saisonnée, soumise au stress thermique soit en fin de gestation, soit en début de gestation (selon les pratiques des éleveurs). De plus les avantages biologiques apportés par cette espèce (temps de gestation court et taille des animaux) permettent aux ovins de servir de modèle pour d’autres espèces et notamment les gros ruminants. Cette étude permettra d'évaluer l'effet d’un stress thermique appliqué en fin de gestation (dernier mois) en environnement contrôlé sur la construction du phénotype de la descendance. Mais également d’identifier les mécanismes de thermo-adaptation et leur origine, en comparant deux races ovines ayant des capacités de résilience différentes au stress thermique (race française vs Brésilienne). Toutes les femelles (donneuses et receveuses) seront des adultes sexuellement matures. Les animaux générés après mise-bas seront des agneaux mâles et ils seront suivi jusqu’à un stade post-puberté (~9 mois d’âge). Ces animaux permettront d'évaluer l'effet d’un stress thermique appliqué en fin de gestation (dernier mois) en environnement contrôlé sur la construction du phénotype de la descendance.

Toutes tuées à l'issue pour que leur cerveau soit prélevé, 2 784 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une chirurgie de trois heures pour l'implantation de fibres optiques, une injection sous la peau chaque jour pendant neuf semaines, des tests comportementaux que le résumé ne nomme pas, et pour une partie quatre privations de sommeil de seize heures. Le porteur affirme que le traitement injecté n'a "aucun impact sur le bien-être" des souris, sans nommer la substance. Il reconnaît qu'il n'existe "pas de modèle expérimental établi" du trouble bipolaire, et ce projet vise à caractériser deux méthodes d'induction récentes.

Objectifs

Le trouble bipolaire est la 6e cause d’invalidité mondiale avec plus de 45 millions de personnes atteintes. Il est caractérisé par une alternance entre des phases dépressives similaires à la dépression majeure et des phases maniaques présentant une élévation anormale de l’humeur ainsi que des altérations cognitives. L’espérance de vie des patients est réduite en moyenne de 10 ans à cause du risque élevé de mort par suicide et de comorbidités (en particulier les maladies cardiovasculaires). Cependant, les mécanismes neurobiologiques ainsi que les éléments précipitant les différentes phases restent largement méconnus, à tel point qu’il n’existe pour l’instant pas de modèle expérimental établi récapitulant les principaux aspects de la maladie. L’objectif de ce projet est de développer des méthodes pour étudier les phases maniaques et dépressives du trouble bipolaire au niveau comportemental, puis de se focaliser sur les transitions entre phase, un aspect méconnu de la maladie qui pourrait amener à une meilleure compréhension de sa biologie et à de nouvelles pistes thérapeutiques. Pour cela, nous avons besoin d’un modèle de la maladie récapitulant les deux phases à l’échelle individuelle. Nous proposons ici de caractériser deux modèles récents de trouble bipolaire allant dans ce sens.

Bénéfices attendus

Les études précliniques sont peu nombreuses sur le trouble bipolaire et sont critiques pour mieux comprendre sa neurobiologie et de nouvelles thérapies. Cette étude permettra de développer de nouvelles pistes de compréhension de la maladie au niveau cérébral avec un suivi longitudinal et individuel des animaux.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie de 3 heures pour enregistrer par la suite les indicateurs neurophysiologiques dans un modèle de trouble bipolaire nécessitant une injection sous-cutanée quotidienne. Une partie des animaux sera soumise à une privation de sommeil parrtielle et intermittente sur 4 jours (4 fois 16h).

Impact sur les animaux

Les injections (7 fois par semaine sur 9 semaines), sont espacées de 24h. Les doses utilisées sont modérées par rapport à celles utilisées dans la littérature. Elles peuvent théoriquement provoquer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux sont couramment utilisés et peuvent provoquer un stress modéré en lien avec la manipulation, les contensions et l’isolement dans certains cas. Nos données préliminaires suggèrent que le traitement n’a aucun impact sur le bien-être des animaux. La perturbation du sommeil génèrera un inconfort modéré chez les animaux en lien avec des privation partielle de sommeil de durée limitée (4 fois 16h). Pour les implantations de fibres optiques : la chirurgie est susceptible d’induire douleurs physiques et inconfort chez l’animal, avec perte potentielle de poids et mobilité réduite dans les 2 jours qui suivent la procédure. Cependant ce risque est mitigé par un suivi rapproché pendant les jours suivant l’intervention avec une prise en charge préventive.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés et les cerveaux seront récupérés pour des études ultérieures

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.

Réduction

Des méthodes statistiques validées et pertinentes indiquent un nombre d’animaux/sexe/groupe de 12 individus auxquels il faut ajouter 3 individus en raison de la variabilité pouvant être associée à l’approche de neurochirurgie chez la souris.

Raffinement

Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. En cas de blessure, les animaux recevront un traitement analgésique jusqu’à la disparition des signes de douleur. En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Les éxpérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites gradés sont appliqués : les animaux surveillés sont pesés et auscultés quotidiennement (hydratation, température, état de la blessure si blessure). Un renforcement positif (gâteau) est également fourni suite aux interventions.

Choix des espèces

Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation de modèles de troubles de l’humeur, ainsi que la possibilité d’utiliser des approches interventionnelles in vivo font de la souris le modèle le plus pertinent. Les techniques précédemment mentionnées seront mises en œuvre ultérieurement une fois les modèles mieux caractérisés. Les souris seront adultes, âgées de 7 semaines ou plus. Le modèle ayant été développé chez des animaux adultes et les patients étant typiquement diagnostiqués à l’âge adulte, nous nous focalisons sur le stade adulte dans un premier temps.

Les mésanges charbonnières de ce projet sont des oiseaux sauvages, capturés en ville et en forêt, ou élevés en captivité depuis l'état de poussin pour comparer leurs rythmes d'activité. 264 mésanges vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré : capture, transport, baguage, hébergement individuel temporaire et une prise de sang, les autres mesures portant sur l'activité des oiseaux sans que les tests soient détaillés. La plupart doivent être relâchées, 214 selon le champ structuré. 32 seront tuées pour des analyses neurobiologiques de leur horloge interne, et 18 venant d'une autre métropole ne pourront pas être relâchées, sans que le résumé dise ce qu'elles deviennent.

Objectifs

L’urbanisation constitue l’une des transformations environnementales les plus rapides et les plus profondes des paysages naturels, exposant les organismes à des modifications majeures de leur habitat. Parmi ces changements, les perturbations nocturnes liées aux activités humaines, telles que la pollution lumineuse artificielle et le bruit, sont désormais reconnues comme des facteurs susceptibles d’altérer les rythmes biologiques, la physiologie et le comportement des animaux sauvages. Certaines études ont mis en évidence des différences entre populations urbaines et forestières chez différentes espèces, avec notamment un avancement du début de l’activité en milieu urbain. Toutefois, les mécanismes sous-jacents à ces divergences demeurent encore mal compris, en particulier la part respective des effets environnementaux immédiats et des effets génétiques. L’objectif général de ce projet est d’évaluer comment les perturbations environnementales nocturnes liées à l’urbanisation influencent les rythmes d’activité et la synchronisation de l’horloge biologique interne chez une espèce modèle d’oiseau, la mésange charbonnière (Parus major). Cette espèce est particulièrement adaptée à ce type d’étude en raison de sa large distribution, de sa capacité à occuper des habitats urbains contrastés, et de l’abondance de données écologiques et physiologiques disponibles. Plus spécifiquement, ce projet poursuit deux objectifs principaux. Premièrement, il vise à caractériser les différences entre populations naturelles urbaines et forestières, en comparant les profils d’activité journaliers, les niveaux d’activité globaux et certains traits physiologiques et comportementaux. Deuxièmement, il cherche à distinguer les effets environnementaux des contributions génétiques. En comparant des individus élevés dans des conditions identiques, il sera possible de tester si les différences observées sur les populations naturelles persistent en l’absence des contraintes environnementales propres aux habitats d’origine (urbain/forestier).

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances scientifiques dans le domaine de l’écologie urbaine et de l’étude des rythmes biologiques. Il s’inscrit dans le cadre d’un suivi ayant déjà permis l’étude de plusieurs effets de l’urbanisation sur la biodiversité. Ce projet, abordant une thématique nouvelle pour le suivi, contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels l’urbanisation influence les rythmes biologiques et le comportement des animaux sauvages, un enjeu important dans un contexte d’expansion urbaine mondiale. En combinant des données mesurées sur des populations naturelles et des mesures des oiseaux élevés dans les mêmes conditions environnementales, ce projet permettra de distinguer les effets de l’environnement de ceux liés à leur origine génétique entre populations urbaines et forestières. Cette approche intégrative est encore rare et constitue une avancée méthodologique importante.

Procédures

Une seule prise de sang (durée: 1 minute) et de petit volume (1% du volume sanguin total). Les autres observations seront exclusivement comportementales et réalisées sur des oiseaux libres de leurs mouvements.

Impact sur les animaux

Les principales contraintes pour les animaux sont liées à leur capture, leur transport, leur hébergement temporaire et les différentes manipulations réalisées dans le cadre de l'étude. La capture et les manipulations (baguage, mesures et prise de sang) peuvent provoquer un stress de courte durée et un léger inconfort. Dans de rares cas, elles peuvent entraîner des blessures mineures, comme la perte de quelques plumes ou un petit hématome après la prise de sang. Le transport et l'hébergement individuel temporaire peuvent également perturber momentanément le comportement des oiseaux, notamment en raison de la nouveauté de l'environnement et de l'absence temporaire de contacts sociaux. Le volume de sang prélevé sera largement inférieur aux recommandations en vigueur pour des oiseaux de cette taille et les animaux feront l'objet d'une surveillance régulière tout au long de l'étude. Cette étude cherche à comprendre comment l’horloge biologique influence les comportements naturels des animaux. Pour garantir des résultats fiables, il est important que les animaux restent dans de bonnes conditions, sans stress important ni effets indésirables.

Devenir

La grande majorité des oiseaux seront relâchés dans leur milieu d'origine en fin de procédure. Certains oiseaux ne pourront être relâchés, soit car ils proviennent d'une autre métropole où la mise en place du protocole de réhabituation à la vie sauvage est impossible (n=18), soit s'ils sont dans un état physique ne permettant pas de le relâcher. Un groupe d'oiseaux sera également mis à mort en vue d'analyses neurobiologiques des horloges biologiques (n=32).

Remplacement

Cette recherche fondamentale porte sur des animaux sauvages et vise notamment l’étude de leur physiologie et de leurs comportements, avec un intérêt particulier pour les mesures des rythmes endogènes. L’analyse des rythmes biologiques ne peut être réalisée sans le recours à des animaux vivants, impliquant nécessairement des manipulations et une expérimentation contrôlée. L'intérêt du projet de recherche est d'évaluer la dimension écologique et la réponse de l'organisme dans son entièreté face aux perturbations urbaines nocturnes.

Réduction

Les protocoles expérimentaux ont été élaborés afin de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, tout en assurant une puissance statistique suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. L’effectif total retenu, soit 80 poussins par an pour l’expérience en environnement contrôlé, ainsi que 30 mésanges charbonnières sauvages capturées par an, est fondé sur la littérature scientifique existante ainsi que sur des études antérieures comparables de l'étude des rythmes journaliers. La limitation du nombre d’individus est rendue possible par la réalisation de mesures multiples, incluant des paramètres liés aux rythmes journaliers tels que la période biologique propre ou la durée totale d'activité journalière, chez chaque individu. Cette approche permet d’optimiser l’exploitation des données recueillies tout en respectant le principe de réduction.

Raffinement

Les expérimentateurs ne manipuleront jamais les oiseaux seuls de façon à pouvoir se consulter entre personnes formées en cas de problème avec un oiseau. Cela permet de réduire les risques de nuisance due aux manipulations. Les opérateurs sont régulièrement ré-entrainés aux gestes adéquats et spécifiques à l’espèce étudiée. Les oiseaux en captivité avant l'expérience seront maintenus dans des espaces prévus et enrichis (e.g. volières de grande taille avec végétation naturelle et de nombreux perchoirs), leur fournissant des conditions de vie semi-naturelle. Tous les protocoles sont pensés pour réduire au maximum les nuisances et le stress des animaux, d'autant plus qu'un intérêt scientifique majeur du projet tient au suivi ultérieur en populations naturelles (paramètres démographiques et reproducteurs) des oiseaux qui auront été mesurés.

Choix des espèces

Mésange charbonnière (Parus major) La mésange charbonnière est un bon modèle d'étude car elle niche en nichoirs et donne ainsi accès aux paramètres démographiques de la population étudiée. C'est une espèce naturellement présente en ville comme en forêt, permettant une étude des effets de l'urbanisation. De plus, c'est un modèle d'étude qui peut à la fois être suivi en milieu naturel mais qui tolère aussi très bien la captivité. La mésange charbonnière est ainsi un modèle phare en écologie urbaine. Oiseaux sauvages : Les captures et les mesures de rythmes journaliers sont faites sur des nouvelles recrues âgées d'environ six mois, c'est-à-dire issues de la précédente reproduction. Oiseaux issus de l’élevage en environnement commun: Les mesures des rythmes journaliers sont faites sur des individus nés en 2024 et sur des nouvelles recrues âgées d'environ six mois. Les seules manipulations sur des poussins seront des mesures morphologiques pour étudier leur croissance durant l’élevage en environnement commun.

224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sous brève anesthésie, elles reçoivent une injection de virus AAV dans la région lombaire ou dans la veine de la queue, puis passent trois séries de tests : rotarod et analyse de la démarche pour la locomotion, filament de Von Frey appuyé avec une force croissante sur la patte pour la sensibilité, et des électrodes sous la peau mesurent la conduction nerveuse. Dans la seconde étude, des souris porteuses de mutations reproduisant deux formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth sont suivies jusqu'à six mois ou un an, l'effet thérapeutique restant à démontrer. Le porteur indique que des neurones dérivés de cellules de patients existent, mais affirme qu'ils ne permettent pas d'évaluer la toxicité "à l'échelle d'un organisme entier".

Objectifs

La maladie de Charcot Marie Tooth (CMT) est une maladie génétique touchant le système nerveux périphérique. Les patients souffrant de CMT présentent une faiblesse et atrophie musculaire prédominante aux membres inférieurs, ce qui entraine une difficulté pour se mouvoir et pour les formes de CMT les plus sévères, la nécessité d'un fauteuil roulant. Contrairement à la maladie de Charcot (ou sclérose latérale amyotrophique), la CMT ne réduit pas l’espérance de vie des patients, mais affecte fortement leur qualité de vie. Cette maladie est incurable et nécessite de trouver des thérapies. Dans le laboratoire nous étudions deux formes de CMT liés à deux gènes mutés différents: la forme CMT2A et la CMT4H . La CMT étant une maladie génétique, il est pertinent de mettre au point des thérapie génique visant à apporter un gène médicament pour corriger le gène muté grâce à virus rendu inoffensif appelé AAV. Cependant, bien que prometteurs pour la mise en place de futurs traitements, nous devons améliorer nos outils AAV et techniques d’injection afin de développer une thérapie ciblée, efficace et plus sûre permettant de cibler soit les motoneurones de la moelle épinière soit les cellules de Schwann des nerfs périphériques et d'éviter le ciblage d'organes tels que le foie qui peut s'avérer toxique. Ce projet vise à tester de nouveaux AAV récemment optimisés pour assurer une bonne expression dans le système nerveux et aucune dans le foie. Une fois ces AAV et modes d’injection optimisés chez des souris sauvages, nous testerons l’effet bénéfique de surexpression de gènes médicaments dans nos modèles CMT.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ce projet nous permettra ainsi de mettre au point de nouveaux outils et technologie permettant d’améliorer les approches de thérapie génique actuelles notamment de réduire les risques au moyen de vecteurs viraux plus spécifiques. Enfin ce projet a pour but de déterminer si ces traitements ont un effet bénéfique pour améliorer la pathologie CMT. A plus long terme ces approches pourront être mise en place pour d'autres formes de CMT liées à d'autres gènes mutés.

Procédures

Les animaux seront soumis à : une injection au niveau lombaire ou dans la veine de la queue. Ces interventions sont de courte durée (de l'ordre de 2-5 minutes); des tests de comportement permettant la mesure de la locomotion et de la sensibilité des pattes (maximum 15 minutes par animal pour chaque test) . Chaque test sera réalisé sur deux jours (entrainement et test) en incluant des moments de récupération pour les animaux entre chaque essais ( 5 minutes) et entre chaque test (au moins deux jours). A la fin de l'expérience, les animaux seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront à l’âge adulte des injections de virus AAV à visée thérapeutique soit par voie intrathécale lombaire soit par voie intraveineuse. Ces deux types d’injections se feront sous courte anesthésie gazeuse (isoflurane, 2-5 minutes maximum) et suite à une injection d'un anti douleur en amont. Les injections seront réalisées au moyen de fines seringues à insuline. En se basant sur notre expérience, ces injections entrainent peu d'effets indésirables et les animaux récupèrent très bien en quelques minutes. Néanmoins, elles peuvent très rarement induire une inflammation locale ou légères irritations et ainsi un léger inconfort qui sera surveillé dans les jours suivants l’intervention selon la grille de score et traitée le cas échéant. Au cours du traitement, les animaux subiront trois tests comportementaux à trois temps (avant, pendant et à la fin du traitement). Les tests permettant de mesurer la locomotion et démarche (rotarod et gait), entrainent peu d’inconfort aux souris. Le test VonFrey, qui a pour but d’analyser la réponse sensitive, entraîne un inconfort de courte durée suite à l’exposition à un filament de 0.5 mm qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris. Dans le cas de la mesure des vitesses de conduction nerveuse qui nécessite l’utilisation de petites électrodes que l’on insère en sous cutanée, les souris seront sous anesthésie gazeuse (10 minutes maximum).

Devenir

mise à mort et récupération des tissus

Remplacement

Il est difficile d'accéder aux cellules de patients du système nerveux périphériques (neurones moteurs et sensitifs et cellules de Schwann). Les neurones moteurs et sensitifs de patients peuvent être différentiés à partir de cellules pluripotentes humaines induites et constituer ainsi un modèle humain de la pathologie CMT pour les formes axonales. Néanmoins cela ne permet pas d'évaluer les risques de toxicité à l'échelle d'un organisme entier. Nos données préliminaires ont déjà montré un effet bénéfique d’approches de thérapie génique sur notre modèle in vivo de la CMT2A. Néanmoins notre type d’AAV actuel ne permet pas une spécificité totale du ciblage des motoneurones et nécessite des doses conséquentes. Afin de promouvoir la thérapie génique comme une option thérapeutique valable pour la CMT et son utilisation en clinique chez l’homme, nous avons besoin de développer des outils et des méthodes d’injections avec un profil de sécurité augmenté, ce qui passe par la spécificité de ciblage et la réduction des doses injectées.

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au minimum nécessaire : n= 10 animaux par groupe pour l'étude 1 et n=16 pour l’étude 2 pour mettre en évidence un effet significatif sur des paramètres de locomotion et de sensibilité en se basant sur nos travaux précédents et à l'aide de tests statistiques. Au total nous utiliserons 224 animaux répartis de la manière suivante : 80 animaux pour l’étape 1 nécessaire pour identifier le meilleur outil AAV et mode d'injections, 144 animaux pour établir la preuve de concept de plusieurs AAV thérapeutiques dans la CMT2A et CMT4H pour l’étape 2.

Raffinement

Nous nous assurerons de diminuer le stress des souris en les manipulant en coupe ou en tunnel. Nous optimisons l’enrichissement des animaux au moyen de maison en craft et petites buchettes. Afin d’optimiser le bien-être de nos animaux, nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage afin de réduire la douleur et le stress des animaux. Toutes les procédures de traitements sont réalisées sous analgésie et anesthésie profonde avec une couverture anti-douleur adaptée pour que l’animal ne ressente aucun signe d’inconfort. Des points limites et une grille de score ont été définis et seront appliqués pour suivre le bien-être des animaux au cours des expériences.

Choix des espèces

La souris reste un des modèles les plus aisés à modifier génétiquement et proche de l'homme (99% des gènes sont homologues). Elle est l'espèce la plus utilisée pour modéliser des maladies neuromusculaires telles que la CMT. Elles développent la plupart du temps des anomalies observées chez l'homme et ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces pathologies. Dans notre cas, les lignées utilisées pour la CMT2A et la CMT4H reproduisent une partie des anomalies histologiques et comportementales observés chez ces patients telles qu'une dénervation musculaire (CMT2A), des défauts de myéline (CMT4H) et des défauts locomoteurs tardifs détectés uniquement en conditions de test rotarod et qui ne s’aggravent pas avec le temps. L’espérance de vie des souris n’est pas réduite, également comme observée chez les patients. Pour l’étude 1, les injections seront réalisées sur des souris sauvages âgés de 8 semaines. Les animaux injectés seront mis à mort 1 mois après, ce qui est le temps minimal permettant d’observer l’expression du transgène de l’AAV. Pour l’étude 2, les traitements seront réalisés à 4.5 mois (proche du début des symptômes). La moitié des souris sera suivie jusqu’à 6 mois afin de déterminer l’effet thérapeutique dès le déclenchement des symptômes, l’autre moitié sera suivie jusqu’à un an afin d’évaluer l’effet thérapeutique à long terme.

Pour savoir si l'alimentation d'un père obèse nuit à la grossesse et à la santé de sa descendance, 2 344 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Des mâles sont nourris jusqu'à 120 jours d'un régime riche en graisses et en sucres qui leur fait prendre 20 à 25 % de poids et les rend résistants à l'insuline, et des femelles gestantes sont immobilisées chaque jour de la gestation et anesthésiées jusqu'à trois fois. Certaines souris passent jusqu'à deux fois seize jours isolées, dont huit en cage métabolique, et subissent un jeûne de 24 heures. Le porteur annonce des points limites "stricts et spécifiques au projet" sans en décrire un seul.

Objectifs

Certaines pathologies de la grossesse ont des conséquences immédiates sur la santé de la mère et de l’enfant, mais aussi à long terme sur leur santé métabolique, cardiaque et/ou neurologique. Des études récentes suggèrent que l’obésité paternelle peut modifier le contenu des spermatozoïdes. Ces modifications pourraient être transmises à l’embryon et favoriser l’apparition de complications pendant la grossesse, avec un impact sur la santé de la mère et des enfants. Ce projet vise à comprendre comment l’alimentation du père peut affecter la qualité de ses spermatozoïdes, la grossesse et la santé des mères et des enfants, à court et long terme. Il se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes par lesquels l’obésité du père augmente le risque de complications pendant la grossesse, et peut affecter la santé des mères et des enfants à court et long terme. Il permettra peut-être d’identifier des marqueurs dans le sperme, le placenta et l’embryon/fœtus, associés à des issues défavorables de la grossesse. Ces résultats pourraient contribuer à améliorer la santé maternelle et infantile, en développant des stratégies de prévention pour les familles à risque, voire des cibles thérapeutiques. L’obésité etant un problème de santé publique mondial, ce projet aura des répercussions importantes

Procédures

Interventions réalisées dans l'EU1: - Prélèvement sur animaux une seule fois (durée 10 secondes) - Prélèvements sanguins sur animaux 3 à 6 fois (durée 10 secondes par prélèvement). - Deux injections sur animaux (durée de chaque injection 30 secondes maximum). Interventions réalisées dans l'EU2: - Anesthésie des femelles gestantes. Fréquence : 3 fois sur toute la grossesse (durée 5 minutes). - Contention d’animaux (durée 10 minutes maximum), 5 fois avant la gestation puis tous les jours pendant la gestation. - Contention d’animaux (durée : 2 minutes). Fréquence : toutes les 2 semaines pendant 17 semaines, ou mensuellement pendant 6 mois. - Anesthésie. Fréquence : maximum 3 fois. (durée : 20 minutes par session). – Une injection. (durée 30 secondes maximum). - Mesure du métabolisme énergétique en cage individuelle. Fréquence maximum : 2 fois. (durée : 8 jours consécutifs, précédés d’une semaine d’individualisation). –Mise à jeun. Fréquence : 1 fois. (durée maximale 24h). Interventions réalisées dans EU1 et EU2 : – Mise sous régime riche en lipides et glucides. (durée maximale : 120 jours).- Gavage sur animaux, une à deux fois (durée 30 secondes). - Injection sur animaux une ou deux fois (durée 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les injections, les prélèvements, l’administration orale, les prélèvements sanguins et l’anesthésie générale causent un stress et une douleur légère de courte durée. La contention, lors de la mesure de la tension artérielle et lors de l'imagerie, ainsi que le transfert des animaux d’un établissement à l’autre causent un stress de courte durée. L’anesthésie peut causer une hypothermie et une désorientation au réveil de courte durée. La mise sous régime riche en lipides et glucides entraîne prise de poids (20–25 %) et une hyperglycémie à jeun, une intolérance au glucose et une résistance à l’insuline. L'ingestion de glucose et l'injection d'insuline entraînent respectivement une hyperglycémie et une hypoglycémie qui sont transitoires sur une période de 2h. L’individualisation cause un stress modéré lié à l’hébergement individuel (2 x 16 jours maximum) de type comportemental par absence de contacts tactiles.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issu de la dernière procédure pour collecte d'organes et analyses

Remplacement

Pour certaines études biochimiques et moléculaires, des lignées cellulaires seront utilisées. Dans le cadre de ce projet, il n’est pas possible de contourner l’utilisation de modèles animaux car il n'existe pas à ce jour d’approches alternatives permettant d’étudier l’impact de régimes alimentaires sur la reproduction masculine. L’impact du régime alimentaire paternel sur la grossesse ne peut également se faire que grâce à l’utilisation d’un modèle animal mammifère, comme la souris, pour que les résultats soient transférables à l’espèce humaine. D'une manière générale, les pathologies de la grossesse sont difficiles à étudier chez l’humain car il est éthiquement impossible d’exposer des femmes enceintes à des traitements expérimentaux.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les procédures ont été consciencieusement élaborés afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Lors de l'anesthésie, les animaux seront maintenus sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. L’état général des animaux sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué aux responsables du projet. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été mis en place.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour étudier la physiologie, grâce à sa population homogène et à ses similitudes avec la physiologie humaine, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus. Elle est largement utilisée pour simuler des pathologies humaines et mener des études précliniques. La conservation génétique entre la souris et l’homme en fait un modèle privilégié pour étudier la reproduction et le métabolisme. L'utilisation de souris transgéniques permettra de modéliser les complications de la grossesse en produisant certains symptômes (i.e. hypertension gestationnelle et protéinurie) qui ne sont pas fréquemment observés chez la souris. Des souris femelles et mâles à différents temps de développement et à l’âge adulte seront nécessaires à cette étude, afin de comprendre les effets à court et long terme d’un régime paternel obésogène.