Procédures modérées

Pour tester pendant six mois des électrodes cérébrales souples destinées aux troubles de la conscience, 58 miniporcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse de leurs tissus. Ils subissent l'implantation chirurgicale des électrodes vers huit semaines d'âge, des séances d'imagerie d'une à deux heures sous anesthésie, puis des enregistrements cérébraux éveillés ou sous une anesthésie générale qui peut durer quatre heures et doit simuler ces troubles, parfois sous microstimulation ou sous médicaments. Le porteur prévoit un hébergement individuel qui peut durer jusqu'à 180 jours et cite parmi les risques la douleur, des troubles neurologiques, l'infection ou le rejet de l'implant. Il retient le miniporc pour la taille de l'implant, "semblable à celui destiné à l'Homme", et parce que les mouvements de son cerveau rendent les signaux aussi instables que chez l'humain.

Objectifs

Jusqu’à 6 % de la population mondiale souffrirait de troubles de la conscience (DoC) caractérisés par une altération aigue et globale des fonctions mentales et une incapacité à répondre à des stimuli. Les DoC comprennent le coma, l’état végétatif (absence de conscience en dépit d’une vigilance préservée) et l’état de conscience minimale (mais incapacité à communiquer). Ils sont dus à une perte de l’intégrité de réseaux neuronaux (comprenant des millions de neurones interconnectés) et de leurs neurotransmetteurs qui régulent l’état d’éveil et de conscience. Les causes des DoC sont diverses : traumatisme crânien, hémorragie, ischémie, infection… induisant de multiples mécanismes d’un patient à l’autre qu’il est indispensable d’explorer afin d’élaborer une thérapie personnalisée. A ce jour, aucun traitement n’est reconnu. Des études utilisant des agents pharmacologiques ou une neurostimulation ont montrées des améliorations chez certains patients. Mais les bénéfices sont hétérogènes et la neurostimulation, lourde et peu accessible pour les patients, nécessite un gros développement pour la mise en place de paramètres personnalisés. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les DoC et de permettre la mise en place d’une thérapie personnalisée. Pour cela, nous utiliserons un implant innovant biocompatible miniature mimant les propriétés mécaniques du tissu cérébral et minimisant la réponse immunitaire. Ce dispositif unique offre aussi la possibilité d’effectuer des enregistrements de l’activité cérébrale et de la neurostimulation des zones cérébrales périphériques au plus profondes. Les électrodes seront implantées dans des régions cérébrales impliquées dans les DoC, sur 6 mois chez le miniporc, afin d’évaluer ses performances d’enregistrements et de neurostimulations à long terme. Le miniporc est un modèle adapté de par une anatomie cérébrale et des contraintes chirurgicales similaires à l’Homme. Les DoC seront simulés grâce à des niveaux d’anesthésie plus ou moins profonds. Les principaux agents pharmacologiques utilisés chez l’Homme seront aussi administrés afin d’évaluer leur action sur l’activité cérébrale.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait, à court terme, permettre de valider et de mettre en place chez le miniporc une nouvelle approche d’anesthésie déjà bien développée chez l’Homme et qui présente de nombreux avantages en comparaison aux méthodes « conventionnelles » : réveil et récupération plus rapide, dosage plus précis, profondeur d’anesthésie plus stable et contrôlable (modérée ou profonde) et moins d’effets secondaires. Elle permettra aussi d’enrichir les connaissances sur le cerveau du miniporc grâce aux imageries réalisées ce qui nous permettra d’améliorer la précision de futures chirurgies. Les autres bénéfices attendus du projet sont d’évaluer à long terme un nouveau type d’électrodes miniatures et souples, mimant les propriétés mécaniques du tissu cérébral ce qui minimise la réponse immunitaire. Ces électrodes, qui permettent un enregistrement tout au long de leur axe, offriraient une possibilité de recueillir des signaux cérébraux sur une importante profondeur et permettraient d’enregistrer de multiples zones cérébrales avec un seul dispositif. Ici nous les utiliserons dans le cadre des DoC afin de mieux évaluer les mécanismes impliqués dans cette pathologie et d’analyser les effets thérapeutiques d’une neurostimulation. La double fonction des électrodes, enregistrements et neurostimulation, leur confèrerait également un potentiel de traitement dans certains troubles neurologiques. La souplesse des électrodes, tout comme leur capacité d’enregistrements, pourraient aussi grandement participer à développer le domaine des interfaces cerveau-machine qui prend de plus en plus d’ampleur.

Procédures

Avant la chirurgie, des séances d’imagerie (de 1 à 2h00) seront réalisées sous anesthésie afin de déterminer la meilleure trajectoire d’implantation des électrodes. Pour le transport entre la zone d’hébergement (stabulation) et le service d’imagerie, les animaux seront anesthésiés par injection afin d’éviter tout stress. La chirurgie d’implantation sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux seront aussi exposés, sous anesthésie générale, après la chirurgie, à une séance d’imagerie (de 1 à 2h) mensuelle au maximum pour vérifier la position des électrodes. Après la chirurgie et une période de récupération d’une semaine au minimum, les animaux seront exposés éveillés (1h environ) et sous anesthésie générale pour simuler les DoC (qui se limitera à 4h pour ne pas trop les fatiguer) à des sessions d’enregistrement de l’activité cérébrale : signaux EEG (électroencéphalogramme). Le 1er mois 2 enregistrements par semaine sont prévus (espacés de 72h au minimum) et les 5 mois suivants un enregistrement toutes les 2 semaines. Après obtention d’une ligne de base de l’activité cérébrale, les enregistrements seront effectués, bimensuellement au maximum, sous microstimulation cérébrale ou sous agents pharmacologiques utilisés chez l’Homme pour traiter les DoC. Chaque animal pourra être soumis, sous anesthésie générale, à une prise de sang si son état requière une analyse. L’euthanasie sera effectuée sous anesthésie générale et analgésie.

Impact sur les animaux

Tout acte chirurgical visant à poser un implant cérébral en profondeur, qui doit être testé pour confirmer sa fonctionnalité à long terme, peut engendrer chez les animaux : douleur, faibles pertes de poids, hypothermie, déshydratation, troubles neurologiques, risque d’infection au niveau du site d’incision ou d’implantation. Le réveil après une anesthésie générale peut induire une désorientation et un stress de courte durée. Une anesthésie générale peut engendrer un état de fatigue transitoire. La pose d’un dispositif implantable peut induire une irritation, une réaction inflammatoire, une infection ou encore un rejet. MODIFICATION L’hébergement individuel (sans isolement visuel et olfactif) qui sera réduit au minimum nécessaire peut engendrer un stress pourra durer au maximum 180 jours. L’hébergement individuel (sans isolement visuel et olfactif) qui pourrait être mis en oeuvre pour des raisons expérimentales peut engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés selon un protocole approprié, afin d’obtenir les prélèvements requis pour les analyses histologiques pour compléter scientifiquement l’étude. L’étude des tissus est indispensable pour valider la bonne tolérance de l’implant à long terme.

Remplacement

Même si les techniques d’aujourd’hui comme la construction d’organoïdes permettent de limiter l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques, il n’existe pas à ce jour de modèle in vitro ou in silico permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques. Les mécanismes des DoC étant très mal connus, ces derniers ne peuvent être reproduits qu’in vivo pour le moment. Nous devons aussi évaluer et valider à long terme l’intégrité et la fonctionnalité du dispositif implantable composé d’électrodes souples, ce qui ne peut être réalisé que sur des organismes entiers, complets avec leur physiologie et leur complexité sur le plan biologique. En amont, des premiers tests de cytotoxicité et de biocompatibilité, pour sécuriser au maximum l’implantation des dispositifs, ont été réalisés et validés, notamment chez le rongeur.

Réduction

Même si les techniques d’aujourd’hui comme la construction d’organoïdes permettent de limiter l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques, il n’existe pas à ce jour de modèle in vitro ou in silico permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques. Les mécanismes des DoC étant très mal connus, ces derniers ne peuvent être reproduits qu’in vivo pour le moment. Nous devons aussi évaluer et valider à long terme l’intégrité et la fonctionnalité du dispositif implantable composé d’électrodes souples, ce qui ne peut être réalisé que sur des organismes entiers, complets avec leur physiologie et leur complexité sur le plan biologique. En amont, des premiers tests in vitro pour sécuriser au maximum l’implantation des dispositifs, ont été réalisés et validés, notamment chez le rongeur.

Raffinement

Les animaux seront habitués à la manipulation par des personnes expérimentées, afin d’assurer leur bien-être pendant les changes, les pesées, les protocoles, les anesthésies, les prises de sang ou tous soins nécessaires post chirurgie. Ils seront également entraînés par renforcement positif à rester dans un hamac avant le début des sessions d’enregistrements. Pour chaque chirurgie, l’animal sera sous anesthésie générale et analgésie, ses fonctions cardiaques et respiratoires seront monitorées tout comme la quantité d’oxygène dans le sang, sa température corporelle qui sera maintenue à 37 °. Un gel ophtalmique sera également appliqué pour éviter son inconfort. Des soins post opératoires adéquates seront adaptés pour chaque animal et des antalgiques seront utilisés le temps nécessaire. Toutes les imageries ou les prises de sang en cas de besoin seront réalisées sous anesthésie générale. L’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement tout au long de l’expérience, avec une surveillance accrue en sortie de chirurgie et d’anesthésie générale et tout sera mis en œuvre pour que les animaux aient un niveau d’inconfort aussi limité que possible. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués et en cas d’effets inattendus des traitements appropriés seront immédiatement mis en œuvre et/ou il pourra être décidé d’interrompre l’expérimentation. En parallèle, le vétérinaire sera alerté. Lors d’un hébergement individuel prolongé, en plus d’une interaction renforcée avec le personnel et afin de préserver une interaction sociale, les animaux seront mis en contact autant que possible (au moins 3 fois/semaine), selon leur comportement, au minimum 15 min sous surveillance afin de s’assurer que tout se passe sans incident.

Choix des espèces

Compte tenu des objectifs de l’étude, le modèle porcin est plus pertinent que le modèle rongeur notamment du fait de la taille de l’implant à tester (semblable à celui destiné à l’Homme), de la durée sur laquelle le dispositif doit rester implanté et du déroulé des sessions d’enregistrement et de neurostimulation. Le miniporc offre aussi la possibilité de simuler les conditions d’une future implantation humaine du dispositif. Enfin, les mouvements du cerveau produits chez le miniporc génèrent une instabilité des signaux similaire à celle rencontrée chez l’Homme. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux adultes du fait de la durée d’implantation (6 mois) et de la taille des implants. Des animaux juvéniles âgés de 6 semaines (permettant une meilleure habituation à la manipulation et une meilleure constitution des groupes sociaux du fait de leur jeune âge) seront réceptionnés et utilisés seulement après une période d’acclimatation d’une semaine. Les chirurgies seront réalisées sur les animaux jeunes adultes d’environ 8 semaines. Les animaux seront utilisés dans la procédure à l’âge adulte, entre 2 et 8 mois.

Électrostimulées sous anesthésie, jusqu'à trois essais par séance et une séance toutes les deux semaines, 6 chauves-souris d'espèces d'Afrique centrale, classées parmi les autres mammifères, vont être utilisées pour mettre au point une collecte de sperme, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet vise à faciliter de futurs prélèvements chez ces espèces, réservoirs supposés du virus Ebola, et le porteur parle de reproduire la méthode "sur les animaux sauvage". Il décrit la stimulation comme un "effort physique intense", avec contractions musculaires et mouvements involontaires, puis affirme que "la grande majorité des actes techniques à mettre en place sont peu invasives". Les 6 sont déclarées réutilisées, alors qu'il écrit que "la plupart des animaux seront gardés en vie", sans dire ce qu'il advient des autres.

Objectifs

Ce projet vise à développer et améliorer une méthode permettant de collecter du liquide séminal chez certaines espèces de chauves-souris d’Afrique centrale. Ces animaux sont étudiés car ils peuvent être impliqués dans la circulation de virus responsables de maladies graves chez l’Homme. L’étude vise à déterminer les paramètres techniques optimaux de cette méthode, notamment les caractéristiques de l’équipement utilisé et les conditions de stimulation, afin de mettre au point un protocole de prélèvement fiable et le moins invasif possible pour les animaux. Cette démarche est motivée par des observations faites chez l’être humain, où le virus Ebola a été détecté dans le sperme de certains survivants longtemps après la guérison. Ces résultats suggèrent que le virus peut persister dans les organes reproducteurs mâles, ce qui souligne l’intérêt de mieux comprendre ces mécanismes chez les espèces animales étudiées.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront de faciliter la collecte d’échantillons biologiques utilisables dans le cadre de recherches sur le virus Ebola, dont certaines chauves-souris sont des réservoirs potentiels. Une meilleure compréhension des mécanismes de transmission de ces agents pathogènes représente un enjeu majeur en santé publique, notamment dans les zones à risque d’émergence.

Procédures

Trois essais du même protocole d’électrostimulation pourront être réalisés sur un même animal. Cette procédure pourra être répétée au maximum une fois par deux semaines. Les animaux seront anesthésiés pendant la procédure, et la durée de celle-ci sera conditionnée par la durée de l’anesthésie, généralement comprise entre 10 et 20 minutes.

Impact sur les animaux

L’anesthésie peut provoquer des effets transitoires tels qu’une respiration ralentie, des variations de la température corporelle ou un réveil plus lent dans de rares cas. La méthode utilisée pour collecter les échantillons repose sur une stimulation contrôlée qui peut être perçue comme un effort physique intense pour l’animal. Elle peut entraîner des contractions musculaires, des mouvements involontaires et une gêne temporaire, ainsi qu’une fatigue musculaire de courte durée. Un faible risque d’irritation locale ou de léger saignement peut également exister.

Devenir

Dans ce projet, la grande majorité des actes techniques à mettre en place sont peu invasives et n’entraînent ni douleur significative ni altération durable de l’intégrité ou du bien-être de l’animal. Ainsi, la plupart des animaux seront gardés en vie à l'issue de leur procédure, afin de pouvoir être réutilisés, après avis du vétérinaire sanitaire et de la structure chargée du bien-être animal, prenant en compte un temps de repos suffisant.

Remplacement

L’objectif du projet nécessite l’étude directe de la fonction reproductive chez des chauves-souris vivantes, ce qui ne peut pas être reproduit à l’aide de méthodes alternatives telles que des modèles in vitro, in silico ou l’utilisation de tissus isolés. En effet, la collecte de liquide séminal par électroéjaculation repose sur des mécanismes physiologiques complexes (réponses neuro-musculaires et hormonales) qui nécessitent un organisme entier fonctionnel.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera limité au strict nécessaire pour assurer la reproductibilité de la procédure, afin de pouvoir le reproduire sur les animaux sauvage. Les animaux ne seront utilisés qu’une seule fois par deux semaines, avec des périodes de repos suffisantes entre les séances. Chaque animal peut être utilisé pour plusieurs essais, permettant de maximiser les données obtenues et de limiter le recours à de nouveaux individus.

Raffinement

Le protocole expérimental a été conçu afin de minimiser la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Une période d’acclimatation de 14 jours sera respectée avant toute manipulation. Les procédures seront réalisées sous anesthésie afin de limiter l’inconfort et le stress des animaux. Les paramètres d’électrostimulation seront ajustés progressivement pour réduire au maximum les effets indésirables. Les manipulations seront effectuées par du personnel formé et expérimenté, dans des conditions adaptées à l’espèce. Un suivi clinique rapproché sera assuré après chaque procédure, avec mise en place de critères d’arrêt si nécessaire, afin de garantir le bien-être des animaux tout au long du projet. Seuls les animaux en bonne santé participent à ces séances de mise au point de la technique. Les séances sont interrompues si les animaux montrent un signe de mal-être ou de stress trop important. Des critères d'arrêt anticipé, très précoce sont mis en place pour éviter dee solliciter un animal qui n'est pas en parfaite santé et de les soigner au moindre signe de mal-être. De plus, les conditions d’hébergement seront adaptées à l’espèce, avec des volières spacieuses permettant aux chauves-souris de se déplacer librement, de se suspendre la tête en bas et de déployer leurs ailes. Bien qu’il n’existe pas de cadre réglementaire spécifique pour l’hébergement de ces animaux, les installations ont été définies sur la base des retours d’expérience de structures spécialisées et des recommandations issues de la littérature, afin d’assurer des conditions adéquates et conformes aux besoins biologiques de l’espèce.

Choix des espèces

Les espèces de chauves-souris sélectionnées dans ce projet sont reconnues comme étant des réservoirs potentiels de virus d'Ebola en Afrique centrale, ce qui justifie leur intérêt dans le cadre des recherches menées. Par ailleurs, les connaissances relatives à leur biologie reproductive, et en particulier à la collecte de liquide séminal, restent limitées. L’utilisation de ces espèces est donc nécessaire pour développer et adapter des méthodes expérimentales spécifiques, non transposables directement à d’autres modèles animaux. Les animaux utilisés seront des chauves-souris adultes. Ce choix se justifie par le fait que la procédure prévue nécessite des animaux ayant atteint un développement physique complet et une taille suffisante pour permettre une manipulation sûre.

Déjà nées et disponibles à l'animalerie, 20 souris âgées de 18 mois, dont certaines génétiquement modifiées pour produire moins de BDNF dans leurs vaisseaux, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune passe par l'enfouissement de billes, le test du splash, le test clair/obscur, la suspension par la queue, le labyrinthe en Y, la reconnaissance d'objet, le labyrinthe de Barnes, l'agrippement et le rotarod, puis par quatre jours d'isolement dont 48 heures sur grille. Un mois plus tard, elles reçoivent une dose létale, puis leur thorax est ouvert pour prélever du sang dans le cœur. Le porteur présente leur emploi comme une façon de les "valoriser" plutôt que de les tuer sans usage, pour des résultats qui "pourraient contribuer" à comprendre le déclin lié à l'âge.

Objectifs

Avec l’avancée en âge, de nombreuses fonctions de l’organisme se dégradent progressivement. Le vieillissement s’accompagne notamment d’une diminution des capacités de mémoire et d’apprentissage, de modifications de l’humeur, d’une baisse des capacités physiques ainsi que de perturbations du métabolisme énergétique. Des travaux récents ont montré que les vaisseaux sanguins du cerveau et des muscles produisent une molécule importante pour le bon fonctionnement de ces organes. Cette production semble diminuer dans plusieurs maladies associées au vieillissement et aux atteintes vasculaires. Cependant, son rôle exact dans les modifications observées au cours du vieillissement reste encore mal connu. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment l’altération de cette molécule influence les fonctions cérébrales, les capacités physiques et l’équilibre énergétique dans un contexte de vieillissement. Pour cela, des souris âgées présentant une diminution de cette molécule seront comparées à des souris témoins. Les animaux réaliseront des évaluations permettant d’étudier leur mémoire, leur comportement, leurs capacités motrices ainsi que certains paramètres liés à leur métabolisme. À l’issue de ces évaluations, des prélèvements de sang et de tissus seront réalisés afin de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués. Les connaissances obtenues pourraient permettre de mieux comprendre les liens entre vieillissement, fonctionnement des vaisseaux sanguins, cerveau, muscles et métabolisme, et contribuer à l’identification de nouvelles pistes de recherche pour préserver la santé au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Le vieillissement s’accompagne fréquemment d’une diminution des capacités de mémoire, d’apprentissage, d’une baisse des performances physiques ainsi que de modifications du métabolisme. Les mécanismes à l’origine de ces changements restent encore imparfaitement compris. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle joué par certaines molécules produites par les vaisseaux sanguins dans le maintien du bon fonctionnement du cerveau, des muscles et du métabolisme au cours du vieillissement. Les résultats attendus permettront d’améliorer les connaissances sur les liens entre vieillissement, fonctionnement des vaisseaux sanguins, capacités cognitives, activité physique et équilibre énergétique. Ils pourraient contribuer à identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans le déclin lié à l’âge et à faire émerger de nouvelles pistes de prévention ou de prise en charge destinées à préserver l’autonomie et la qualité de vie des personnes âgées. À plus long terme, une meilleure compréhension des interactions entre cerveau, muscles et vaisseaux sanguins pourrait favoriser le développement de nouvelles approches thérapeutiques ou préventives visant à limiter les conséquences du vieillissement sur la santé physique et cognitive.

Procédures

Les animaux seront soumis à une batterie d’évaluations comportementales, cognitives, motrices et métaboliques. Chaque animal réalisera 4 tests émotionnels : enfouissement des billes (1 × 30 min), splash (1 × 5 min), clair/obscur (1 × 10 min) et suspension par la queue (1 × 6 min). Les fonctions cognitives seront évaluées par un labyrinthe en Y (1 × 8 min), trois sessions de reconnaissance d’objet (10, 5 et 5 min) et un labyrinthe de Barnes comprenant une habituation, 4 jours d’acquisition avec 4 essais/jour de 180 s maximum et deux évaluations de mémoire de 180 s. Les capacités motrices seront évaluées par 3 essais d’agrippement (

Impact sur les animaux

Les animaux pourront être soumis à un stress léger et temporaire lié aux manipulations, aux déplacements entre les zones d’hébergement et d’expérimentation, à certains tests comportementaux ou à l’exposition à un nouvel environnement. Ces effets pourront se traduire par une augmentation temporaire de la vigilance, une légère diminution de l’activité ou un comportement d’évitement. Ils sont attendus comme étant de courte durée, généralement limités à quelques minutes ou quelques heures après les manipulations. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel formé afin de détecter rapidement tout signe d’altération de leur état général. Leur poids sera contrôlé régulièrement et toute anomalie fera l’objet d’une prise en charge adaptée. Les animaux utilisés présentent une modification génétique susceptible d’influencer certaines fonctions liées au vieillissement, au comportement ou au métabolisme. Toutefois, aucun effet sévère spontané n’est attendu dans les conditions normales d’élevage. Des mesures spécifiques seront mises en œuvre afin de limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux tout au long de l’étude.

Devenir

Les mêmes animaux seront utilisés pour l’ensemble des évaluations prévues dans le projet (comportement, capacités physiques et métabolisme). Cette organisation permet de limiter le nombre total d’animaux nécessaires à l’étude, conformément au principe de réduction du nombre d’animaux utilisés en recherche. À l’issue des expérimentations, une période de repos sera respectée avant la phase finale de l’étude. La mise à mort des animaux est nécessaire afin de permettre la collecte de sang et de tissus indispensables aux analyses biologiques, biochimiques et histologiques prévues dans le projet. Ces prélèvements permettront d’étudier les mécanismes associés aux modifications comportementales, physiques et métaboliques observées et de mettre en relation les résultats obtenus chez chaque animal. La réutilisation des animaux n’est pas envisagée car les prélèvements terminaux nécessaires aux objectifs scientifiques du projet sont incompatibles avec leur maintien en vie.

Remplacement

Les objectifs de ce projet nécessitent l’utilisation d’animaux car il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant de reproduire l’ensemble des interactions entre le cerveau, les muscles, les vaisseaux sanguins et le métabolisme au sein d’un organisme vivant vieillissant. Les modèles cellulaires ou informatiques peuvent apporter des informations utiles sur certains mécanismes biologiques, mais ils ne permettent pas d’étudier le fonctionnement coordonné de plusieurs organes ni les conséquences du vieillissement sur l’ensemble de l’organisme. Ce projet vise à comprendre le rôle d’une molécule impliquée dans la communication entre différents organes et dans le maintien des fonctions cérébrales et métaboliques chez la souris âgée.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été limité au strict nécessaire afin de répondre aux objectifs scientifiques tout en réduisant autant que possible le recours aux animaux. Les animaux utilisés étaient déjà disponibles et n’ont pas été produits spécifiquement pour ce projet. Leur utilisation permet ainsi de valoriser des animaux existants dans le cadre d’une étude scientifique pertinente plutôt que de les euthanasier sans utilisation à des fins de recherche. Par ailleurs, les mêmes animaux participeront à plusieurs évaluations au cours du projet, ce qui permet de recueillir un maximum d’informations tout en limitant le nombre total d’animaux nécessaires. Cette démarche s’inscrit dans le principe de réduction, qui vise à utiliser le plus petit nombre possible d’animaux compatible avec l’obtention de résultats scientifiquement fiables.

Raffinement

Les procédures ont été conçues afin de limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux. Les manipulations seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, et les animaux seront progressivement habitués aux manipulations ainsi qu’aux différents environnements expérimentaux lorsque cela est possible. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur et feront l’objet d’une surveillance régulière tout au long de l’étude. Une attention particulière sera portée à leur état général, leur comportement, leur activité, leur poids et leur prise alimentaire afin de détecter rapidement tout signe de mal-être. Certaines adaptations des conditions d’hébergement pourront être mises en place afin de répondre aux besoins scientifiques du projet tout en maintenant des conditions de bien-être adaptées. Si nécessaire, des mesures complémentaires de soutien seront mises en œuvre. Les déplacements entre les deux établissements seront effectués dans le véhicule de l’animalerie centrale, sur un trajet court. Les souris resteront dans leurs cages habituelles, avec leurs congénères, afin de préserver leurs repères et la stabilité des groupes sociaux. Les conditions de transport seront adaptées pour limiter le stress, et l’état général des animaux sera vérifié à leur arrivée. Des critères d’arrêt prédéfinis seront appliqués afin d’éviter toute souffrance inutile. Enfin, lors de la phase terminale, les animaux recevront préalablement un produit sédatif afin de diminuer leur vigilance et leur réactivité, puis une dose létale d’un produit euthanasique. L’ouverture du thorax et le prélèvement sanguin ne seront réalisés qu’après l’arrêt respiratoire, dans le cadre d’une procédure post-mortem, afin d’éviter toute douleur liée à ces gestes.

Choix des espèces

La souris est un modèle largement utilisé pour étudier le fonctionnement de l’organisme et les effets du vieillissement. De nombreux mécanismes biologiques impliqués dans le fonctionnement du cerveau, des muscles, des vaisseaux sanguins et du métabolisme sont similaires chez la souris et chez l’être humain. Cette espèce permet également d’étudier les interactions entre différents organes au sein d’un organisme vivant, ce qui n’est pas possible avec des modèles cellulaires. Les animaux utilisés dans ce projet sont des souris âgées de 18 mois. Cet âge a été choisi car il permet d’étudier les conséquences du vieillissement sur les capacités cognitives, les fonctions physiques et le métabolisme dans un contexte où les modifications liées à l’âge sont déjà présentes. Ce modèle est donc particulièrement adapté pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans un contexte de vieillissement et leurs conséquences sur le fonctionnement de l’organisme.

Une partie des souris de ce projet porte une mutation introduite pour bloquer une voie alternative de l'autophagie, et 3 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes et leurs tumeurs. Une tumeur leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent des immunothérapies par injection dans la tumeur, dans la veine ou dans l'abdomen, deux fois par semaine jusqu'à cinq semaines pour cette dernière voie. Le porteur indique que le volume tumoral en fin d'expérience peut réduire leur mobilité, que des lésions peuvent apparaître sur les tumeurs, et prévoit de répéter chaque expérience trois fois. Parmi les raisons du choix de la souris, il cite des "coûts limités de maintenance" et un "taux de reproduction élevé".

Objectifs

Les travaux d’un autre groupe de recherche ainsi que nos précédents travaux suggèrent qu’une voie alternative de l’autophagie est activée dans les cellules immunitaires présentes dans les tumeurs cancéreuses. Ce processus pourrait influencer l’action des cellules immunitaires contre les cellules cancéreuses. Notre objectif est donc d’évaluer le rôle de cette voie alternative l’autophagie, qu’elle se produise spontanément ou en réponse à des immunothérapies anticancéreuses, dans l’activité antitumorale des cellules immunitaires et l’efficacité des immunothérapies.

Bénéfices attendus

Les progrès réalisés dans la compréhension des mécanismes de l'immunité antitumorale, associés au développement clinique des immunothérapies, ont profondément transformé la prise en charge de nombreux cancers. Toutefois, malgré des bénéfices cliniques parfois spectaculaires et durables, leur efficacité demeure limitée à une fraction des patients. Les résistances primaires ou acquises, l'hétérogénéité des réponses ainsi que les effets indésirables liés à l'activation du système immunitaire constituent encore des obstacles majeurs à leur utilisation. Nos récents travaux indiquent qu’une voie alternative de l’autophagie est activée dans les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs et qu’elle pourrait réguler leur activité anticancéreuse. Ce projet propose d’évaluer pour la première fois le rôle de cette voie alternative de l’autophagie dans l’immunité antitumorale et l’efficacité de différentes immunothérapies anticancéreuses in vivo, grâce à un modèle murin original et spécifique. Les résultats obtenus permettront de déterminer si cibler cette voie alternative de l’autophagie pourrait permettre d’améliorer les réponses immunitaires dirigées contre les cellules cancéreuses chez les patients atteints d’un cancer solide.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection de cellules cancéreuses en sous-cutanée afin leur greffer une tumeur. Cette injection (30 sec) sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse afin de limiter les nuisances. Les traitements ou leurs témoins seront administrés par : - voie intratumorale (30 sec/injection, 2 injections à 5 jours d’intervalle), anesthésie générale gazeuse afin de limiter les nuisances. ET/OU - par voie intraveineuse (1 min par injection, utilisation d’un système de contention adapté, 3 injections à 3 ou 4 jours d’intervalle). ET/OU - par voie intrapéritonéale (30 sec/injection, 2 fois par semaine jusqu'à 5 semaines).

Impact sur les animaux

Les contentions et anesthésies gazeuses réalisées pour permettre l’administration des cellules cancéreuses, la mesure de la taille des tumeurs ou les traitements peuvent provoquer un léger stress et inconfort chez les animaux. Des lésions locales peuvent apparaître sur les tumeurs ou aux points d’injection des traitements. Le volume tumoral en fin d’expérimentation peut impacter la mobilité des animaux et donc leur état général. L’administration de certains traitements pourrait générer des signes transitoires de maladies associée à l’induction d’une réponse inflammatoire systémique.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de collecter leurs organes et tumeurs et d’en analyser le contenu cellulaire et différents paramètres biologiques nécessaires au projet.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions cellulaires possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire. En conséquence, pour être prédictifs, les évaluations de nouvelles thérapies anticancéreuses doivent être réalisées sur des organismes vivants. En outre, nous testons la contribution d’une voie alternative de l’autophagie dans les réponses immunitaires antitumorales. A ce jour, il n’est possible d’inactiver spécifiquement ce processus que par une approche génétique. Notre modèle murin est donc le plus adapté pour répondre à notre question biologique et identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans les interactions entre cellules immunitaires et cellules cancéreuses. Les données obtenues seront complétées d’expériences menées in vitro et d’une approche de développement de modulateurs pharmacologiques spécifiques utilisables in vitro à partir de cellules primaires humaines.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance statistique pour permettre d’évaluer des différences de croissance tumorale fines. Les expériences seront réalisées par des expérimentateurs parfaitement formés, et dans la mesure du possible par la même personne afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que les animaux soient génétiquement identiques permet aussi une meilleure reproductibilité et une réduction de la taille des groupes. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 3 fois de manière indépendante.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans un environnement adapté et enrichi. L’hébergement se fera en groupe pour favoriser les contacts sociaux et éviter le stress et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nids (ex : frisottis) ou leur permettant de se cacher (contenant ou tube opaque) et de développer leur répertoire comportemental sera fourni. Afin de prendre les mesures nécessaires pour améliorer le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par le personnel de l’animalerie et trois fois par semaine par les expérimentateurs lors de leurs interventions. Les souris disposeront d’une phase d’habituation à être manipulées par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Des antalgiques seront utilisés en cas de douleur observée. En cas de déshydratation, une injection sous-cutanée de sérum physiologique pourra être réalisée. L’accès à la nourriture (humidifiée si besoin) pourra être facilité en cas de réduction de mobilité. Si les points limites que nous avons établis sont atteints, les souris seront mises à mort conformément à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, il est nécessaire de fixer des paramètres génétiques (introduction d’une mutation ponctuelle), ce qui n’est faisable qu’à partir d’un animal génétiquement modifié. La souris dont la génétique est bien connue, est quantitativement la plus représentée des espèces d’animaux transgéniques, il s’agit donc d’une espèce pertinente. En outre, l’étude des interactions entre cellules cancéreuses et cellules immunitaires du microenvironnement tumoral chez la souris est une approche validée par la communauté scientifique dans notre domaine de recherche. Ce modèle animal est le plus utilisé pour l’évaluation préclinique de l’efficacité anticancéreuse de nouvelles thérapies. D’un point de vue technique, les coûts limités de maintenance, et le taux de reproduction élevé de la souris permettront la création des groupes d’animaux requis sur une période de courte durée. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 24 semaines), âge auquel les animaux possèdent un système immunitaire mature permettant une meilleure stabilité et meilleure reproductibilité des expériences.

Anesthésiées à l'isoflurane après deux injections d'un marqueur, des souris gestantes sont tuées par dislocation cervicale, puis leurs embryons sont prélevés entre le 11e et le 18e jour de gestation, ceux de la dernière semaine étant décapités pour disséquer leur cerveau. 219 souris d'une lignée porteuse de la variation génétique la plus fréquente chez des patients atteints d'un trouble du neurodéveloppement vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées. Le projet cherche à dater l'apparition d'anomalies de la prolifération des neurones avant la naissance. Le porteur ne dit pas combien d'embryons sont tués ainsi, ni s'ils sont comptés parmi les 219 souris déclarées.

Objectifs

Nous étudions le rôle d'une protéine impliquée dans le développement du cerveau au cours de la vie embryonnaire. Chez l'être humain, des altérations de cette protéine sont responsables d'un trouble du neurodéveloppement associant le plus souvent une déficience intellectuelle légère à modérée, des troubles du spectre de l'autisme et des troubles de l'attention. Certains patients présentent également des anomalies de la structure du cerveau, notamment une hypoplasie du cervelet ou une dilatation des ventricules cérébraux, mais ces atteintes ne sont pas constantes. Comme cette protéine est exprimée dès les premières étapes du développement embryonnaire, nous faisons l'hypothèse que les mécanismes responsables de ces anomalies apparaissent très précocement, avant même que les défauts anatomiques et les manifestations cliniques ne deviennent visibles. Nous travaillons avec une lignée de souris porteuse de la variation génétique la plus fréquemment observée chez les patients. La souris porteuse de cette variation reproduit les principales caractéristiques de la maladie et constitue un outil essentiel pour étudier les mécanismes biologiques à l'origine de ces troubles au cours du développement embryonnaire. Nos résultats préliminaires montrent que cette variation perturbe le développement normal du cerveau chez la souris dès des stades précoces, à l’état embryonnaire. L'objectif de ce projet est d'étudier plus précisément la prolifération et la différenciation des cellules pendant les étapes clés de la formation du cerveau. Les connaissances acquises permettront de mieux comprendre les mécanismes à l'origine de cette maladie et pourraient, à terme, favoriser le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ces activités permettront ainsi d’établir une relation génotype-phénotype pouvant permettre d’identifier les mécanismes moléculaires responsables des troubles du neurodéveloppement des patients afin de pouvoir identifier des possibles pistes thérapeutiques et de prise en charge.

Procédures

Deux injections de 30 à 60 secondes chacune. Anesthésie par inhalation d’isoflurane et mise à mort par dislocation cervicale de la femelle. Les embryons étudiés dans la dernière semaine de gestation seront décapités et les cerveaux seront disséqués.

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes recevront au maximum deux injections, espacées d’environ une heure et demie. Ces injections contiendront des substances permettant de repérer les cellules en train de se multiplier dans le cerveau des embryons. Les injections pourront provoquer une gêne et un stress de courte durée. Les femelles seront ensuite mises à mort afin de récupérer les embryons pour les analyses. Dans ce projet, les analyses seront réalisées uniquement sur des embryons avant leur naissance. Aucun animal porteur de cette modification ne sera maintenu en vie après la naissance dans le cadre de cette procédure.

Devenir

À la fin de la procédure, les femelles gestantes seront mises à mort afin de récupérer les embryons à différents moments de leur développement. Les embryons seront ensuite utilisés pour étudier la formation de leur cerveau et la multiplication des cellules nerveuses. Ils ne seront pas maintenus en vie après leur prélèvement. Aucun animal ne sera réutilisé dans une autre étude après cette procédure. Le nombre d’animaux utilisés sera limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables.

Remplacement

La conformité à la règle des 3R a été scrupuleusement respectée de la manière suivante. Dans un souci de remplacement, nous effectuerons sur la souris uniquement les tests qui nécessitent un organe fonctionnel au sein d’un animal. Ainsi, on ne peut se passer du recours aux animaux pour notre étude.

Réduction

Le nombre de souris a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Les embryons provenant d’une même portée seront utilisés autant que possible pour les différentes analyses prévues, ce qui permet d’obtenir davantage d’informations à partir des mêmes animaux. Les expériences seront réalisées progressivement. Les premières analyses seront effectuées à des moments importants du développement du cerveau. Des analyses supplémentaires ne seront réalisées que si les premiers résultats montrent qu’elles sont nécessaires pour comprendre l’apparition ou l’évolution des anomalies étudiées. Les contrôles techniques seront réalisés à partir d’échantillons déjà disponibles chaque fois que cela sera possible. Enfin, les femelles gestantes ne seront pas utilisées si le nombre d’embryons nécessaire est atteint avant la fin du projet. Ces mesures permettent de limiter le nombre d’animaux tout en conservant des résultats fiables.

Raffinement

Les injections seront réalisées par des personnes formées et expérimentées, avec du matériel adapté et selon des procédures standardisées. La durée de manipulation et de contention des femelles gestantes sera réduite autant que possible afin de limiter leur stress et leur inconfort. Les femelles seront surveillées régulièrement entre les injections et leur mise à mort, prévue au plus tard deux heures après la première injection. Si un signe inhabituel de douleur, de stress ou de mauvaise santé apparaît, l’animal sera pris en charge immédiatement et la procédure pourra être interrompue. Les embryons seront prélevés après la mise à mort de leur mère et utilisés immédiatement pour les analyses prévues. Aucun animal porteur de la modification génétique étudiée ne sera maintenu en vie après la naissance dans le cadre de cette procédure. Les quantités de substances injectées seront limitées à ce qui est nécessaire pour obtenir les résultats recherchés. Ces mesures permettront de réduire autant que possible les contraintes imposées aux animaux tout en garantissant la qualité des résultats.

Choix des espèces

La souris est utilisée car elle permet d’étudier le développement du cerveau avant la naissance. Les mécanismes étudiés sont suffisamment comparables entre la souris et l’être humain pour aider à comprendre certaines maladies du développement neurologique. Les embryons seront étudiés à plusieurs moments de leur développement, entre le 11e et le 18e jour de gestation. Ces différents moments correspondent à des étapes importantes de la formation du cerveau, notamment la production et la maturation des cellules nerveuses. Cette approche permettra de déterminer à quel moment les anomalies liées à la modification génétique apparaissent et comment elles évoluent au cours du développement.

Une quinzaine d'études sur cinq ans, chacune testant des composés que le porteur ne nomme pas, vont utiliser 1 050 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries de gras de 6 à 8 semaines jusqu'à environ 36 semaines d'âge pour les rendre obèses et diabétiques, elles reçoivent les composés jusqu'à deux fois par jour, peuvent être isolées pendant le traitement et subissent la pose d'un cathéter veineux, parfois aussi artériel. Le jour du clamp, à jeun et sous perfusion continue d'insuline et de glucose, chaque souris subit 42 des 59 prélèvements de sang prévus pour elle. Le porteur fixe à 10 les données exploitables par groupe en fin de clamp, sans dire comment les 1 050 souris se répartissent entre ces études.

Objectifs

Le diabète a touché 8,5% de personnes de plus de 18 ans dans le monde. 90% des personnes diabétiques sont atteintes de diabète de type 2, forme de diabète associée à l’obésité. Le nombre de personnes diabétiques ne cesse d’augmenter. Le diabète a des conséquences dramatiques sur le fonctionnement de certains organes comme le foie, le système nerveux, les reins ou le cœur et certaines de ces conséquences sont mortelles. Le diabète de type 2 se caractérise par deux phases, la phase de résistance à l’insuline où les niveaux plasmatiques d’insuline sont très élevés pour essayer de contrer l'augmentation du taux de sucre dans le sang puis au fur et à mesure le corps n'arrive plus à sécréter de l'insuline. On parle alors de phase de dépendance à l’insuline. Plus le diabète de type 2 est traité précocement, moins les conséquences sont dramatiques. Ainsi, il est important de développer des thérapies qui ciblent la phase de résistance à l’insuline. Pour se faire, les animaux rendus obèses par l’ingestion d’un régime gras sur plusieurs semaines constituent le meilleur modèle préclinique pour valider ces thérapies. En effet, l’ingestion d’un régime gras chez la souris se traduit par la mise en place d’une résistance à l’insuline. La résistance à l’insuline peut être évaluée de différentes manières : en réalisant des tests de tolérance à l’insuline et au glucose mais la technique la plus précise reste le clamp euglycémique hyperinsulinémique car il permet la mesure de la sensibilité à l’insuline au niveau des différents organes et de façon bien précise, en utilisant des radiotraceurs. Ainsi, au cours de ce projet, des souris seront rendues obèses puis traitées ou non par des molécules et leur résistance à l’insuline sera évaluée par des tests de tolérance puis un clamp euglycémique hyperinsulinémique afin d’étudier l’efficacité des traitements administrés sur la résistance à l’insuline.

Bénéfices attendus

Par cette étude, de nouveaux traitements ciblant la résistance à l’insuline et donc les phases précoces du diabète peuvent être trouvés. Ceci permettra à court termes, la mise en place d’essai clinique pour mettre en évidence la même efficacité chez l’homme et à plus long termes, le développement de traitement pour l’homme. Ceci contribuera à éviter les complications induites lors des phases avancées du diabète et d’augmenter les taux de survie des patients. Nous réaliserons approximativement 15 projets sur 5 ans.

Procédures

Tous les animaux seront nourris avec un régime enrichi en gras dès l’âge de 6-8 semaines et jusqu’à la fin du projet (environ 36 semaines d’âge). Les animaux recevront des administrations de divers composés à tester, les administrations se font sur animal vigile (environ 30 secondes) ou sur animal anesthésié (environ 2 minutes). Des prélèvements de sang auront lieu à trois reprises durant le projet et de façon répétée en fin de projet (le jour des mesures de sensibilité au glucose et à l’insuline) : soit 59 prélèvements dont 42 prélèvements le jour de la manipulation terminale. La mise en place d’un cathéter à demeure sera réalisée pour permettre la perfusion le jour du clamp, et une double voie (artérielle également), sera envisagée pour éviter les prélèvements répétés à la veine caudale, une fois, soit avant le début des traitements soit quelques jours avant le clamp., et durera maximum 1h, sous couverture analgésique et anesthésique adaptée. Un prélèvement de sang dure quelques secondes à 2 minutes. La mesure de la composition corporelle dure environ 2 minutes, sur animal vigile et a lieu une fois durant le projet.

Impact sur les animaux

1 – Un régime hypercalorique sera mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 6 à 8 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (16 semaines sous régime puis 12 semaines de traitement donc jusqu’à 36 semaines d’âge), cela va induire une obésité et un diabète de type 2. Les animaux se déplacent un peu moins mais ils gardent un bon état général. Le régime étant gras, les souris auront le pelage sale voir s’hyper-toiletteront si cela les démange. 2 – Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition peut générer un stress chronique. Ces injections, potentiellement répétées jusqu’à deux fois par jour, peuvent entraîner douleur/inconfort transitoire et réactions ou lésions locales. Bien que les composés à tester ont pour but d’améliorer l’état de santé de l’animal, ils peuvent avoir des effets adverses. 3 - Pour mesurer les consommations alimentaire et hydrique, les souris pourront être hébergées en cage individuelle pendant la durée du traitement, cela est impactant pour les souris qui ont un caractère social. 4 – Les mises à jeun (6h) lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress, notamment pour des animaux diabétiques. 5 –La surcharge en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose. 6 – La chirurgie (implantation du(des) cathéter(s) veineux / artériel) est faite sous anesthésie et analgésie, par du personnel formé et l’état des animaux est surveillé de près. Le risque d’hémorragie pendant la chirurgie et les jours suivants est faible mais présent. L’anesthésie et la cicatrisation sont plus difficiles chez un animal diabétique. Dans de rares cas, le dispositif peut se déconnecter ou se boucher, cela sera un point limite. 7 – Clamp : Pendant toute la durée du clamp, l’animal est à jeun, il est connecté à une perfusion et reçoit de l’insuline et du glucose par voie veineuse de façon continue. Cette manipulation terminale peut être source de stress. 8- Nous mesurerons de nombreuses fois la glycémie par microprélèvement en bout de queue ou via le cathéter artériel, l'extrémité de la queue sera désinfectée à la vétédine en fin de manipulation. Cependant, du fait du diabète, certains animaux peuvent avoir des complications (queue hypersensible, infection).

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (comptage des radioéléments, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...).

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. D’ailleurs, l’établissement possède aujourd’hui une plateforme in vitro pour y répondre. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires, musculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Toutes les étapes de la procédure seront réalisées sur le même animal. Des étapes de screening sont réalisées afin d’obtenir des groupes homogènes et les animaux ayant les meilleurs critères permettant d’avoir des données fiables et exploitables en fin d’étude et d’éviter de répéter plusieurs fois la dite étude. Le nombre de données par groupe nécessaire pour être statistiquement robuste et donc pouvoir conclure sur l’effet d’un traitement est de 10 en fin de clamp.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux souris de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Le bout de la queue des souris sera observé de près car le diabète peut induire des complications au niveau de la cicatrisation. De la vétédine sera appliquée après chaque fin de manipulation. Les animaux seront habitués aux contacts humains et aux traitements progressivement les jours qui précèdent l’initiation du traitement (préhension, transport des cages sur le chariot, en cas d'injection, une pointe de stylo sera appliquée sur la future zone d’injection, ces gestes seront répartis sur 3 à 5 jours) Après la chirurgie, des changements significatifs dans le comportement des souris peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif de la zone opérée, entraineront un examen clinique poussé par le personnel qui a réalisé la procédure chirurgicale et la SBEA. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre les points limites fixés par la grille de score, ce dernier serait mis à mort. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de soluté de réhydratation est réalisée (10 à 20 mL/kg) sur 3 jours maximum. En cas d’hypothermie, l’animal sera placé en armoire chauffante sur 3 jours maximum. Les jours suivants la chirurgie, la fréquence des observations et des pesées est augmentée. En cas de signes de douleurs, la posologie des analgésiques sera revue. Les prélèvements de sang effectués en cours d’étude se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques.

Choix des espèces

L’espèce choisie est la souris C57BL6/J. Cette espèce est une espèce adaptée pour l’étude de la résistance à l’insuline puisque c’est une espèce développant une obésité et une résistance à l’insuline lorsqu’elle est nourrie d’un régime gras. Elle est également adaptée à l’analyse de la résistance par clamp puisque les données obtenues sont assez homogènes. La chirurgie pour la mise en place du cathéter impacte peu l'obésité et la résistance à l'insuline. Les animaux sont mis sous régime à partir de 6 ou 8 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge. La phase de traitement sera réalisée sur des animaux obèses, donc à l’âge de 22 semaines environ (dont 16 semaines sous régime environ)

Les souris de la cohorte de longévité sont suivies jusqu'à leur mort spontanée, ou mises à mort à l'apparition de signes définis à l'avance. En tout, 1 338 souris génétiquement modifiées pour renforcer le recyclage cellulaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec un examen mensuel à partir de 18 mois et quatre prises de sang sans anesthésie entre 6 et 24 mois. Le porteur prévoit qu'en vieillissant certaines perdent la vue, développent une cataracte, des troubles locomoteurs ou des tumeurs spontanées. Le laboratoire déclare dans ses chiffres toutes les souris mises à mort, mais prévoit d'en transférer une partie vers un plateau d'analyses fonctionnelles du vieillissement, sans dire ce qu'elles y deviennent.

Objectifs

Le vieillissement s’accompagne progressivement d’une diminution des capacités physiques et physiologiques, ainsi que d’une augmentation de la fragilité et du risque de maladies liées à l’âge. Parmi les mécanismes biologiques impliqués, le recyclage cellulaire joue un rôle essentiel. Il permet aux cellules d’éliminer et de renouveler leurs composants endommagés, contribuant ainsi au maintien de leur équilibre et à la protection des tissus. Cependant, son efficacité diminue avec l’âge, ce qui peut participer au déclin des fonctions de l’organisme. L’objectif de ce projet est d’étudier le rôle du recyclage cellulaire dans le maintien des fonctions de l’organisme au cours du vieillissement. Pour cela, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées permettant d’augmenter ce mécanisme. Les animaux seront suivis au cours de leur vieillissement naturel afin d’évaluer son impact sur leur fragilité, leurs fonctions physiologiques et leur durée de vie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes biologiques impliqués dans le vieillissement et la fragilité liée à l’âge. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre comment le mécanisme de nettoyage et le recyclage cellulaire contribuent au maintien des fonctions physiologiques au cours de la vie et comment son augmentation pourrait limiter certains effets du vieillissement. Le projet permettra également d’identifier des mécanismes impliqués dans la communication entre les organes au cours du vieillissement et de mieux comprendre le rôle du muscle squelettique dans le maintien de l’équilibre physiologique de l’organisme. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies visant à favoriser un vieillissement en bonne santé et à limiter l’apparition de déficits fonctionnels liés à l’âge. Ils pourraient également participer à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d’activer le nettoyage et recyclage cellulaire dans certaines pathologies associées au vieillissement.

Procédures

Les animaux seront suivis tout au long de leur vieillissement naturel. Des évaluations de leur vieillissement seront réalisées une fois par mois à partir de 18 mois et reposent principalement sur des observations cliniques et des manipulations courtes et non invasives. Quatre prélèvements sanguins sur animaux vigiles seront réalisés à l’âge de 6 mois, 18 mois, 21 mois et 24 mois afin de récupérer du sérum pour des analyses biologiques liées au vieillissement.

Impact sur les animaux

Les principales contraintes prévues dans ce projet sont liées au vieillissement naturel des animaux ainsi qu’au suivi régulier réalisé au cours de leur vie. En vieillissant, certains animaux pourront présenter une diminution progressive de leurs capacités physiques, une perte de masse musculaire, une plus grande fragilité, une baisse d’activité ainsi qu’une altération de leur état général. Comme cela est habituellement observé chez les souris âgées de cette lignée, certains animaux pourront également développer des signes liés au vieillissement tels qu’une perte de la vue, des anomalies des yeux (comme des cataractes), une perte de poils, une prise de poids importante, des troubles locomoteurs ou des tumeurs spontanées. Certains animaux âgés pourront également présenter des signes d’anxiété ou de stress, notamment lors des manipulations ou des changements de cage. Le suivi des animaux au cours du temps repose principalement sur des observations cliniques régulières et des manipulations courtes. Ces interventions peuvent provoquer un stress léger et temporaire lié à la manipulation des animaux. Un à quatre prélèvements sanguins au cours de leur vie pourront entraîner une gêne légère et transitoire au moment du prélèvement. Les animaux de la cohorte de longévité seront suivis jusqu’à leur décès spontané ou jusqu’à l’apparition de signes définis à l’avance nécessitant une euthanasie afin d’éviter toute souffrance prolongée. Une dégradation progressive de l’état de santé liée au vieillissement pourra être observée chez certains animaux en fin de vie. Aucun effet nocif spécifique lié aux modifications génétiques utilisées dans ce projet n’a été observé jusqu’à présent. Au contraire, des travaux antérieurs suggèrent une amélioration de certains paramètres liés au vieillissement chez ces animaux.

Devenir

Mise à mort, autopsie pour identifier les causes de la fin de vie et collecte des organes pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués pour une partie des animaux et une autre partie de ces animaux sera transférée vers un plateau qui permettra d’effectuer des analyses fonctionnelles du vieillissement des animaux.

Remplacement

Le projet visant à étudier comment le recyclage cellulaire impacte le vieillissement de l’organisme entier, il n’est pas possible de remplacer les animaux par des lignées cellulaires ou des organoïdes. L’utilisation d’animaux est un pré-requis indispensable à l’établissement du projet.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en maximisant l’information recueillie, l’ensemble des évaluations fonctionnelles est réalisé chez les mêmes animaux. Pour les calculs du nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur un logiciel statistique à partir des données de notre étude antérieure.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées et enrichies favorisant leur bien-être. L’état de santé des animaux, particulièrement des animaux âgés, sera suivi régulièrement à l’aide d’observations simples et non invasives permettant de détecter précocement les signes de fragilité liés au vieillissement. Les manipulations seront limitées au strict nécessaire et réalisées de manière à réduire le stress des animaux. Tout animal présentant des signes de souffrance ou une altération importante de son état général sera euthanasié rapidement afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées permettent d’étudier in vivo chez un mammifère les conséquences de la mutation ponctuelle d’un gène dans un type cellulaire spécifique et d’explorer l’impact du gène étudié dans un contexte physiologique similaire à l’homme. Les animaux seront suivis à différents âges afin d’étudier l’effet de l’augmentation du recyclage cellulaire sur le vieillissement et la durée de vie. Les souris entreront dans le projet à l’âge adulte puis seront suivies tout au long de leur vie jusqu’à un âge avancé. Pour la cohorte de vieillissement, certains animaux seront étudiés à 18, 21 et 24 mois, ce qui correspond à des stades avancés du vieillissement chez la souris. Cela permettra d’observer l’évolution progressive des changements liés à l’âge. Pour la cohorte de longévité, les animaux seront suivis jusqu’à leur décès spontané ou jusqu’à l’apparition de signes nécessitant une euthanasie afin d’éviter toute souffrance prolongée. Ce suivi permettra d’évaluer la durée de vie des animaux ainsi que l’évolution de leur fragilité au cours du vieillissement. L’utilisation d’animaux âgés est indispensable dans ce projet car les phénomènes étudiés apparaissent progressivement avec l’âge et ne peuvent pas être correctement reproduits chez de jeunes animaux.

Isolées jusqu'à 22 semaines en cage individuelle pour mesurer leur consommation de sucre, les souris de ce projet subissent aussi une chirurgie, des antibiotiques pendant quatre à huit semaines, un transfert de microbiote par gavage sept jours de suite et des prises de sang. Au total, 4 380 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour des analyses après la mort. Le porteur affirme avoir montré que cet isolement n'interfère pas avec "le bien-être des animaux dans nos conditions", puis présente les cages ouvertes comme un moyen de limiter l'impact du "stress d'isolement". Il attend des troubles de l'humeur et de la motivation chez les souris qui boivent la solution sucrée, sans nommer les tests comportementaux qui doivent les mettre en évidence.

Objectifs

Les troubles du comportement alimentaire se définissent par une relation dysfonctionnelle avec l’alimentation, souvent orientée vers la consommation excessive d’aliments, riches en graisses et en sucres. Ces comportements, au-delà de leur dimension psychologique et comportementale, sont associés à des conséquences sanitaires majeures telles que les maladies cardiovasculaires, l’obésité et le diabète. L’hyperphagie boulimique est le plus prévalent de ces troubles et se caractérise par des épisodes récurrents de perte de contrôle sur la prise alimentaire, mais les mécanismes biologiques sous-jacents demeurent en grande partie méconnus. Des travaux récents mettent en lumière l’importance du microbiote intestinal dans l’émergence et/ou le maintien des troubles alimentaires. Le projet souhaite caractériser les altérations comportementales, cérébrales et du microbiote induites par une consommation excessive de saccharose ; examiner l’impact d’une manipulation ciblée du microbiote sur les comportements alimentaires ; et explorer les interactions entre le microbiote et le cerveau. Ces investigations seront menées sur des souris des deux sexes, afin d’identifier d’éventuelles différences intersexuelles, déjà décrites chez l’humain.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre, au niveau préclinique, comment un régime riche en saccharose altère la physiologie animale, en tenant compte des interactions intestin-cerveau. Les résultats attendus permettront d’approfondir la compréhension des mécanismes biologiques sous-jacents à ce trouble alimentaire. En outre, à long terme, ces travaux précliniques fourniront une base scientifique pour le développement de stratégies hygiéno-diététiques innovantes et mieux adaptées à la prise en charge des patients.

Procédures

MODIFICATION_Les animaux sont soumis à une chirurgie et des injections pour l'anesthésie (1 chirurgie par animal, durée 45 min; une injection intrapéritonéale d’une durée d’environ 20 secondes). Ils seront également soumis à des traitements chroniques d’antibiotiques (sur 4 ou 8 semaines maximum) et un transfert de leur microbiote intestinal (gavage, 1/jour sur 7 jours, d’une durée d’environ 30 sec). Il y aura des injections répétées (1x/j, 5j, 2X) pour un sous-groupe de souris. Il y aura des prélèvements de sang à 3 reprises lors du protocole (durée environ 30 sec).

Impact sur les animaux

MODIFICATION_Consommation excessive de saccharose : les animaux ont le choix entre de l’eau et du sucre tous les jours, pendant 4h ou 24h selon le groupe expérimental. Nous devons évaluer précisément la consommation individuelle de saccharose des souris et nous avons montré que l’isolement nécessaire (au maximum 22 semaines en cage ouverte permettant un contact auditif et olfactif) n’interfère pas avec le bien-être des animaux dans nos conditions. Nous n’avons à ce jour pas mis en évidence de pathologies chroniques dans notre modèle, mais justement, nous poursuivons notre caractérisation et le suivi de différents paramètres afin de suivre l’évolution chez les souris. Nous n’avons pas identifié d’effets sur les seuils nociceptifs. De plus, des troubles de l'humeur et de la motivation sont envisageables chez les animaux consommateurs de boisson sucrée (le but de l'étude est de les mettre en évidence). Lors de l’utilisation de traitement antibiotique, une attention particulière sera portée sur les potentielles pertes de poids et diarrhées. Le gavage intra-gastrique répété (1x/J, 7j) peut conduire à un inconfort léger lié au stress de la contention au moment de l’administration. La chirurgie sur animal anesthésié (1 heure maximum/animal) peut induire de la douleur et une inflammation transitoire et/ou un inconfort pour les animaux. La modulation pharmacologique répétée (1x/j, 5j, 2X) peut engendrer un inconfort MAIS AUCUNE NUISANCE INDUITE PAR LA SUBSTANCE N'EST ATTENDUE. Le prélèvement de sang lors du protocole de consommation de saccharose peut induire une douleur légère de courte durée et une inflammation. L’injection d’anesthésique avant la perfusion peut engendrer une douleur aigüe.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.

Remplacement

La compréhension des mécanismes de mises en place et des conséquences des troubles du comportement alimentaire nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal entier, vigile. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire notamment pour évaluer les processus neuronaux mis en jeu. La souris est une espèce suffisamment proche de l’Homme, physiologiquement et génétiquement, chez laquelle nous pouvons modéliser des pathologies humaines. Il nous est donc impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico.

Réduction

MODIFICATION_Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d'animaux pour permettre des analyses statistiques pour les analyses comportementales et moléculaires et les analyses de l'activité cérébrale. Les expériences seront toujours réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, nous composerons donc toujours nos groupes dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Notamment, l’utilisation de tests longitudinaux permettra d’obtenir des informations concernant l’activité des circuits cérébraux lors de l’ensemble de l’exposition au saccharose. DE PLUS, UN ARBRE DECISIONNEL A ETE MIS EN PLACE POUR LIMITER LES EXPERIENCES EN FONCTION DES RESULTATS DES GROUPES CONTROLES LORS DE LA MODULATION DE L'ACTIVITE D'UNE REGION CEREBRALE. De même, les prélèvements d’organes après perfusions permettront de décrire les altérations provoquées par le régime alimentaire autant au niveau cérébral que périphérique.

Raffinement

MODIFICATION_Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris sera assurée. De plus, une pesée au minimum 2x/semaine est réalisée lors du suivi des consommations (nourriture/saccharose/eau), permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris ont toujours accès à de l’eau. Les souris seront habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Les animaux sont PLACES DANS DES CAGES INDIVIDUELLES enrichies et ouvertes ce qui permet les contacts olfactifs entre congénères et permet aux animaux de communiquer entre eux ce qui concourt à limiter l’impact du stress d’isolement. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie per et post opératoire et les souris seront placées sur des tapis chauffants, permettant de maintenir la température corporelle de l’animal durant la procédure en plus de monitorer cette donnée physiologique. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel formé, avec une attention particulière la première semaine post-chirurgicale. L’état de santé des animaux est évalué à l‘aide de grilles de score spécifiques à la procédure chirurgicale (ciblant notamment les risques d’inflammation au niveau de la zone opérée et la reprise de poids de l’animal) et aux injections répétées. Des points limites spécifiques ont été définis pour l'état général, la prise alimentaire, le site d’injection.

Choix des espèces

Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des troubles alimentaires. Sur un plan évolutif, les rongeurs, appartiennent au clade des mammifères le plus proche de celui des Primates. Nous choisissons de travailler avec la souris car nous pourrons ensuite étudier le rôle de gènes précis dans les adaptations observées, en utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées Souris jeunes adultes (au moins 8 semaines en début de procédure). Le jeune adulte correspond à la période de vie de vulnérabilité accrue chez l’Homme vis-à-vis des troubles alimentaires