Procédures légères

Jusqu'à 200 souris et 200 rats pourront être gardés en vie puis éventuellement réutilisés, à condition qu'aucun prélèvement post-mortem ne soit prévu pour eux, les autres étant tués pour prélever sang et organes. Au total, 2 800 rongeurs, 1 400 souris et 1 400 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour mesurer la tolérance de dix substances pharmacologiques. Ils reçoivent jusqu'à quatorze jours d'administrations quotidiennes par gavage ou injection, une batterie d'observations fonctionnelles pouvant durer 24 heures, et pour certains un test de force de préhension ou un test de Von Frey, où une stimulation mécanique est appliquée jusqu'au retrait de la patte. Le choix de l'espèce tient en deux phrases, qui décrivent les rongeurs comme des "modèles fréquemment décrits".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets comportementaux et physiologiques de différentes substances pharmacologiques chez le rongeur afin d’identifier des conditions d’administration bien tolérées. Jusqu’à 10 études pourront être réalisées sur la durée du projet, correspondant chacune à l’évaluation d’une substance d’intérêt. Selon les résultats obtenus, certaines études pourront comporter des évaluations complémentaires de la sensibilité mécanique, de la force de préhension ou des paramètres biologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à une meilleure compréhension des effets comportementaux et physiologiques de substances d’intérêt pharmacologique. Les résultats pourront orienter la sélection de molécules candidates pour un développement ultérieur, tout en améliorant la prédiction préclinique de leurs effets secondaires potentiels.

Procédures

Les animaux recevront soit une administration unique, soit des administrations quotidiennes pendant une durée maximale de 14 jours, selon la substance évaluée et l’objectif expérimental. Sur l’ensemble du projet, un maximum de 2800 animaux pourra être utilisé. Certains animaux, dans la limite de 400 maximum, pourront faire l’objet de prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse. En fin de procédure, une mise à mort pourra être réalisée lorsqu’un prélèvement de sang ou d’organes/tissus post-mortem est nécessaire.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont principalement un stress lié aux manipulations et aux administrations répétées, un inconfort lors des gavages, une douleur ou gêne transitoire lors des injections intrapéritonéales ou intraveineuses, ainsi qu’un stress lors des observations comportementales. Le test de Von Frey peut également induire une douleur ou un inconfort transitoire, la stimulation mécanique étant appliquée jusqu’au seuil de retrait de la patte.

Devenir

Les animaux pour lesquels des prélèvements sanguins ou d’organes/tissus post-mortem sont nécessaires seront mis à mort à la fin de la procédure. Un nombre estimé maximal de 400 animaux, soit jusqu’à 200 souris et 200 rats, pourra être maintenu en vie et éventuellement réutilisé, sous réserve qu’aucun prélèvement post-mortem ne soit nécessaire, qu’aucun point limite n’ait été atteint et qu’aucun effet résiduel de la substance ne soit observé. Leur éligibilité à une réutilisation sera évaluée conformément à la réglementation. Aucun replacement ni aucune adoption ne sont prévus.

Remplacement

Dans la mesure du possible, les substances étudiées sont préalablement évaluées à l’aide de méthodes in vitro, notamment afin d’identifier et d’écarter les molécules présentant une toxicité incompatible. Cette étape permet de limiter le recours à l’animal aux substances pour lesquelles une évaluation intégrée à l’échelle de l’organisme reste nécessaire. Toutefois, les méthodes expérimentales in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire l’ensemble des interactions complexes entre les systèmes nerveux, cardiovasculaire, endocrinien et métabolique impliqués dans la réponse globale d’un organisme à une substance pharmacologique. Elles ne permettent notamment pas d’évaluer de manière complète les effets neurocomportementaux complexes. Le recours au modèle animal reste donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire. En général, la variabilité des réponses aux effets d’un traitement administré chez le rongeur justifie une taille minimale de groupe de 10 animaux par condition expérimentale. La variabilité élevée en comportement et physiologie justifie cette taille minimale. Un effectif inférieur peut exposer à un risque de devoir reproduire les procédures pour valider statistiquement la solidité des résultats obtenus par une analyse de la variance (ANOVA). En cas de résultat significatif, les différences entre chaque groupe et le groupe contrôle seront explorées à l’aide d’un test de comparaisons multiples adapté (Dunnett ou Tukey). Afin de limiter le nombre d’animaux, la procédure 1 constitue une étape de criblage initial. Les procédures 2 et 3 ne seront déclenchées qu’en seconde intention, uniquement si le test FOB met respectivement en évidence une modification de la sensibilité mécanique ou de la force de préhension. Les effectifs prévus pour ces procédures correspondent donc à un maximum théorique et ne seront pas utilisés en l’absence de signal lors de la procédure 1. Lorsque la cinétique d’action de la substance, l’état clinique des animaux et l’absence d’interférence entre tests le permettront, les évaluations complémentaires seront réalisées sur les mêmes animaux. Une nouvelle cohorte ne sera utilisée que lorsque la durée d’observation du FOB, pouvant aller jusqu’à 24 h, ou les contraintes temporelles des mesures rendent l’utilisation des mêmes animaux scientifiquement non pertinente.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe afin de maintenir leur socialisation et dans des cages enrichies. Les substances évaluées sont sélectionnées sur la base d’une analyse préalable approfondie de la littérature scientifique et des données disponibles concernant notamment leur pharmacologie, leur pharmacocinétique et leur profil de tolérance. Les doses et voies d’administration retenues sont ainsi définies à partir de données existantes, lorsque celles-ci sont disponibles, afin de limiter le risque d’effets indésirables non anticipés. Les administrations seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté. Les administrations par voie orale seront réalisées à l’aide de sondes souples afin de limiter les irritations. Le cas échéant, les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie afin de réduire l’inconfort et le stress des animaux. L’état clinique des animaux sera évalué quotidiennement selon les points limites définis dans les procédures. Tout animal atteignant un point limite sera pris en charge conformément aux critères établis, avec mise à mort si nécessaire, afin de limiter au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse.

Choix des espèces

Après une étude de la littérature scientifique, les rongeurs sont des modèles fréquemment décrits pour l’étude de la tolérance d’un produit pharmacologique. Les animaux utilisés seront adultes conformément à la littérature.

Les souris de cette lignée sont tuées systématiquement à sept mois, l'âge où leur cardiomyopathie dilatée évolue en insuffisance cardiaque. 823 souris vont être utilisées dans ce projet d'élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie subissant une biopsie de queue pour le génotypage. Dès quatre mois, les souris atteintes développent une atteinte cardiaque et musculaire, une cyphose et une perte d'environ 20 % de leur poids, et le porteur indique qu'aucun signe de douleur n'apparaît avant sept mois selon la grille de l'établissement. Les reproductrices et reproducteurs sont tués en fin de période reproductive, les autres souris partent en "utilisation continue" dans d'autres projets, en cours ou à venir.

Objectifs

Le but de ce projet est d’entretenir une lignée transgénique de souris, modèle murin d’une pathologie neuromusculaire héréditaire, le syndrome d'Emery Dreifuss. Cette pathologie est une maladie rare et à l’heure actuelle il n’existe pas de thérapie curative pour les patients. Cette lignée est un outil essentiel pour approfondir nos connaissances sur la physiopathologie et le développement de thérapies innovantes pour cette pathologie. Cette lignée, n’est pas commercialisée et n’est donc pas disponible en dehors de notre établissement utilisateur. Ce projet permettra le maintient de cette lignée, pour fournir les animaux pour ce projet et pour les autres projets de l’équipe déjà en cours et approuvés par le ministère ou à venir, qui feront l’objet d’un dépôt de dossier afin d’obtenir les autorisations nécessaires.

Bénéfices attendus

Le bénéfice premier de projet est de maintenir notre lignée de souris transgénique en évitant la dérive génotypique afin de fournir des animaux pour les projets en cours ou à venir de l’équipe. Cette production d’animaux permettra de fournir des lots expérimentaux qui seront utilisés pour mettre en évidence de nouveaux mécanismes de signalisation moléculaire impliqués dans le développement des troubles du rythme cardiaque et de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Au 1er janvier 2023, environ 2,74 millions de personnes en France avaient un antécédent d’hospitalisation pour trouble majeur du rythme ou trouble de conduction cardiaque. Cela correspond à une prévalence d’environ 3,2 pour cent de la population française pour la fibrillation atriale, 1,9 pour cent pour les troubles de conduction, et 0,4 pour cent pour les tachycardies ventriculaires ou arrêts cardiaques nécessitant une hospitalisation.

Procédures

Une biopsie de queue d’environ un millimètre sera réalisée sur une partie des animaux pour lesquels une identification génétique est nécessaire.

Impact sur les animaux

Le phénotype dommageable débute à 4 mois avec l’apparition progressive d’une cardiomyopathie dilatée d’abord légère et qui évolue vers 7 mois en insuffisance cardiaque. Cette progression de l’atteinte cardiaque est corrélée à une atteinte progressive et moins sévère des muscles squelettiques de type oxydatif, l’apparition d’une cyphose légère et une perte de poids d’environ 20 pour cent par rapport au poids de l’animal à 4 mois (environ 20 g). Ce phénotype réduit l’espérance de vie des animaux. En se référant à l’échelle de la grille d’observation fournie par notre établissement utilisateur, les animaux ne présentent aucun signe caractéristique de douleur avant l’âge de 7 mois. Le génotypage invasif d’une partie des animaux provoque un stress et une douleur de courte durée.

Devenir

Tous les animaux reproducteurs seront euthanasiés en fin de période reproductive. Les souriceaux issus des accouplements serviront d’une part comme animaux reproducteurs et seront euthanasiés en fin de période reproductive. D’autre part, ils serviront en utilisation continue au sein des projets de recherche autorisés en cours et de projets à venir après leur autorisation.

Remplacement

Nous sommes toujours dépendants de l’utilisation de modèles animaux car les questions que nous abordons ne peuvent l'être dans des modèles cellulaires. En effet, les cellules cardiaques adultes, ayant atteint un état de différenciation terminale, ne se divisent pas. Il est par conséquent impossible d’en dériver une lignée cellulaire stable. De plus, ces cellules adultes ne se conservent en culture primaire que quelques jours et ne peuvent pas être transfectés par des agents de transfection non viraux. D'autre part, aucun modèle d'expression in vitro ne reproduit les conditions physiologiques spécifiques de la cellule cardiaque (expression de protéines spécifiques dans des domaines cellulaires spécifiques). Bien qu’il existe des lignées cellulaires issues de cellules souches, celles ci ne résument la physiologie d’un cœur adulte que partiellement. Elles seront toutefois utilisées pour tester certaines de nos hypothèses qui ne nécessitent pas de modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est évalué à partir de la connaissance et l’expérience approfondie de l’investigateur principal en matière d’entretien de lignée de souris. Le nombre d’accouplements par an et par génotype est évalué en fonction de la durée d’un accouplement, du temps moyen entre deux portés, du nombre de portées moyen par femelle, de la taille moyenne d’une portée (sevrée), du taux de sevrage, du taux de mortalité, du sexe ratio, du génotype ratio, de l’indice de reproductivité. Le nombre total d’animaux est estimé à 823. Ce projet ne nécessite pas d’analyses statistiques. Les tests statistiques seront réalisés dans les projets autorisés qui inclueront ces animaux d'élevage. La lignée est cryoconservée en cas de non‑utilisation prolongée. La gestion des accouplements sera adaptée en fonction de la demande en animaux des projets associés autorisés.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, 6 par cage maximum pour les cages après sevrage, jusqu'à 15 (souriceaux et reproducteurs) pour les cages de reproduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire au maximum toute douleur, souffrance ou angoisse que pourraient subir les animaux: enrichissement du milieu (lanières de papier Kraft, maisons en carton), acclimatation d'une semaine avant toute manipulation, hébergement en groupe, formation technique des utilisateurs. L'hébergement individuel des animaux est évité au maximum, cependant il est possible que certains animaux se trouvent isolés de manière imprévue (seul mâle d’une portée, animal arrivé seul d’un fournisseur, mâle dominant ayant blessé les autres animaux de la cage, dernier animal dans la cage…). Dans ce cas, l’animal bénéficiera d’un enrichissement supplémentaire dans sa cage. Afin de réduire la contrainte liée au phénotype dommageable et de ne pas atteindre les points limites, une grille d'observation mise en place par la Structure chargée du Bien-Être Animal du site est utilisée pour suivre l’évolution du phénotype au cas par cas. Les animaux seront euthanasiés systématiquement à l’âge de 7 mois.

Choix des espèces

La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de ses systèmes cardiovasculaire et musculaire avec ceux des humains et de l’existence d’une lignée génétiquement modifiée portant une mutation responsable à l’état homozygote du syndrome d’Emery-Dreifuss. De plus, la souris est le modèle animal le plus utilisé dans ce champ de recherche, permettant ainsi des comparaisons avec d’autres études ou d’utiliser les résultats d’autres études afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les animaux seront utilisés pour les accouplements à maturité sexuelle entre 2,5 et 6 mois.

Un fragment de queue prélevé sous anesthésie et la pose d'une boucle, puis, pour 181 d'entre elles, trois cures de DSS de cinq jours dans l'eau de boisson qui enflamment l'intestin, espacées de dix jours, et pour 110 six semaines de gavage : c'est le parcours le plus long prévu pour les souris de ce projet. 891 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour tester une version orale d'un anticorps anti-TNF contre les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. Le DSS peut provoquer une douleur modérée et des diarrhées pendant le traitement et quelques jours après. Chaque cohorte est tuée à date fixe, et l'équipe mesure alors la longueur du côlon et la taille de la rate.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), regroupant principalement la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, touchent plus de 10millions de personnes dans le monde, 3 millions de personnes en Europe et environ 300000 personnes en France. Les MICIs sont un groupe de troubles inflammatoires affectant le tube digestif. Les 2 principales MICIs sont : - la maladie de Crohn qui affectant toutes les partie du tractus gastro-intestinal, de la bouche à l'anus, le plus souvent la partie terminale de l'intestin grêle et le côlon. - la rectocolite hémorragique (RCH) qui se limite principalement au côlon et au rectum. Les symptômes communs aux MICIs incluent des douleurs abdominales, diarrhées (souvent sanglantes), fatigue, pertes de poids, et parfois des complications extragastro-intestinales, comme des atteintes articulaires, de la peau, des yeux… Les causes exactes des MICIs sont mal comprises, on pense qu'elles résultent d'une interaction complexe entre des facteurs génétiques, environnementaux et immunologiques. Le traitement vise généralement à contrôler l'inflammation, à soulager les symptômes. Les MICIs n’ont pas encore de traitement curatif, mais il existe des biothérapies et la chirurgie. Parmi les biothérapies, il y a les anti-TNF comme l’Adalimumab qui bloque une protéine responsable de l’inflammation, le facteur de nécrose tumorale (TNF). En inhibant cette protéine, l'Adalimumab réduit l'inflammation et les douleurs. Il est administré par injection sous-cutanée. L’adalimumab est un anticorps monoclonal humain de type IgG. Nous avons créé un anticorps de type sIgA avec les mêmes régions variables, c’est-à-dire celles permettant de reconnaitre les mêmes épitopes (cibles) que l’Adalimumab. La sIgA (immunoglobuline A sécrétoire) joue un rôle clé dans l'immunité des muqueuses. Elle est présente dans les sécrétions comme la salive, les larmes, le mucus respiratoire, le lait maternel et les sécrétions intestinales. Le but du projet est d’obtenir un nouvel anticorps de type sIgA ciblant le TNFα et ayant un effet supérieur ou au minimum équivalent à l’Adalimumab. Cet anticorps pourra être administré par voie oral ce qui facilite la vie quotidienne des patients, diminue la toxicité du produit et donc les effets secondaires. Cette molécule pourra aussi servir de traitement pour certaines maladies inflammatoires ou lors d’arthrite rhumatoïde.

Bénéfices attendus

Cet anticorps pourra être administré par voie orale ce qui facilite la vie quotidienne des patients, diminue la toxicité du produit et donc les effets secondaires. Cette molécule pourra aussi servir de traitement pour certaines maladies inflammatoires ou lors d’arthrite rhumatoïde.

Procédures

Tous les animaux vont avoir un prélèment de tissus au niveau de la queue sous anesthésie gazeuse ce qui va entrainer un léger stress de quelques minutes. Elles seront bouclées lors de cette anesthésie.15 souris vont avoir une injection par voie intra-veineuse et 2 prélèvements sanguin sous mandibulaire sous anesthésie gazeuse le même jour. 25 souris vont avoir une injection sous-cutanée, 30 auront une administration par voie orale (gavage). Ces 75 souris auront ensuite une injection par voie intra-veineuse et un prélèvement sanguin sous mandibulaire sous anesthésie gazeuse le même jour. 195 souris vont ingérer du DSS pendant 5 jours. Parmi ces animaux, 14 auront une seule injection en sous-cutanée, 25 auront de 2 à 6 injections en sous-cutanée. Ensuite 103 souris auront un gavage pendant 7 jours. Les autres n’auront pas de traitement. Pour finir, 181 souris vont ingérer 3 fois du DSS pendant 5 jours, espacé de 10 jours. Puis 39 auront 1 à 6 injection sous-cutanée et 110 autres auront 6 semaines de gavage. Les injections par voie intra-veineuse, en sous-cutanée, les gavages et le prélèvement de sang vont entrainer un stress de quelques minutes à chaque manipulation.

Impact sur les animaux

Les injections par intra-veineuse ou en sous-cutanée n’entraineront pas de douleur supérieure à celle d’une piqure d’aiguille. Elles entraineront un léger stress de quelques secondes pour les injections en sous-cutanées et de quelques minutes pour les injections intra-veineuse (contention dans un tube spécifique). L’ingestion du DSS va induire une inflammation de l’intestin qui peut entraîner une douleur modérée, du stress, de la diarrhée, durant le traitement et quelques jours après, et qui seront étroitement surveillés grâce à une grille de score des points limites. Dans la littérature, il n'y a pas de perte de poids durant les 4-5 premiers jours de taitement et le DSS dans l'eau de boisson n'impacte pas la quantité ingérée par les animaux.

Devenir

Après le traitement, chaque cohorte sera mise à mort à un temps donné afin de prélever les organes (colon, rate, sang) pour observer la longueur du colo, la taille de la rate... En parallèle, des analyses permettront d’observer les populations immunitaires recrutées au niveau de l'inflammation permettant de valider l’action des anticorps médicaments.

Remplacement

Des tests in vitro ont été au préalable effectués afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de notre traitement cependant le recours à des techniques totalement in vitro ou sur organes isolés est impossible car la complexité de l’environnement cellulaire est primordial et la voie d’administration de notre molécule est primordial sur la biodistribution. En effet, les différents traitements testés ont besoin de l’environnement cellulaire afin d’être efficaces car ils engendrent des mécanismes cellulaires (par exemple, le recrutement des cellules du système immunitaire muqueux ou le trafic sanguin et lymphatique). Enfin, ces techniques in vivo nous permettent de vérifier l’accessibilité de notre traitement à la zone de l’inflammation.

Réduction

Afin de tester ces différentes conditions de manière fiable, il faut un nombre suffisant d’animaux afin d’obtenir des résultats robustes nous permettant de passer à des études pré-cliniques réglementaires puis cliniques chez l’Homme. Les doses et conditions testées ont été longuement réfléchies afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire. Une approche statistique a aussi été étudiée afin d'obtenir un nombre suffissant de données permettant de valider l'étude expérimentale avec le nombre minimal d'animaux nécessaire.

Raffinement

Afin de limiter le stress des animaux, une période minimale de 5 jours d'acclimations à la zone d'hébergement expérimentale sera effectuée. Ils seront également progressivement manipulés régulièrement lors du change et des surveillances afin de les habituer aux contentions et autres manipulations. Toutes les manipulations et expérimentations seront effectué par du personnel qualifié. Les animaux seront surveillés strictement tout au long de l'expérimentation grâce à la grille de score permettant de détecter tous signes de souffrance et pouvoir évaluer si un point limite est atteint.

Choix des espèces

L’espèce a été choisie pour son temps de gestation court, de plus, cette espèce est utilisée à des fins scientifiques internationalement et possède un système immunitaire proche de celui de l’Homme. Les animaux utilisés auront entre 2 et 8 mois afin d'avoir un système immunitaire non défaillant.

240 rats vont être utilisés, tous tués après le dernier test pour récupérer leurs pattes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sous anesthésie, 180 d'entre eux subissent une incision de la plante de la patte, puis tous passent jusqu'à six tests plantaires où l'équipe mesure leur temps de réaction à un stimulus de chaleur. Le but est de savoir si la mycolactone, toxine produite par la bactérie M. ulcerans, soulage la douleur postopératoire, et 60 rats incisés ne reçoivent aucun traitement, groupe chez qui le porteur attend une douleur modérée. Il écrit que "Le bien-être animal a été une des priorités dans la conception de cette étude".

Objectifs

Notre équipe travaille sur les propriétés analgésiques de la mycolactone, toxine produite par M. ulcerans. Nous avons démontré par des approches in vivo que la mycolactone induisait une hypoesthésie locale pendant plus de 24h après son inoculation en ciblant AT2R. Cette fixation permet l’activation d’une voie cellulaire permettant l’ouverture des canaux potassiques de la famille TRAAK. L’ouverture de ces canaux permet une fuite de potassium provoquant une hyperpolarisation cellulaire, empêchant la diffusion de l’influx nerveux par les cellules nerveuses. Jusqu’à maintenant, l’activité analgésique de la mycolactone n’avait été évaluée au laboratoire que sur des modèles de rats ne présentant pas de douleur. L’utilisation de ces modèles a d’ores et déjà permis de démontrer que la mycolactone présente des propriétés analgésiques supérieures à la morphine. De plus, nous avons pu augmenter son pouvoir analgésique en l’encapsulant dans des nanocapsules. Dans ce contexte, notre objectif est de déterminer si la mycolactone pourrait être utilisée comme analgésique local (en raison de sa faible diffusion après inoculation) dans des modèles de « douleur ». Compte tenu de son effet analgésique durable (entre 24 et 48 h après une injection unique en sous cutanée) et de sa faible diffusion dans l’organisme, la mycolactone pourrait présenter un intérêt pour traiter les douleurs post opératoires. Ainsi nous proposons d’évaluer l’effet analgésique de la mycolactone dans un modèle pertinent de douleur postopératoire

Bénéfices attendus

Nos résultats antérieurs ont montré que la mycolactone présentait des propriétés analgésiques lorsqu’elle était administrée par injection en sous cutanée chez des rats naïfs. Parallèlement, nos collaborateurs ont montré l’effet analgésique de la mycolactone dans le traitement de la douleur induite par des neuropathies (modèle de ligature du nerf sciatique). Compte tenu de l’ensemble des résultats positifs obtenus ces derniers mois, il nous semble judicieux d’évaluer les propriétés analgésiques de la mycolactone dans le traitement des douleurs post-opératoires. Ce projet se justifie puisque l’arsenal thérapeutique contre les douleurs reste limité.

Procédures

Les animaux seront répartis en 4 groupes de 60 animaux chacun (soit 240 animaux au total) : - sans incision - avec incision non traité - avec incision traité par un anesthésique de référence pour le traitement des douleurs post-opératoires (bupivacaïne). - avec incision traité par la mycolactone Incision plantaire, réalisée une seule fois. Geste réalisé sous anesthésie gazeuse. La durée de ce geste est d’environ 5 à 10 minutes. Les animaux concernés sont au nombre de 180 (Procédure 2 + 3 + 4). Les 60 animaux restants subiront tout le geste technique (anesthésie, désinfection de la patte) mais sans l’incision. Traitement : Injection à proximité du nerf sciatique, réalisée une seule fois. Geste réalisé sous anesthésie gazeuse 24 heures après l’incision. La durée de l’injection est rapide (

Impact sur les animaux

Suite à l’incision, il est attendu une douleur modérée, tout particulièrement chez les animaux non traités. Plusieurs indicateurs seront suivis : - L’induction d’une sensibilité excessive que nous détecterons lors des tests plantaires par un temps de réaction au stimulus chaleur réduit par rapport aux rats non incisés. - L’induction d’une modification de la démarche (telle qu’un boitement). - Un changement du comportement les 24 premières heures. De plus, malgré nos précautions, une surinfection (gonflement du coussinet, changement du comportement accentué de l’animal) de l’incision n’est pas à exclure. L’inoculation de la mycolactone ou de la bupivacaïne pourrait entraîner les effets suivants : -Surinfection au site d’inoculation (gonflement du coussinet, rougeur, changement de comportement marqué de l’animal) - Inflammation due aux propriétés pro-inflammatoires de la mycolactone - Altération de la démarche (boitement ou gêne locomotrice)

Devenir

A la suite du dernier test plantaire, tous les animaux seront mis à mort et les pattes seront récupérées pour des études histologiques.

Remplacement

Le bien-être animal a été une des priorités dans la conception de cette étude mais nous ne pouvons à ce stade nous passer d'utiliser des animaux. En effet, la phase réalisée chez les animaux permettra de valider l’effet de la mycolactone dans le traitement de douleurs post opératoires dans un système biologique complexe où de nombreux facteurs peuvent intervenir (disponibilité du composé, dégradation, capacité du composé à atteindre sa cible...). De plus, cette phase est obligatoire pour le développement d’analgésique destiné à la santé humaine et animale.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour cette étude est suffisant pour que les résultats soient statistiquement significatifs sans pour autant exagérer ce nombre. Afin de valider des différences statistiques, les groupes seront composés de 6 rats et un test statistique 2-way ANOVA sera réalisé. Si l’analyse des résultats montre l’absence d’effet analgésique de la part de la dose de mycolactone utilisée, ou souligne des effets secondaires (non rapportés à ce jour dans nos travaux précédents), les expériences ne se poursuivront pas pour cette dose. Cependant, si les résultats montrent un effet analgésique sans effet indésirable, alors l’expérience sera répétée une seconde fois indépendamment pour accroître la qualité de nos résultats. Ce préalable est indispensable pour la poursuite de notre étude, qui vise à réaliser une étude dans un modèle animal plus complexe.

Raffinement

Afin de raffiner les conditions de vie des rats, un suivi adapté des animaux a été instauré afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'elles pourraient éprouver. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et bénéficient d’un enrichissement adapté. Un suivi régulier sera effectué sur l'ensemble des animaux et des indicateurs comportementaux et physiques sont prédéfinis et constituent les points limites. Pour éviter toute souffrance ou stress lors du protocole expérimental, un anesthésique volatil (isoflurane) sera utilisé. La procédure d’incision sera d’abord pratiquée sur des cadavres pour s’entrainer à maitriser et calibrer l’incision avant de démarrer le protocole sur animaux vivants. Cet entrainement permettra de réaliser la procédure efficacement et rapidement pour éviter toute souffrance ou stress inutile aux animaux et diminuer le temps d’anesthésie générale. La dose de mycolactone maximale sera 4 μg car nos travaux précédents montrent qu’au-delà de cette dose il y a un risque de lésions tissulaires et d’inflammation. Lors de chaque expérience, les données des tests plantaires seront analysées au fur et à mesure et les tests seront arrêtés si à 6h aucun effet analgésique n’est observé de la part de la dose de mycolactone testée. Si un effet analgésique apparait, les tests se poursuivront jusqu’à ce que l’effet disparaisse, c’est-à-dire lorsque le temps de réaction au test plantaire des rats ayant reçu la mycolactone sera de nouveau identique à celui des rats du groupe témoin incisé non traité (arbre décisionnel en annexe). De plus, pour le groupe de rats ayant reçu la bupivacaïne(anti-douleur de référence pour le traitement des douleurs post-opératoires, un test sera réalisé 30 min après l’injection puis les animaux seront mis à mort (il a été montré par nos collaborateurs que l’effet est maximal jusqu’à 30 min après injection et disparait après 1 heure). Nous testerons les doses dans l’ordre décroissant, dès qu’une dose n’aura pas d’effet analgésique, nous arrêterons nos expérimentations et ne testerons pas les autres doses. Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique de l’expérimentation animale et, est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.

Choix des espèces

De nombreuses études visant à identifier de nouveaux analgésiques pour la prise en charge de la douleur postopératoire utilisent « l’espèce rat ». En effet, le modèle de Brennan est le modèle de référence pour évaluer des analgésiques sur la douleur postopératoire. Les animaux utilisés pour ce protocole devront, à l’initiation de l’expérimentation, être âgés de 6 semaines afin d’être homogène avec les autres partenaires du consortium.

Nourries d'un régime riche en sucres, en graisses et en sel de la semaine précédant l'accouplement jusqu'au sevrage, des souris gestantes donnent naissance à des souriceaux dont certains sont tués dès le premier ou le quinzième jour pour prélever sang et cerveau. En tout, 458 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, les mères étant tuées après le sevrage. Les descendants adultes reçoivent une injection dans l'abdomen chaque jour pendant 21 jours et passent six ou huit tests comportementaux que le résumé ne nomme pas. L'équipe cherche un lien entre alimentation maternelle et comportements de type autistique. Le porteur l'écrit lui-même : "Aucun bénéfice médical immédiat" n'en est attendu.

Objectifs

Les femelles reproductrices recevront soit une alimentation standard, soit une alimentation riche en sucres, en graisses et en sel. Cette alimentation débutera une semaine avant l’accouplement et sera maintenue pendant la gestation et l’allaitement. Selon la procédure, un produit étudié ou une solution témoin sera également administré dans l’eau de boisson de façon continue pendant la gestation et l’allaitement, sans contention ni geste invasif. Les solutions seront renouvelées chaque semaine. À l’âge adulte, les souris concernées recevront une injection dans l’abdomen une fois par jour pendant 21 jours. Chaque injection et la contention nécessaire dureront quelques secondes. Le développement des souriceaux sera évalué entre le 2e et le 16e jour après la naissance. Chaque évaluation durera moins de dix minutes, puis le souriceau sera immédiatement replacé auprès de sa mère. À l’âge adulte, les animaux réaliseront des tests comportementaux non invasifs. Selon la procédure, six ou huit types de tests seront réalisés, avec un seul test par jour lorsque cela sera possible. Enfin, les prélèvements seront réalisés uniquement au moment de la mise à mort, au 1er ou au 15e jour après la naissance chez les souriceaux concernés, ou à la fin de l’étude chez les souris adultes

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre comment une alimentation maternelle très déséquilibrée peut modifier le développement du cerveau et le comportement de la descendance. Les résultats permettront d’identifier plus précisément les cellules et les mécanismes biologiques concernés. Le projet cherchera notamment à déterminer si une inflammation apparaissant très tôt après la naissance joue un rôle dans les modifications observées. Il permettra aussi de vérifier si l’action sur certains mécanismes du cerveau peut réduire les modifications du développement ou du comportement observées chez la souris. Ces connaissances pourront aider à mieux comprendre le rôle de facteurs environnementaux précoces dans les troubles du développement du cerveau et orienter de futurs travaux de recherche. Aucun bénéfice médical immédiat n’est attendu. À plus long terme, les résultats pourraient contribuer à identifier de nouvelles pistes de prévention ou de traitement, qui devront ensuite être confirmées par d’autres études avant toute application chez l’être humain

Procédures

Les femelles reproductrices recevront soit une alimentation standard, soit une alimentation riche en sucres, en graisses et en sel. Cette alimentation débutera une semaine avant l’accouplement et sera maintenue pendant la gestation et l’allaitement. Selon la procédure, un produit étudié ou une solution témoin sera également administré dans l’eau de boisson de façon continue pendant la gestation et l’allaitement, sans contention ni geste invasif. Les solutions seront renouvelées chaque semaine. À l’âge adulte, les souris concernées recevront une injection dans l’abdomen une fois par jour pendant 21 jours. Chaque injection et la contention nécessaire dureront quelques secondes. Le développement des souriceaux sera évalué entre le 2e et le 16e jour après la naissance. Chaque évaluation durera moins de dix minutes, puis le souriceau sera immédiatement replacé auprès de sa mère. À l’âge adulte, les animaux réaliseront des tests comportementaux non invasifs. Selon la procédure, six ou huit types de tests seront réalisés, avec un seul test par jour lorsque cela sera possible. Enfin, les prélèvements seront réalisés uniquement au moment de la mise à mort, au 1er ou au 15e jour après la naissance chez les souriceaux concernés, ou à la fin de l’étude chez les souris adultes

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont globalement légers et temporaires. L’alimentation riche en sucres, en graisses et en sel peut entraîner une prise de poids modérée, estimée entre 10 et 15 % chez les femelles reproductrices et à moins de 10 % chez leur descendance. Aucun effet important sur leur état général n’a été observé lors des études précédentes. Les produits administrés dans l’eau de boisson ne nécessitent ni contention ni intervention invasive. Aucun effet indésirable particulier n’est attendu avec ce mode d’administration. Les injections réalisées chez les souris adultes nécessiteront une contention brève et pourront provoquer une douleur légère et passagère au moment de l’injection. Une irritation locale au point d’injection est également possible. Les évaluations du développement nécessiteront de manipuler les souriceaux et de les séparer temporairement de leur mère, pendant moins de dix minutes. Cette séparation pourra provoquer un stress bref. Les souriceaux seront immédiatement replacés auprès de leur mère après chaque évaluation. Les tests réalisés à l’âge adulte sont non invasifs. Ils pourront toutefois entraîner un stress léger et temporaire lié au changement d’environnement, à la manipulation ou à la présence d’une autre souris. L’état général des animaux sera surveillé quotidiennement. Toute douleur, détresse ou altération persistante entraînera l’arrêt de l’intervention et la prise en charge immédiate de l’animal. .

Devenir

À l’issue des expérimentations, tous les animaux seront mis à mort. Aucun animal ne sera réutilisé, gardé en vie, placé ou remis en liberté. Certains souriceaux seront mis à mort 1 ou 15 jours après la naissance afin de permettre le prélèvement immédiat du sang et du cerveau. Les autres descendants seront mis à mort à l’âge adulte, soit pour prélever leur cerveau, soit après la réalisation des tests comportementaux. Les femelles reproductrices seront mises à mort après le sevrage de leur portée. Leur réutilisation n’est pas possible, car l’exposition alimentaire, les traitements, la gestation et la lactation modifient leur état physiologique. Une nouvelle utilisation introduirait des biais liés à l’âge, à la parité et aux expositions antérieures.

Remplacement

Ce projet étudie les effets d’une alimentation maternelle déséquilibrée sur la grossesse, l’allaitement, le développement du cerveau et le comportement de la descendance. Ces phénomènes dépendent de nombreux échanges entre la mère et ses petits et ne peuvent pas être reproduits correctement avec des cellules cultivées en laboratoire ou par une simulation informatique. Des méthodes réalisées sur des tissus seront utilisées pour analyser certains changements dans le cerveau. Elles ne peuvent toutefois intervenir qu’après l’étude sur l’animal et ne permettent pas, à elles seules, d’observer le développement, les interactions sociales, les déplacements ou les comportements répétitifs.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé avant le début du projet afin d’utiliser le plus petit effectif permettant d’obtenir des résultats fiables. Les expériences seront organisées de manière à comparer plusieurs groupes au cours d’une même étude, plutôt que de réaliser une expérience séparée pour chaque question. Lorsque cela est possible, plusieurs informations seront recueillies chez le même animal. Chez certains souriceaux, le sang et le cerveau seront ainsi analysés ensemble. Les souris adultes participeront à plusieurs tests comportementaux successifs, ce qui évite de constituer un groupe différent pour chaque test. Dans une procédure, les mêmes animaux seront suivis depuis leur développement précoce jusqu’à l’âge adulte. Les mesures obtenues sur plusieurs cellules ou plusieurs zones du cerveau d’une même souris ne seront pas considérées comme provenant de plusieurs animaux. Enfin, les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques adaptées afin d’exploiter au mieux toutes les données recueillies.

Raffinement

Toutes les mesures possibles seront prises pour limiter le stress, l’inconfort et la douleur des animaux. Les souris seront hébergées en petits groupes, avec un abri et du matériel pour construire un nid. Les femelles et leurs petits seront surveillés chaque jour. Les manipulations seront réalisées par du personnel formé et, autant que possible, par les mêmes personnes. Les animaux seront progressivement habitués à être manipulés avant les expériences. Les souriceaux ne seront séparés de leur mère que pendant le temps strictement nécessaire aux évaluations, sans dépasser dix minutes, puis seront immédiatement replacés dans leur cage. Les produits seront administrés dans l’eau de boisson lorsque cela est possible, afin d’éviter les contentions et les injections répétées. Lorsque des injections seront nécessaires, elles seront très brèves, réalisées avec du matériel adapté et en alternant les côtés d’injection afin de limiter les irritations. Les tests comportementaux seront réalisés dans un environnement calme. Ils seront organisés du moins contraignant au plus contraignant, avec un temps de repos entre les tests. Tout animal présentant une douleur, une blessure, une perte de poids importante ou une modification durable de son comportement sera rapidement pris en charge et retiré de l’étude si nécessaire.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle permet d’étudier, dans un organisme entier, les effets de l’alimentation de la mère pendant la gestation et l’allaitement sur le développement du cerveau et le comportement de la descendance. C’est également une espèce sociale dont les comportements, notamment les interactions avec d’autres souris, les déplacements et les comportements répétitifs, sont bien connus. Le modèle utilisé est déjà établi au laboratoire. Les femelles reproductrices seront utilisées à l’âge adulte, entre 8 et 16 semaines, lorsqu’elles sont aptes à se reproduire. Dans une partie du projet, des souriceaux seront étudiés le premier et le quinzième jour après la naissance afin d’observer des mécanismes inflammatoires précoces. Dans une autre partie, le développement sera suivi entre le 2e et le 16e jour après la naissance, période pendant laquelle apparaissent progressivement la locomotion, l’odorat, l’audition et la vision. Enfin, certaines souris seront étudiées à partir de 8 semaines, lorsque leur cerveau et leurs comportements sont arrivés à maturité. Cela permettra d’évaluer les conséquences durables de l’exposition reçue avant et après la naissance.

Une incision au bout de la queue, puis la croûte retirée toutes les trente minutes pour faire ressaigner, jusqu'à six gouttes de sang : c'est le test de tolérance au glucose prévu pour une partie des 3 780 souris de ce projet. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, qui comprennent aussi des gavages quotidiens, des injections intrapéritonéales, une péritonite provoquée au zymosan et une obésité induite. L'équipe veut suivre la transformation des monocytes en macrophages dans les tissus, avec des retombées thérapeutiques formulées au conditionnel. Le porteur écrit n'avoir détecté "aucun effet perceptible sur le bien être de la souris" après l'injection de zymosan, qui déclenche pourtant une inflammation de la cavité péritonéale.

Objectifs

Les macrophages sont des cellules immunitaires présentes dans tous les organes, dans lesquels ils participent aux réponses immunitaires et à l'entretien du fonctionnement des organes. Après la naissance, ils se développent à partir de cellules du sang appelées monocytes. Les données scientifiques actuelles suggèrent que les macrophages dérivant des monocytes joueraient un rôle clé dans les réponses inflammatoires. L’objectif de ce projet est d’étudier la différentiation des monocytes en macrophages après leur migration du sang vers les organes. Pour cela, nous utiliserons de nouveaux outils génétiques pour cibler précocemment les macrophages dérivant des monocytes avant qu’ils ne complètent leur maturation et établissent une résidence tissulaire. Afin de déterminer le rôle physiologique de cette voie de différentiation monocytaire, nous étudierons nos modèles en conditions d’inflammation aigue (péritonite, qui est une inflammation de la cavité péritonéale) et de stress métabolique (obésité) qui sont connues pour accélerer le recrutement des monocytes et leur différentiation en macrophages.

Bénéfices attendus

La cavité péritonéale contient de nombreux macrophages ayant la capacité d'éliminer les microbes au cours de la réponse immunitaire, en cas de péritonite (inflammation aigue de la cavité péritonéale). Les macrophages péritonéaux murins étant homologues aux macrophages péritonéaux humains, les résultats de cette étude pourraient donc ouvrir de nouvelles perspectives applicables à l'homme pour le traitement des pathologies infectieuses. Sur l’aspect métabolique, les macrophages du tissu adipeux régulent la prise de masse grasse et l’obésité s’associe avec une augmentation du nombre de macrophages qui dérivent des monocytes. Comprendre les facteurs régulant la différentiation des monocytes en macrophages au cours de l’obésité pourrait offrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour traiter les pathologies métaboliques.

Procédures

Au cours de ce projet les interventions réalisées sur animaux vigiles seront les suivantes : des gavages quotidiens pendant 3 jours (la durée de cet acte est de 20 secondes), des injection intrapéritonéale (jusqu'à deux par procédure, environ 10 secondes), 1 prélèvement de sang en fin d'expérience (30 secondes par prélèvement), prélèvement de sang au niveau de la queue pendant le test de tolérance au glucose (une incision est pratiquée à l'extremité de la queue et une goutte de sang est deposée sur la bandelette du glucomètre, la croute est retirée avec un tissu toutes les 30minutes pour renouveler le saignement et le prélèvement d'une goutte, pour un total de 6 gouttes prélevées).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des gavages répétés et recevront des injections intrapéritonéales, ce qui implique du stress et de l'inconfort liés à la contention, au gavage et aux injections. Les injections et prises de sang peuvent également provoquer une douleur. Toutefois, selon notre expérience des procédures expérimentales prévues, aucun effet sévère n'est attendu. En effet, le modèle de péritonite par zymosan est déjà utilisé dans le laboratoire et nous n'avons détecté aucun effet perceptible sur le bien être de la souris consécutivement à l'injection. Au cours du modèle d'obésité, la prise de poids des souris s'accompagne d'une réduction de leur activité physique et leur poil peut prendre un aspect gras caractéristique.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin d'expérimentation, et ce pour toutes les procédures. En effet, les expériences requièrent de collecter et analyser des organes d'intérêt par cytométrie en flux et microscopie confocale, ainsi qu'à utiliser de la moelle osseuse pour effectuer de la culture cellulaire in vitro, ce qui nécessite l'euthanasie des animaux.

Remplacement

La nécessité de cibler in vivo les macrophages en invalidant leur capacité à détecter certaines protéines, appelées facteurs de croissance, découle directement de résultats in vitro dans lesquels nous avons déterminé que ces facteurs de croissance jouent un rôle clé sur ces cellules. Les facteurs de croissance sont des molécules donnant notamment aux macrophages l'instruction de se maintenir en vie et de proliférer. Davantage d’études in vitro seront réalisées sur des cellules primaires issues des modèles murins du projet. Cependant, pour développer notre compréhension de la différentiation des monocytes en macrophages, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents types cellulaires présents dans et entre les différents organes.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction et éviter la génération d'animaux surnuméraires, nous utiliserons des schémas de croisement qui génèrent exclusivement des animaux d’intérêt. De plus, lorsque cela est impossible nous incluerons aussi bien les souris mâles que les souris femelles au sein de nos groupes expérimentaux. Nous avons effectué des analyses statistiques prédictives afin d'estimer le nombre d'animaux minimum nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes et assurer que nos résultats soient interprétables.

Raffinement

Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Dans les différentes procédures, le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Il est important de préciser que les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de "phénotype dommageable", c'est à dire pas d'altérations physiques qui pourraient affecter leur bien-être. Dans le cas d’injections intrapéritonéales répétées, nous utiliserons des aiguilles très fines et surveillerons l’aspect des sites d’injection. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (plusieurs fois par semaine en fonction des procédures) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Nous possédons une expertise établie de ce modèle ainsi que des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. De plus, nous étudions des populations de macrophages présentes chez l’Homme comme chez la souris. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de matériel pour faire des analyses protéiques (étude qualitative et quantitative des protéines), génomiques (études génétiques) et histologiques (étude de la structure des organes). Nous utiliserons les animaux à partir de l'âge de 3 semaines, car c'est à cet âge que nos cellules d'intérêt se développent dans les tissus. Nous utiliserons toutes les souris du bon génotype disponibles au sein de notre colonie, y compris des souris qui auraient vieilli au delà de l’âge auquel nous effectuerons la majorité des expériences (8 à 12 semaines), ce qui entre dans le cadre du principe de réduction.

Évaluer la toxicité de plus d'une centaine de candidats médicaments avant leur premier essai chez l'humain occupe 2 340 chiens, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent le produit par voie orale, intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse, le plus souvent chaque jour, au fil d'études qui durent d'un jour à 52 semaines, et peuvent subir jusqu'à une vingtaine d'interventions par semaine, prélèvements sanguins compris. Certains portent un émetteur de télémétrie implanté chirurgicalement pour enregistrer leurs paramètres cardiovasculaires, et peuvent être mis à mort quand la durée de vie de cet émetteur arrive à échéance. Sur l'ensemble, 2 112 chiens sont tués, le plus souvent pour l'analyse histopathologique de leurs organes, et 228 sont réutilisés dans une autre étude quand le vétérinaire juge leur état clinique compatible avec un nouveau composé.

Objectifs

Dans un cadre réglementaire, le projet réalisé vise à permettre l'évaluation du potentiel toxique d'un candidat médicament ainsi que l'évaluation de ses paramètres pharmacocinétiques (absorption, distribution, métabolisme et élimination), pharmacodynamiques et de biodistribution dans le cadre de son développement préclinique. Cette évaluation chez une espèce non-rongeur est indispensable pour chaque nouveau candidat médicament avant de démarrer les essais cliniques chez l'homme, et avant toute autorisation de mise sur le marché. Ce projet permet également d’évaluer la tolérance/sécurité du candidat-médicament dans l’espèce cible dans le cadre du développement du médicament vétérinaire. Il est estimé que plus d’une 100aine de candidats médicaments seront évalués dans ce projet.

Bénéfices attendus

Le développement de composés pharmaceutiques requiert des explorations in vivo chez une espèce non-rongeur ainsi que des études réglementaires à proprement parler. Ces études peuvent être demandées par les autorités réglementaires, pour affiner ou mettre en place des conditions expérimentales, ou pour répondre à des questions de sécurité. Ces études peuvent donc servir à affiner les expériences en amont des études réglementaires qui devront être réalisées par la suite, en permettant de limiter le nombre global d'animaux utilisés dans le développement d'un produit. Elles peuvent aussi directement contribuer à assurer la sécurité non-clinique des médicaments en comprenant mieux leurs mécanismes. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme.

Procédures

Traitements répétés : Les animaux sont traités, par différentes voies (principalement orale et injection intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse) le plus souvent de façon journalière, hebdomadaire ou mensuel (pour des composés biologiques), avec le candidat médicament. La durée des administrations est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 3 heures maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études peut être courte (un jour) ou longue (en général de 1, 3 ou 6 mois voire 52 semaines pour les études règlementaires). Des prélèvements sanguins (sur animal vigile ou sous anesthésie) et recueils urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique, pharmacocinétique/pharmacodynamie ou biodistribution ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal) en amont du démarrage de chaque étude. La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse, n’excédant pas 16h, est aussi possible.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables ou nuisances attendus correspondent essentiellement : - aux effets pharmacologiques du produit administré, - à l’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée), - aux effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés, - à la sédation/anesthésie générale requises pour certaines procédures (prélèvements de biopsie, implantations chirurgicales d’émetteurs de télémétrie), - à la chirurgie (par exemple pour implanter un emetteur de télémétrie pour l’enregistrement des paramètres cardiovasculaires) et aux effets indésirables post-opératoires éventuels, - conditions d’hébergement en individuel quand requis par les procédures (ex : pour suivre la consommation alimentaire individuelle). L’hébergement individuel ne peut excéder 4h par jour. Les seules exceptions sont pour la collecte d’urine sur la nuit (sur une période de 16h maximum) et pour les enregistrements des paramètres cardiovasculaires (sur une période de 26h selon la technologie utilisée).

Devenir

Procédure 1 : études préliminaires Les animaux impliqués dans ce type d’études peuvent être ré-utilisés dans une étude si aucune analyse histopathologique n’est requise en fin d’étude, que le type de composé testé est compatible avec une réutilisation de l’animal, et que leur état clinique le permet, après évaluation par le vétérinaire. Dans ce cas, les animaux sont remis dans leur lieu d'hébergement habituel. Des animaux utilisés avec suivi de télémétrie lors de ces études peuvent être euthanasiés en fin de procédure si la durée de vie de l’émetteur implanté arrive à échéance. Procédure 2 : Étude de toxicologie subchronique (2 à 4 semaines) et chronique (13 à 52 semaines) chez le chien Les études de toxicologie règlementaire incluent généralement une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus. Les animaux sont euthanasiés à l’issue de la procédure. Procédure 3 : Evaluation des fonctions cardiovasculaire et respiratoire chez le chien conscient par télémétrie Les animaux de la procédure 3 sont ensuite utilisés dans les procédures 1 et 2. Leur finalité relève des procédures 1 et 2. Procédure 4 : -Les animaux impliqués dans ce type d’études peuvent être ré-utilisés dans une étude si aucune analyse histopathologique n’est requise en fin d’étude, que le type de composé testé est compatible avec une réutilisation de l’animal, et que leur état clinique le permet, après évaluation par le vétérinaire. Dans ce cas, les animaux sont remis dans leur lieu d'hébergement habituel. -En parallèle des prélèvements sanguins, réalisés au cours de l’étude, l’évaluation de la pharmacocinétique, de la pharmacodynamie et de la biodistribution, peut nécessiter des euthanasies intermédiaires et/ou terminale afin d’effectuer des prélèvements tissulaires et/ou une analyse histopathologique selon les différents temps de prélèvements définis dans l’étude. Ceci pour permettre l'évaluation de l'exposition du composé ou des composés dans le tissu cible, et /ou pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus, respectivement. Dans ce cas, les animaux seront euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

L’évaluation de la toxicité ainsi que l’évaluation de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamie de candidats médicaments selon les règlementations en vigueur nécessite encore l’utilisation d’animaux, et ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro. Il n'existe pas encore de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, et pour ce type de procédures de traitement identiques à celles utilisées chez l'homme ou chez l’animal (produit vétérinaire), en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant, et en particulier des réponses immunitaires et des différentes phases d’absorption, de métabolisme, de distribution et d’élimination du/des composé(s).

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est le minimum permettant une analyse statistique fiable, conformément aux recommandations des lignes directrices. En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, d’analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes. Le nombre d’animaux utilisés est le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude. En incluant dans une même étude (i.e. sur les mêmes animaux), l’évaluation toxicologique et l’évaluation des paramètres de pharmacologie de sécurité, le nombre d’animaux utilisés est très nettement réduit. Dans le cadre d’une évaluation de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamie en étude indépendante, le nombre d'animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude et du nombre de doses testées. En effet, des animaux des deux sexes seront utilisés uniquement pour permettre l'évaluation de l'effet du sexe sur les paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques et sur la biodistribution. Par ailleurs, il peut y avoir une comparaison avec des composés de référence, un criblage de plusieurs produits, etc… Mais le nombre d’animaux par groupe correspondra au minimum permettant une analyse statistique fiable, conformément aux recommandations des lignes directrices (ICH S3 M2, ICH S3). Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, certains animaux peuvent être utilisés plusieurs fois pour tester différents produits à condition de respecter une période de repos et sous réserve de l'avis favorable du vétérinaire sanitaire.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement à plusieurs reprises. L’attention portée aux animaux et leur surveillance clinique sont adaptées aux études, en tenant compte des points limites éthiques établis par procédure. Les paramètres suivants sont contrôlés régulièrement (selon les signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux. Tout symptôme est signalé au Directeur d’étude et au vétérinaire. pour application des points limites (ex. en cas de plaie et/ou douleur, possibilité de traitement avec un cicatrisant cutané local et/ou un anti-inflammatoire, un antibiotique). D’autres traitements peuvent être mis en place suivant les recommandations des vétérinaires, selon les observations, conditions d’expérimentation. Des points limites sont définis pour envisager les situations où il s'avère nécessaire d'arrêter le traitement ou d'euthanasier précocement un animal. Une attention est portée à l'enrichissement environnemental (ex. types de jeux, nourriture, renforcement positif, habituation suffisante aux procédures, …). L’aménagement des box avec des rampes, plateformes, une communication entre les box permet aux animaux d’exprimer les comportements physiologiques et activités qu’ils auraient dans leur habitat naturel, tel que courir, grimper et sauter. Des séances de caresses et/ou de sociabilisation peuvent également être effectuées. L’hébergement est groupé permettant les interactions sociales entre congénères, mais individuel si dicté par l’objectif de l’expérimentation ou en cas d'incompatibilité sociale ou si l’état de l’animal l’exige. La justification scientifique de l'hébergement individuel doit être apportée et des éléments d'enrichissement supplémentaires sont utilisés (ex. jeux, contacts humains plus fréquents). L’évaluation des paramètres de pharmacologie de sécurité est effectuée par télémétrie, permettant l’obtention de données fiables, sur des périodes de temps prolongées, et avec des contraintes sur l’animal minimisées. L'évaluation pharmacocinétique et pharmacodynamique d'un ou de plusieurs composés administrés se fait généralement à des doses pharmacologiques (donc faibles et similaires à celles utilisées chez l'Homme) et avec l'ensemble des voies administrations utilisées chez l'homme ou l'animal pour les produits vétérinaires.

Choix des espèces

L’évaluation de la toxicité et la sécurité de candidats médicaments (pour la santé humaine et animale), selon les règlementations en vigueur nécessite encore l’utilisation d’animaux, une espèce rongeur et une espèce non-rongeur. Ce projet décrit ces études pour l’espèce chien. Les études sont menées en fonction de ce qui est prévu ensuite chez l’Homme (mode d’administration, durées de traitement…). Pour les médicaments vétérinaires, les études sont généralement à réaliser dans l’espèce cible, telle que le chien, compte tenu de la spécificité de chaque espèce animale. L'évaluation de la toxicité d'un candidat médicament ne peut pas être réalisée in vitro. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ce type de procédures de traitement identiques à celles utilisées chez l'homme (ou chez le chien pour les produits vétérinaires destinés à cette espèce), en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Les chiens sont usuellement âgés de 4 à 9 mois au début de l'étude. Des animaux plus jeunes, mais sevrés (à partir de 8 semaines), de même que des animaux adultes plus âgés (12 à 24 mois) peuvent être utilisés, pour que les animaux d’études soient représentatifs de la population cible.