Procédures sévères

1 860 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées pour des prélèvements de tissus. Certaines porteront un cathéter dans l'estomac, pour des perfusions de trente minutes au plus qui peuvent cumuler 17 h 30 par souris. Après une ou deux chirurgies, avec des fibres optiques portées sur la tête, elles passent des tests de comportement que le porteur ne nomme pas, des mesures du métabolisme du glucose et de calorimétrie, et pour une partie d'entre elles des prises de sang toutes les deux semaines. Un régime gras peut durer dix mois, et une souris qui dépasse 70 g sort du protocole pour être tuée, comme celle dont le cathéter se déloge de l'estomac. Le porteur renvoie au "long terme" l'idée que ces méthodes virales "pourraient être plus facilement adaptées" à l'humain que la sleeve ou le bypass gastrique.

Objectifs

Le corps a besoin de maintenir un équilibre entre l'énergie qu'il consomme (la nourriture) et l'énergie qu'il dépense. C'est le cerveau qui pilote cet équilibre : il reçoit en permanence des informations sur l'état énergétique de l'organisme et adapte le comportement alimentaire en conséquence. Quand ce système se dérègle, cela peut conduire au surpoids ou à l'obésité. On pensait autrefois que l'hypothalamus, une région du cerveau, était le seul véritable chef d'orchestre de cet équilibre. Mais on sait aujourd'hui que d'autres zones du cerveau y participent aussi. Parmi elles, une structure appelée le noyau paraventriculaire du thalamus (PVT) semble jouer un rôle important : elle sert de relais, transmettant des informations entre le tronc cérébral et plusieurs autres régions impliquées dans la motivation, les émotions et la prise de décision. De plus en plus d'études montrent que le PVT influence les comportements liés à la nourriture. Mais ces travaux se sont surtout intéressés à "ce qu'on mange" sans regarder "comment le corps gère son énergie" et sans tenir compte du fait que le PVT n'est pas une structure homogène : il contient différents types de neurones selon qu'on se trouve à l'avant ou à l'arrière de cette région. Cette différence anatomique laisse penser que l'avant et l'arrière du PVT pourraient avoir des rôles distincts dans la régulation de l'énergie. Un indice intéressant : une partie des neurones de l'arrière possède un récepteur particulier à la dopamine, ce qui permet de les distinguer précisément des autres. À l'avant, les neurones sont en majorité d'un autre type. On ne sait pas encore si, ni comment, ces deux populations de neurones influencent la façon dont le corps s'adapte sur le plan énergétique et régule la prise alimentaire. Objectifs du projet : 1. Déterminer le rôle respectif des neurones de l'avant et de l'arrière du PVT dans la prise alimentaire et le métabolisme. 2. Étudier le fonctionnement électrique de ces neurones. 3. Identifier vers quelles régions du cerveau ces neurones envoient leurs signaux, et quel rôle jouent ces connexions. 4. Observer comment l'activité de ces neurones évolue dans le temps.

Bénéfices attendus

Les dernières estimations de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) révèlent qu'en Europe, plus de la moitié des hommes et des femmes sont en surpoids, et environ un tiers sont obèses. Cela représente également un fardeau social, économique et sanitaire. Bien que certains traits génétiques (causes monogéniques) aient été identifiés et largement étudiés, il est largement reconnu que le syndrome métabolique est par essence un trouble multifactoriel et multidimensionnel qui englobe des réseaux complexes des maladaptations physiopathologiques. Malgré les progrès et les efforts, nous sommes toujours confrontés à un besoin de stratégies innovantes et plus efficaces contre les troubles métaboliques. La prise alimentaire et la régulation de l’homéostasie énergétique ont souvent été étudiées sous l’angle d’une implication et dysfonctionnement de l’hypothalamus. Cependant, d’autres structures extra-hypothalamiques jouent aussi un rôle clé dans ces processus. Nos résultats préliminaires indiquent que le noyau paraventriculaire du thalamus PVT aurait un rôle central dans la régulation de la prise alimentaire et du métabolisme énergétique. Le projet vise à établir un nouveau cadre conceptuel qui voient dans les neurones aPVT et PVTD2R deux structures pour la régulation des processus physiologiques et physiopathologiques sous-jacents au développement du syndrome métabolique. Nous sommes convaincus que la mise en lumière des aspects intégratifs de la physiopathologie du PVT dans la surconsommation alimentaire sera essentielle pour élaborer et accélérer les stratégies préventives et thérapeutiques. En outre, à long terme, les stratégies virales utilisées pour ce projet pourraient être plus facilement adaptées et transposées aux troubles humains que les procédures chirurgicales invasives actuellement utilisées en thérapie (sleeve gastrectomie, bypass gastrique).

Procédures

Les animaux seront soumis : -pour 7 lots à une chirurgie (7j), puis après une période de repos, à des tests de comportements (7j-15j), de métabolisme du glucose(1j-3j) et/ou de mesure de calorimétrie indirecte(15j). Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles seront fait sur deux de ces lots toutes les deux semaines. -pour 2 lots à deux chirurgies qui se feront en une ou deux fois en fonction du bien-être de la souris et de sa capacité à supporter une anesthésie longue. Si cela doit se faire en deux fois les souris auront une phase de repos de 10-15j minimum avant la deuxième anesthésie. Après une période de repos de deux semaines minimum, les lots seront soumis à des tests de comportements (7j-15j), de métabolisme du glucose (7j) et/ou de mesure de calorimétrie indirecte(15j). Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles seront fait sur un de ces deux lots toutes les deux semaines.

Impact sur les animaux

Le fait de porter des fibres optiques sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress ; de même pour le cathéter gastrique. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable cependant les fibres/cathéters étant légers, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrements et de perfusions. Dans le cas d'apparition de croute au niveau du ciment, nous traiterons les animaux selon les recommandations du vétérinaires référents. Les animaux seront suivis les deux-trois premiers jours après chaque chirurgie puis 1 fois par semaine les semaines suivantes. Le cathéter peut également se déloger de l'estomac, ce qui provoque une fuite gastrique en intrapéritonéale. L'animal sera mis à mort immédiatement. Le régime gras provoque une augmentation de la masse corporelle, cette augmentation n'est pas mortelle mais, si une souris atteint un poids supérieur à 70 g, elle sortira du protocole expérimental pour être sacrifiée afin de diminuer sa souffrance. Afin de limiter la prise de masse corporelle, les souris resteront sous régime gras pendant 10 mois maximum. Les souris avec cathéter ne seront infusées qu'au cours des expérimentations. La durée de chaque infusion ne dépassera pas 30 minutes, pour une durée totale maximale de 17 h 30 par souris, soit 9 expériences au total.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet, nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et la régulation de la récompense alimentaire.

Réduction

Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Afin d'optimiser nos cohortes et réduire le nombre d'animaux transgéniques générés par croisements nous utiliserons l'ensemble des portées (mâles et femelles). Selon les dessins expérimentaux et les nombres de variables (groupes ; temps ; régimes ; comportements) nos effectifs seront déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Par rapport aux nombres d'échantillons nous utiliserons principalement des tests paramétriques et si nécessaire des tests non-paramétriques.

Raffinement

Le soin apporté aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien- être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, bâtons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé : notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris car celle-ci permet l’utilisation de stratégies transgéniques et virale qui sont peu développées ou absentes dans d’autres modèles. Toutes les souris seront utilisées à l’âge adulte (au moins 2 mois) afin que les réseaux neuronaux soient stables.

Injectés d'un composé qui freine la formation des vaisseaux, puis enfermés trois semaines dans une enceinte d'hypoxie où l'humidité dépasse 80 %, 1 800 rats sur les 2 000 du projet vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. De retour en air normal, la maladie s'aggrave et devient irréversible, au point que le porteur prévoit jusqu'à 40 % de morts dans les groupes suivis plus de trois semaines. Le but est de tester des candidats médicaments contre l'hypertension artérielle pulmonaire, donnés par gavage ou injection jusqu'à deux fois par jour, avant une ouverture du thorax pour mesurer les pressions et la mise à mort de tous les rats encore en vie. Le porteur décrit dans l'enceinte une humidité élevée, un risque d'accumulation d'ammoniaque et de CO2 et un bruit plus fort qu'en salle classique, puis affirme que les absorbeurs assurent des "conditions correctes pour les animaux".

Objectifs

L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie cardiovasculaire et pulmonaire rare et grave : sa prévalence dans la population générale en France est estimée à 15 cas par million et la survie médiane sans traitement après diagnostic est inférieure à 3 ans. Elle se caractérise par l’augmentation des résistances artérielles pulmonaires, responsable d'une hypertension, et aboutit à une insuffisance cardiaque. Cette maladie peut survenir de cause inconnue, dans un contexte familial ou compliquer l’évolution de certaines pathologies (insuffisance cardiaque). En identifiant et en traitant les patients le plus tôt possible, il est possible de retarder la progression de l'HTAP. Malheureusement, cette maladie est souvent mal diagnostiquée et traitée, car les symptômes initiaux sont légers et peu spécifiques (essoufflements, lipothymie et asthénie). Si les options thérapeutiques ont progressé ces dix dernières années et ont permis d'améliorer les conditions de vie des malades, la prise en charge de l'HTAP demeure incomplète car ne prolonge pas significativement le durée de vie après diagnostic. Ainsi, la recherche de médicaments ciblant de nouveaux mécanismes physiopathologiques reste un enjeu majeur pour les années à venir. Les tests de nouvelles molécules doivent se réaliser sur des modèles animaux suffisamment prédictifs de la maladie, afin d’optimiser la sélection des candidats médicaments qui entreront en phase clinique. Le modèle présenté d'HTAP chez le rat, induit conjointement par l’administration d'un composé diminuant la formation de vaisseaux sanguins et par une hypoxie (diminution des apports en oxygène) chronique, est un modèle qui reproduit l'ensemble des caractéristiques physiopathologiques décrites chez l'Homme, à savoir une atteinte vasculaire qui est associée à long terme avec le développement d'une insuffisance cardiaque droite. De plus, les traitements actuellement proposés chez l'Homme montrent des résultats bénéfiques significatifs dans ce modèle. Ainsi, ce modèle d'HTAP représente un modèle préclinique de choix pour l’étude de l’HTAP. Ce modèle nous permettra d’évaluer, chez le rat, l’efficacité de nombreux candidats médicaments qui s’intéressent à des mécanismes d’actions connus (atteintes vasculaires) et des cibles thérapeutiques nouvelles (atteintes cardiaques). Ce modèle nous permettra également une meilleure compréhension des mécanismes mise en jeu dans la maladie afin d’améliorer la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

L’HTAP est une maladie rare et grave pour laquelle il n’existe actuellement pas de traitements curatifs efficaces. Si les traitements prescrits actuellement, essentiellement des vasodilatateurs, permettent une amélioration de la qualité de vie des patients et une prolongation de la survie en freinant l’évolution de la pathologie, la moitié des patients décèdent dans les sept ans qui suivent le diagnostic. Compte-tenu de l’évolution de l’HTAP dans ce modèle animal qui mime fidèlement la maladie humaine, la réalisation d’études précliniques utilisant des candidats médicaments novateurs apparait primordiale pour mettre en évidence de nouvelles pistes thérapeutiques. Ainsi, à terme, l’utilisation de ce modèle animal permettra de sélectionner des composés présentant des bénéfices sanitaires significatifs en vue d’essais cliniques.

Procédures

Une injection sous-cutanée (S.C.) du composé diminant la formation des vaisseaux est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les animaux sont ensuite placés dans une enceinte d’hypoxie pendant 3 semaines avant de retourner en condition de normoxie (conditions d'hébergement classique) durant 0 à 6 semaines. Pendant la période de normoxie, les animaux pourront être traités quotidiennement, une à 2 fois par jour selon le composé testé, par gavage, injection intrapéritonéale (I.P.), sous-cutanée (S.C.), ou intranasale (I.N.). Les animaux pourront subir une chirurgie sous anesthésie générale afin de placer sous la peau une pompe contenant des substance, permettant la diffusion continue de candidats médicaments et dont la durée d'intervention est d'environ 15-25min. Des injections intraveineuses sous anesthésie gazeuse pourront également être réalisées 1 à 2 fois par semaine. Durant la normoxie, des prélèvements de sang à la veine jugulaire ou des examens échocardiographiques de suivi pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse. A la fin du protocole, une chirurgie sous anesthésie gazeuse et analgésie est réalisée afin de mesurer les pressions artérielles en insérant un cathéter relié à un capteur de pression dans l’artère carotide. Une thoracotomie est ensuite réalisée afin d’insérer un cathéter dans le ventricule droit puis dans l’artère pulmonaire pour des mesures de pressions. Un prélèvement de sang terminal intracardiaque pourra être réalisé avant la mise à mort des animaux par surdose de produit euthanasiant. [MODIFICATION: Les animaux seront soumis à un test d'effort sur tapis roulant dont la l'intensité maximale augmente progressivement jusqu'à l'épuisement de l'animal. Ce test sera réalisé au maximum 2 fois au cours du protocole, avant le début des traitements et à la fin du protocole (durée maximale du test 35 min).]

Impact sur les animaux

Les animaux sont soumis à une anesthésie et reçoivent une injection sous-cutanée pour induire une hypertension artérielle pulmonaire. Ils sont ensuite placés dans une enceinte d’hypoxie pendant 3 semaines. L’humidité dans l’enceinte est supérieure à 80%. En hypoxie, les animaux présentent une prise de poids ralentie de 50% par rapport à une stabulation conventionnelle à cause du stress et de l’asthénie provoqués par la déplétion en oxygène. De plus, le confinement dans l'enceinte d'hypoxie génère un inconfort, indépendamment de l'hypoxie elle même, via une humidité élevée et un risque d'accumulation d'ammoniaque et de CO2. De plus, le niveau sonore est plus élevé dans les caissons hypoxiques que dans les salles d'hébergements classiques pouvant engendrer du stress et de l'inconfort pour les animaux. A la fin de ces 3 semaines d’hypoxie, ils retournent dans la pièce d’hébergement conventionnelle pendant 0 à 6 semaines, période pendant laquelle la pathologie va s’aggraver et devenir irréversible. A long terme, les animaux peuvent mourir de la pathologie. Pendant la période de normoxie, les animaux pourront être traités quotidiennement, une à 2 fois par jour selon le composé testé, par gavage, injection intrapéritonéale, sous-cutanée, ou intranasale. Ces administrations peuvent êtres associées à des risques de fausses route, d'irritation ou de lésions de l'oesophage. Une chirurgie d’implantation de pompe contenant les composés pourra être réalisée après ouverture de la peau pouvant être source de douleur et/ou d'une gêne avec la présence de la pompe et de la diffusion des subtances. Des injections intraveineuses sous anesthésie pourront également être réalisées 1 à 2 fois par semaine. Des anesthésies gazeuses seront potentiellement réalisées au cours du protocole afin de réaliser des prélèvements de sang à la veine jugulaire ou des examens échocardiographiques de suivi. A la fin du protocole, les animaux sont anesthésiés afin de réaliser un acte chirurgical qui permet de mesurer les pressions artérielles en insérant un cathéter relié à un capteur de pression dans l’artère carotide. Une thoracotomie est ensuite réalisée afin d’insérer un cathéter dans le ventricule droit puis dans l’artère pulmonaire pour des mesures de pressions. Un prélèvement de sang terminal intracardiaque pourra être réalisé avant la mise à mort des animaux par surdose de produit euthanasiant. [MODIFICATION: Les tests d'efforts induisent un stress comportementale et physique.]

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux HTAP seront mis à mort afin de récupérer des organes pour des analyses de tissus (cœurs, poumons, artères pulmonaires) et/ou des analyses de morphologie des organes (pesée des deux ventricules du cœur). Les mesures de pressions dans le ventricule droit sont également trop invasives pour envisager un réveil des animaux. Un prélèvement de tissu sur les animaux Sham (non porteurs d'un HTAP) est nécessaire pour comparer aux conséquences cardiovasculaires des animaux porteurs de la maladie.

Remplacement

S'il existe un certain nombre de modèles de culture de cellules musculaires lisses, ces modèles in vitro sont utilisés en première intention (modèles de screening) et sont utilisés uniquement pour tester des activités moléculaires et identifier des voies de signalisation. Ces modèles cellulaires in-vitro ne permettent pas de tester l'efficacité d'un candidat médicament sur l'aspect de la restauration hémodynamique et morphologique mais sont utilisés en amont afin de sélectionner les meilleurs candidats à tester sur nos modèles in vivo. La validation de la formation aux techniques de mesures de pressions nécessite d’avoir recours à des animaux vivants car les phases critiques de l’approche chirurgicale reposent sur les risques hémorragiques qui peuvent entraîner des mesures de pression faussées, voir la mort de l’animal.

Réduction

Pour chaque groupe avec une HTAP, le nombre d'animaux nécessaire par groupe est fixé à 11. Ce nombre a été déterminé par un calcul de N, sur la base de données obtenues préalablement et prenant en compte les moyennes et déviations standards mesurées pour chaque paramètre. Basés sur les données historiques dans ce modèle d’HTAP, un pourcentage de perte de 15% est attendu jusqu’à 3 semaines de normoxie, correspondant aux animaux qui meurent au cours du protocole à cause du développement de la pathologie. Le nombre d’animaux inclus dans chaque groupe en début d’étude est donc de N=13. Lorsque le protocole inclus une période de normoxie supérieure à 3 semaines (jusqu’à 6 semaines), le nombre d’animaux par groupe est fixé à N=18 car le développement de la pathologie entraîne une mortalité plus importante des animaux (jusqu’à 40% de perte). Généralement, le groupe contrôle négatif (non malade) n’est composé que de 6 animaux car il y a peu de variabilité des paramètres cardiovasculaires étudiés. Ainsi, 1800 rats HTAP sont prévus dans le cadre de cette procédure et 120 rats Sham. Des échantillons de plasmas et/ou de tissus d'animaux sont prélevés à l'issue de certaines séries expérimentales et conservés pour pouvoir être utilisés dans le cadre d’autres projets de recherche (par exemple recherche d’un récepteur cible présent dans le plasma ou dans les tissus cardiaques ou vasculaires). L'utilisation de ces banques de tissus pour d'autres projets de recherches permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés car il permet de réduire le nombre de séries expérimentales réalisées.

Raffinement

A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. L'administration du composé induisant la pathologie est réalisée sous anesthésie. Pendant les 3 semaines d'hypoxie, les animaux sont hébergés dans des grandes cages en plexiglass prévues à cet effet avec une sciure particulièrement absorbante (8 animaux/cages). Les caissons d’hypoxie sont ouverts et nettoyés tous les jours. De la chaux sodée est placée dans le caisson pour absorber le C02 et changée tous les jours, de l'acide borique permet d'absorber l'ammoniaque générée par les urines et est remplacé toutes les semaines ; et des absorbeurs d'humidité sont présents assurant des conditions correctes pour les animaux. La ventilation des caissons peut être adaptée à l’aide d’aérations présentes sur les caissons dont l’ouverture et la fermeture peut être ajustée pour diminuer une humidité excessive. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation du bien-être animal. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Des points limites spécifiques au protocole sont établis (présence de plaies cutanées, fausse route…) Si des prélèvements de sang sont réalisés au cours du protocole, les animaux sont anesthésiés. Une anesthésie locale est également réalisée. Les rats sont placés sur un tapis chauffant avec contrôle de la température, et une réhydratation est réalisée en injectant en S.C. 3 fois le volume prélevé. Si des injections en voie I.V. sont réalisées, les animaux sont anesthésiés avec une analgésie locale et contôle de la température corporelle. Les mesures hémodynamiques réalisées en fin de protocole se font sur animaux anesthésiés ayant reçus une injection préalable d'analgésiant. Pour chaque anesthésie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant retro-contrôlé et du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux. Les pompes osmotiques sont implantées en s.c. sous anesthésie générale et analgésie locale. Un massage de la zone d'implantation de la pompe est effecuté pour limiter la fibrose des tissus et optimiser son fonctionnement. [MODIFICATION: A la suite des test d'efforts, les animaux seront réhydratés. Les animaux seront habitués au tapis roulant à hauteur de 3 fois maximum par semaine à faible intensité.]

Choix des espèces

Même si de nombreuses espèces animales sont concernées, la majorité des modèles d’HTAP ont été développés chez le rat adulte parce qu’il permet d’obtenir, après induction de la pathologie, des données hautement reproductibles. De plus, les rats présentent des modifications cardiovasculaires similaires à l’homme : modifications des pressions, remodelage vasculaire et cardiaque, perte de fonction. Finalement, ce modèle d'HTAP développé chez le rat représente un modèle de référence pour l’étude de l’HTAP car la progression de la pathologie est continue au cours du temps et mime ainsi l’évolution délétère de la maladie observée chez l’homme. Des rats de 4/6 semaines au moment où ils arrivent en acclimatation dans nos locaux sont utilisés pour ce modèle. Ce modèle est sensible à l’âge et des animaux plus âgés ne présentent pas le même développement de la pathologie.

1 960 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une injection de monocrotaline sous anesthésie leur provoque une hypertension artérielle pulmonaire. Ils reçoivent ensuite des composés chaque jour pendant cinq semaines, passent au moins deux imageries cardiaques et jusqu'à deux tests d'effort sur tapis roulant dont l'intensité augmente "jusqu'à l'épuisement de l'animal", avant une chirurgie terminale pour mesurer la pression dans le cœur. Les molécules retenues "pourraient ensuite" être étudiées chez l'être humain, alors que la maladie infligée peut réduire l'activité, l'appétit et le poids des rats. Sur le remplacement, le porteur affirme que les cellules ou tissus isolés ne rendent pas compte des "effets globaux" du médicament, et conclut que l'utilisation d'un "modèle animal est nécessaire".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester de nouveaux médicaments destinés au traitement d’une maladie grave des poumons appelée hypertension pulmonaire artérielle. Cette maladie entraîne une augmentation de la pression dans les vaisseaux des poumons, ce qui fatigue progressivement le cœur et peut conduire à une insuffisance cardiaque. Elle peut apparaître sans cause connue, être liée à des facteurs familiaux, ou être associée à d’autres maladies ou à certains médicaments. Bien que des traitements existent déjà pour soulager les symptômes, leur efficacité reste limitée et variable selon les patients. Le but de cette étude est donc d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle animal, afin de mieux comprendre leur potentiel avant une éventuelle utilisation chez l’être humain.

Bénéfices attendus

Le modèle utilisé dans ce projet reproduit de manière fiable les principales caractéristiques de la maladie étudiée, en particulier les atteintes des vaisseaux des poumons et du cœur. Chez les animaux, l’augmentation progressive de la pression dans les poumons entraîne des modifications du cœur similaires à celles observées chez les patients atteints de cette maladie. L’utilisation de ce modèle permet de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et d’évaluer l’effet de nouveaux médicaments dans des conditions proches de celles rencontrées chez l’être humain. Les résultats obtenus permettront d’identifier les futurs molécules thérapeutiques les plus prometteuses, qui pourraient ensuite être étudiés chez l’homme dans le cadre d’essais cliniques, avec pour objectif d’améliorer la prise en charge future des patients.

Procédures

Les animaux sont anesthésiés afin d’injecter la substance induisant une augmentation de la pression artérielle dans les petits vaisseaux sanguins localisés dans les poumons c'est-à-dire l'hypertension artérielle pulmonaire (durée de l’intervention : 6-8 min). Durant les 5 semaines suivantes, les animaux seront traités quotidiennement avec plusieurs composés par différentes voies d'administration selon les objectifs de l’étude (durée de 1 à 5 minutes selon la voie choisie). Le traitement pourra également être administré via des pompes diffusant les composés, implantées sous anesthésie et analgésie. [MODIFICATION: Les animaux seront soumis à un test d'effort sur tapis roulant dont la l'intensité maximale augmente progressivement jusqu'à l'épuisement de l'animal. Ce test sera réalisé au maximum 2 fois au cours du protocole, avant le début des traitements et à la fin du protocole (durée maximale du test 35 min).] Au cours du protocole, les animaux seront à nouveau anesthésiés afin de réaliser une imagerie cardiaque (environ 20 min) pour contrôler les répercussions de l'induction de la pathologie et l'effet potentiel des nouvelles molécules thérapeutiques à tester. Une autre imagerie cardiaque sera effectuée en fin de protocole (environ 20 min), puis une chirurgie sera effectuée sous anesthésie et analgésie afin de réaliser des mesures de pression dans le cœur et dans l'artère pulmonaire (environ 20 min). Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours du protocole sur animaux vigiles ou anesthésiés (environ 5 minutes par prélèvement), ou en fin de protocole après les mesures de pression et avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront une substance destinée à provoquer la maladie étudiée. Cette administration est réalisée sous anesthésie générale et peut entraîner une gêne passagère, notamment au niveau respiratoire ainsi qu'une gêne au niveau du site d'injection (démangeaisons, sensation de brûlure). Avec le développement de la maladie, les animaux peuvent présenter une diminution de l’activité, une baisse de l’appétit et de la prise de boisson, pouvant conduire à une perte de poids. Une intervention chirurgicale pourra être réalisée pour implanter un dispositif diffusant le traitement. Cette intervention implique une ouverture de la peau et peut entraîner une douleur ou une gêne temporaire liée à la présence du dispositif. L’administration répétée de médicaments peut générer du stress, car elle nécessite une manipulation et une contention des animaux. Certains effets indésirables liés aux médicaments testés ou aux gestes techniques peuvent survenir, en particulier avec de nouvelles molécules. Des prises de sang et des examens d’imagerie cardiaque seront réalisés sous anesthésie ou avec contention, ce qui peut entraîner un inconfort temporaire, du stress ou une douleur légère. [MODIFICATION: Les tests d'efforts induisent un stress comportemental et physique.]. En fin de protocole, des mesures complémentaires seront effectuées sous anesthésie générale.

Devenir

Afin de caractériser l'effet des traitements testés, notamment l'effet biologique, nous devons faire des mesures qui sont trop invasives pour permettre le réveil de l’animal, et il est indispensable de récupérer le cœur et les poumons en fin d'expérience pour évaluer l’efficacité des traitements

Remplacement

Ce projet vise à évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments dans un organisme vivant. Les tests réalisés sur des cellules ou des tissus isolés ne permettent pas d’étudier les effets globaux du médicament sur le cœur et les poumons. L’utilisation d’un modèle animal est nécessaire pour mieux comprendre ces effets et le comportement du médicament dans le corps.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données précédemment acquises dans notre laboratoire. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, de l'imagerie est utilisée pour permettre de suivre plusieurs paramètres dans le temps sur le même animal.

Raffinement

A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Une grille de score est établie afin de faire un suivi clinique des animaux, avec la mise en place de mesures adaptées en fonction du score et des critères d’arrêt de souffrance. Des enrichissements multiples leur sont proposés en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Lorsqu’une chirurgie avec réveil sera nécessaire, elle sera réalisée en conditions propres (sans microbes) et les animaux auront un suivi post-opératoire intensif pendant au moins 3 jours. Par ailleurs, les animaux seront habitués à la manipulation et à la contention ainsi qu’aux environnements nouveaux afin de réduire le stress. [MODIFICATION: A la suite des tests d'efforts, les animaux seront réhydratés. Les animaux seront habitués au tapis roulant à hauteur de 3 fois maximum par semaine à faible intensité.]

Choix des espèces

Le rat est le modèle animal le plus approprié pour cette étude car la maladie peut y être reproduite de façon fiable et ses effets sur le cœur sont comparables à ceux observés chez les patients. Sa taille permet également de réaliser des prises de sang répétées pour mieux suivre l’action du médicament dans l’organisme. Des rats entre 4 et 8 semaines au moment où ils arrivent en acclimatation dans nos locaux sont utilisés dans ce modèle. L’âge des animaux impactant la sévérité du modèle, ces paramètres seront choisis selon les objectifs de l’étude.

Sous anesthésie générale, le nerf sciatique de 204 rats et 204 lapins, intact ou lésé au préalable par chirurgie, reçoit un fil de microsuture ou une gaine lors d'une opération de 20 à 40 minutes, suivie d'environ deux semaines d'examens quotidiens. Ces 408 rats et lapins sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, puis tous mis à mort pour l'analyse au microscope du nerf et des tissus voisins. Il s'agit d'essais de sécurité et de performance de dispositifs médicaux, commandés par un "donneur d'ordre" en vue d'une autorisation de mise sur le marché. Le résumé déclare des procédures sévères mais ne cite comme effet néfaste que la douleur liée à l'implantation, et il annonce des tests de motricité et de sensibilité sans dire lesquels.

Objectifs

Ce projet vise à développer un modèle animal adéquat pour étudier la tolérance locale (évaluation de la réaction d’un organisme en contact avec un produit étranger) et/ ou la performance de dispositif médicaux destiné à une utilisation en microchirurgie notamment et plus spécifiquement en neurochirurgie pour anastomose des nerfs périphériques après coupure/cassure (fil de microsuture ou nerve wrap (gaine/feuillet qui se met autour de chaque extrémité du nerf) par exemple. L’utilisation clinique de ces types de produit étant le même à savoir l’anastomose en microchirurgie, leur dénomination est regroupée sous le terme « microsuture »).). La neurochirurgie comprend toute chirurgie qui interviendrait au niveau du système nerveux central ou périphérique. L’anastomose des nerfs périphériques est une des neurochirurgies les plus courantes et peut survenir à la suite de nombreux traumatismes (coupures, accident de la route, …). La sécurité biologique sera évaluée par analyses des tissus qui ont été en contact avec les dispositifs médicaux sutures. La performance technique (cohésion du fil tout au long de l’implantation par exemple) ou la performance biologique (le fait que le nerf retrouve sa fonction après une cassure, par exemple) pourront aussi être évaluées. L’ensemble de ces données permettra de réduire les risques de complications lors des phases de tests des produits chez l’humain. Dans le cadre de ce projet, des formations adaptées pourront être menées afin d'assurer et de maintenir les compétences du personnel de l'EU sur les études couvertes par ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir un modèle animal fiable et reproductible pour l’obtention de données de sécurité des microsutures/pansements ou autre dispositif médical utilisés en neurochirurgie. Ainsi avec ce projet, il est possible d’analyser ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché. Ce modèle animal pourra être utilisé en vue de sélectionner un produit parmi un panel de produits en développement (essais de screening), en comparant leurs données de sécurité. Ces essais de screening sont essentiels dans la stratégie de réduction du nombre total d’animaux utilisés, en poussant seulement le développement des produits les plus intéressants et en écartant rapidement des recherches les produits ne présentant pas les qualités de sécurité satisfaisantes. Par la suite des essais de screening, ce modèle animal permet aussi de mener des essais de confirmation de sécurité / performance d’un produit en développement, en le comparant à un autre produit déjà commercialisé, afin de s’assurer qu’il présente un bénéfice au moins égal ou supérieur.

Procédures

L’ensemble des animaux sera opéré sous anesthésie générale et traitement analgésique pour placer le dispositif médical autour du nerf sciatique (intact ou lésé chirurgicalement). Cette intervention chirurgicale aura une durée d’environ 20 à 40 minutes. Les animaux seront ensuite examinés quotidiennement pendant la phase post-opératoire (environ 14 jours) pour pouvoir apprécier la bonne guérison du site chirurgical et évaluer les signes de douleur, les effets sensoriels et sur la motricité. Enfin, pour évaluer l’efficacité et l’absence d’effet indésirable, des prises de sang pourront être réalisées sur les animaux en cours d’étude. Celles-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). Ils seront finalement mis à mort pour permettre l’observation et l’analyse microscopique des tissus de la zone d’implantation (nerf et tissus environnants).

Impact sur les animaux

A l’instar des effets secondaires possibles chez l’humain lors de microsutures, les effets indésirables connus pouvant survenir chez l’animal sont : - douleur et stress liés à l’implantation du fil de microsuture auour du nerf sciatique, controlée par la prise d’analgésique (morphonique) et par la réalisation d’une anesthésie générale.

Devenir

Afin de s’assurer de la sécurité des dispositifs médicaux une observation des tissus environnant la zone d’implantation est nécessaire. Ceci permet d’évaluer la tolérance locale de ces produits, ce qui est l’objectif des études réalisées dans ce projet. Des prélèvements de tout ou partie de certains organes peuvent éventuellement être nécessaires, en particulier en cas d’anomalie constatée, pour évaluer les effets tissulaires à l’échelle microscopique. L’ensemble de ces éléments explique l’impossibilité en fin d’étude de maintenir en vie les animaux utilisés.

Remplacement

Les essais in vivo de sutures/nerve wrap de microchirurgie sont nécessaires car les interactions complexes s’établissant entre le dispositif médical et le système nerveux périphérique ne peuvent être recréées ex vivo. Il n’existe donc pas de méthodes alternatives pour prouver l’efficacité des sutures/ nerve wrap de microchirurgie. Des mesures ex vivo (tests de sutures/ nerve wrap sur/autour d’un nerf du système nerveux périphérique d’un animal euthanasié) peuvent être réalisées en amont des études in vivo, et permettent d’estimer les meilleures conditions pour disposer le fil de microsuture / nerve wrap. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de fournir l’ensemble des réponses nécessaires à l’évaluation de la sécurité des produits de sutures de microchirurgie en vue de leur utilisation chez l’humain. Les études in vivo sont donc nécessaires pour répondre aux exigences réglementaires et de qualité dans le but de mettre sur le marché les produits de sutures/ nerve wrap de microchirurgie.

Réduction

Le donneur d’ordre demandant la réalisation de ces tests s’engage à ne pas faire renouveler à l’identique un essai déjà mené précédemment. De plus, l’interprétation des résultats nécessite toujours de comparer ceux obtenus chez des animaux qui reçoivent le produit évalué avec ceux obtenus d’animaux qui reçoivent un produit « contrôle », dont l’effet attendu est déjà connu. Pour réduire encore le nombre d’animaux inclus en étude, il est possible d’utiliser un même groupe « contrôle » pour plusieurs groupes « test » recevant des produits à tester différents. Enfin, nous avons déjà mentionné la possibilité de réaliser des études pour sélectionner parmi un panel de produits celui qui présente le plus d’intérêt à être développé, réduisant ainsi le nombre de tests réalisés sur des produits ayant un intérêt moindre. Par ailleurs, si l’effet attendu d’un produit est trop incertain, il est possible de réaliser une étude dite « pilote » sur quelques animaux seulement. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit, avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc). Le nombre d'animaux étant réglementé par les normes, aucune approche statistique ne sera réalisée.

Raffinement

-La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). En phase postopératoire immédiate, les suivis quotidiens sont renforcés pour détecter précocement tout signe clinique ou de douleur. En cas de signes de douleur, un traitement analgésique supplémentaire est administré. Des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (surveillance ou réfection des pansements (si applicable), désinfection des sites chirurgicaux …). - Point limites stricts et spécifiques du projet : Les animaux seront suivis quotidiennement à l'aide d’une grille de suivi du bien-être animal portant spécifiquement sur l'apparition de lésion auto-induite et un suivi de la locomotion et des signes de douleurs.

Choix des espèces

Le lapin est un modèle de plus en plus utilisé pour réaliser des expériences sur les nerfs périphériques alors que le rat reste le premier modèle qui avait été développé faisant de ces deux modèles, des modèles de choix en termes de disponibilité de la littérature. Le choix entre les deux espèces, sera surtout en fonction de la taille du nerf ciblé ou en fonction de la taille du dispositif. En effet la taille du nerf sciatique chez le lapin (le plus cité dans la littérature) est équivalente aux nerfs que l’on peut retrouver au niveau du poignet ou des mains chez l’Homme (diamètre compris entre 2 et 4 mm, longueur inférieure à 30mm). Le rat par ailleurs est une espèce chez laquelle différents tests et scoring de motricité et de sensorialité ont été établis dans la littérature, permettant un suivi précis des animaux opérée. L’utilisation d’animaux adultes d’un poids minimum de 2,5 kg pour les lapins ou d’environ 300g pour les rats lors de la chirurgie est recommandée, afin de limiter les risques liés à l’anesthésie et de permettre la mise en oeuvre des techniques chirurgicales et post-opératoires adéquates.

Une sonde de température est d'abord implantée sous anesthésie chez 414 souris, puis on leur provoque un sepsis par ligature et perforation de l'appendice, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Suivent jusqu'à trois échocardiographies, une mesure de la perméabilité des vaisseaux, une mesure de la force musculaire et jusqu'à quatre tests d'agrippement sur souris éveillée, alors que le sepsis peut entraîner perte de poids, comportement anormal et mort. Le protocole joue sur la température ambiante, 22 °C correspondant selon le porteur à la température d'hébergement standard des souris, et 30 °C à leur température "idéale d'hébergement". À la fin, toutes sont tuées pour prélever leurs organes.

Objectifs

Le sepsis est une réaction excessive et incontrôlée du système immunitaire face à une infection. Au lieu de simplement combattre les microbes, l’organisme déclenche une inflammation généralisée qui peut endommager plusieurs organes, comme le cœur, les muscles ou les vaisseaux sanguins. Cette maladie reste très grave : elle est responsable d’un grand nombre de décès en réanimation, surtout lorsqu’elle évolue vers un choc septique. Même lorsque les patients survivent, beaucoup gardent des séquelles durables. En particulier, les muscles peuvent s’affaiblir rapidement pendant l’hospitalisation, entraînant une perte de force et parfois un handicap physique persistant. Les chercheurs cherchent encore à comprendre pourquoi certains patients développent des formes plus sévères que d’autres. La température corporelle pourrait jouer un rôle important. Certaines personnes font de la fièvre, tandis que d’autres deviennent au contraire en hypothermie, et cette hypothermie est souvent associé à un moins bon pronostic. La température pourrait influencer la manière dont le corps réagit à l’infection, mais aussi les conséquences sur les muscles et le cœur. Or, des études récentes chez la souris montrent que la température de l’environnement modifie fortement la réponse de souris au sepsis. Ainsi, dans un environnement plus frais à 22°C (correspondant à la température d'hébergement standard des souris), les souris ont tendance à devenir hypothermes en réponse au sepsis, alors qu’à une température plus chaude à 30°C (correspondant à la température idéale d'hébergement des souris), elles développent davantage de la fièvre. Notre projet vise à mieux comprendre comment la température ambiante influence l’évolution du sepsis et quelles sont les conséquences à court et à long terme sur le coeur et les muscles. L’objectif final est d’identifier de nouvelles pistes pour améliorer la prise en charge des patients atteints de sepsis et limiter les complications à long terme.

Bénéfices attendus

L’objectif final de ce projet est d’identifier de nouvelles pistes pour améliorer la prise en charge des patients atteints de sepsis et limiter les complications cardiaques et musculaires à court ou long terme.

Procédures

Les procédures invasives sur animal anesthésié sont au nombre de 7 : 1. Implantation d’une sonde de température (1 fois, durée : 5 min) 2. Modèle de sepsis (1 fois, durée : 10 min) 3. Échocardiographie (3 fois max, durée : 10 min) 4. Mesure de la perméabilité vasculaire (1 fois, durée : 2 min) 5. Mesure de la force musculaire (1 fois, durée : 30min) 6. Prélèvement de sang rétro-orbitaire (1 fois max, durée : 2 min) 7. Prélèvement de sang au terme de l'étude (1 fois, durée : 2 min). La seule procédure non invasive sur animal vigile est le test d'agrippement (4 fois max, durée : 5 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont principalement du stress lié à la contention et aux manipulations sur animal vigile. Les effets indésirables sont ceux liés au modèle chrirugical de sepsis qui peut être associé à une perte de poids, une altération de leur apparence physique, un comportement anormal, un changement de température corporelle et une mortalité.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort. Leurs organes seront prélevés afin de réaliser des analyses sanguines, histologiques et/ou moléculaires nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude.

Remplacement

Afin de tester l’impact direct de la température extérieure sur le devenir des cellules souche isolées de muscles périphériques, des expériences de culture cellulaire seront menées indépendamment en incubant les cellules en présence de sérum de sujets septiques (humains ou souris) pour mimer les variations températures retrouvées in vivo lors du choc septique. Néanmoins, pour répondre à notre question biologique, le remplacement total par de la culture cellulaire n’est pas possible. En effet, les modèles in vitro ne rendent pas compte de l’immense complexité du fonctionnement d’un muscle entier. L'utilisation d'un modèle animal mimant le sepsis reste essentielle pour étudier les différences d'atteinte musculaires observés après un choc sepsis en lien avec la température extérieure. Dans cette étude, nous avons choisi un modèle de sepsis par ligation et perforation de l'appendice afin de nous rapprocher au plus près d’une des causes principales de sepsis chez l’Homme, à savoir l'infection abominale. Par ailleurs, la souris est un modèle de choix en recherche médicale car son organisme fonctionne de manière proche de celui de l’être humain, notamment pour les muscles.

Réduction

Nous allons réduire le nombre d'animaux par l'utilisation des méthodes non invasives (échocardiographie, sonde de température et d’activité en sous-cutanée, test d’agrippement) permettant de répéter les analyses sur le même animal au cours de la maladie, mais aussi grâce à l'utilisation de tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux importés pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. Pour les modèles chirurgicaux, les souris seront anesthésiées et des injections d’antidouleurs seront faites en pré- et post-opératoire afin de limiter la douleur. Les animaux seront examinés de façon biquotidienne pendant les 7 premièrs jours après la chirurgie afin de vérifier leur état général de santé. Tout au long de l’étude, nous suivrons la grille d’évaluation proposée tenant compte des changements du poids, de perturbation de l'apparence physique et du comportement et de température corporelle. Tout animal auquel aura été attribué un score élevé à cette évaluation recevra des analgésiques. Tout animal auquel aura été attribué un score trop élevé sera immédiatement mis à mort. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers), une balançoire et une plateforme ainsi qu’un accès continu à la nourriture et à l’eau de boisson.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée en recherche médicale car son organisme fonctionne de manière proche de celui de l’être humain, notamment pour les muscles. Le modèle expérimental utilisé dans cette étude reproduit plusieurs complications observées chez les patients atteints de sepsis, comme les troubles cardiaques précoces et la faiblesse musculaire qui peut apparaître plus tard. Un autre avantage important est la possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées. Certaines de ces souris produisent des protéines fluorescentes dans des cellules particulières du muscle comme les souches souches du muscle qui jouent un rôle essentiel dans la réparation musculaire. Grâce à cette fluorescence, les chercheurs peuvent facilement suivre ces cellules, les observer dans les tissus et analyser leur fonctionnement. Enfin, l’équipe de recherche dispose des techniques nécessaires pour étudier de manière détaillée le fonctionnement du cœur, des muscles et des cellules musculaires, aussi bien chez l’animal vivant qu’en laboratoire sur des tissus ou des cellules isolées.