Mammifères "de rente"

Neuf porcs seront tués en pleine phase aiguë de la maladie d'Aujeszky pour constituer un stock d'organes infectés utile au laboratoire. 21 porcs de 13 semaines vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Inoculés par voie oro-nasale, ils subissent trois fois par semaine deux écouvillonnages nasaux, deux écouvillonnages oro-pharyngés, un brossage des amygdales et une ponction de 13 ml de sang, auxquels s'ajoutent chaque jour ouvré un recueil de salive et un essuyage du groin, avec une fièvre pouvant durer plus d'une semaine, de l'anorexie et de la prostration. Une friandise au sirop de grenadine leur est distribuée après chaque acte. L'effectif de neuf animaux consacré à la collecte d'organes se fonde sur une estimation des "besoins" du laboratoire pour ses dix prochaines années.

Objectifs

La maladie d’Aujeszky (MA) est une maladie virale touchant les porcs et les sangliers. Elle se caractérise par des troubles nerveux entrainant la mort chez les jeunes et des signes respiratoires et des troubles de la reproduction chez les adultes. De nombreux pays d’Europe ou d’Amérique sont indemnes de MA en élevages de porcs mais le virus est présent dans les populations de sangliers de plusieurs pays ce qui constitue une menace constante pour les porcs domestiques. Par ailleurs, la MA est toujours présente en Europe de l’Est et en Asie. Les protocoles d’échantillonnages à réaliser en cas de doute clinique de MA sont fondés sur des études et méthodes relativement anciennes. Depuis ces vingt dernières années, les méthodes de diagnostic ont évolué de même que les outils disponibles pour la collecte d’échantillons (nouveaux matériaux pour les écouvillons, collecte de fluide oral…). Il est donc nécessaire de mettre à jour les données concernant la détection du virus dans les différents types d’échantillons disponibles en utilisant les méthodes de diagnostic actuelles pour aider à la mise en place des plans d’urgence dans les pays touchés par la MA. Dans l’objectif d’acquérir de nouvelles données, le projet expérimental proposé ici aura pour objectifs de 1) comparer les performances de diagnostic de différentes méthodes de prélèvements (écouvillonnage nasal, écouvillonnage oropharyngé, brossage d’amygdales), de 2) tester des approches alternatives de prélèvements pour le diagnostic (fluide oral, lingette nasale, prélèvement d’air), de 3) collecter des tissus positifs vis-à-vis de la MA utiles pour les activités du laboratoire, et enfin d’ 4) acquérir des données sur une souche isolée récemment et qui est représentative des souches circulant chez le sanglier.

Bénéfices attendus

La comparaison des performances de diagnostic en fonction des différents prélèvements génèrera des données utiles aux autorités qui mettent en place une surveillance clinique de cette maladie dans leurs pays. En outre, les tissus positifs collectés au cours de ce protocole seront utilisés pour les activités du laboratoire. Ils pourront notamment être utilisés pour organiser des essais inter-laboratoires permettant de vérifier l’aptitude des laboratoires à réaliser un diagnostic de la maladie à partir d’organes.

Procédures

Tous les actes prévus sur les animaux se feront sur animaux vigiles. Selon les groupes, les animaux recevront 5ml par voie oro-nasale de virus de la maladie d’Aujeszky (2 souches différentes seront utilisées) ou de milieu de culture (lot contrôle). L’inoculation oronasale prend moins d’1 minute. La moitié des animaux inoculés avec du virus sera mise à mort lors de la phase aigüe de la maladie afin de collecter des organes positifs alors que tous les autres animaux (infectés et témoins) seront suivis pendant 3 semaines post-infection. Tout au long de la procédure expérimentale, les animaux infectés par le virus de la MA seront soumis 3 fois par semaine aux prélèvements suivants : 2 écouvillons nasaux, 2 écouvillons oro-pharyngés, 1 brossage amygdalien et 1 ponction sanguine (total de 13ml). De plus, tous les jours du lundi au vendredi, du fluide oral individuel sera collecté (1ml de salive) ainsi qu’une lingette nasale (gaze de 4cm x 4cm utilisée pour essuyer le groin de l’animal). Un prélèvement d’air quotidien sera effectué à l’échelle de la salle. La cadence de prélèvements du lot contrôle sera plus faible que celle prévue pour les lots infectés, l’objectif étant de s’assurer de la conservation de leur statut négatif et de la spécificité des techniques sans générer un nombre excessif de prélèvements. Ainsi ce lot sera prélevé 1 fois par semaine (mêmes prélèvements que ceux indiqués ci-dessus). Tous ces actes sont réalisés par un personnel très expérimenté et sont effectués le plus rapidement possible (environ 1 minute 30). A l’issu de ces actes, les animaux sont récompensés par la distribution d’une friandise type sirop de grenadine.

Impact sur les animaux

Les signes cliniques induits par une infection des porcs par le virus de la maladie d’Aujeszky sont dépendants de l’âge des animaux et de la souche utilisée. Si l’infection de jeunes animaux provoque des signes neurologiques et une forte mortalité, l’infection de porcs de plus de 3 mois se limite généralement à une forte fièvre, une baisse d’appétit et des troubles respiratoires. Compte tenu de l’âge des animaux (13 semaines) et des souches qui seront utilisées dans ce projet, aucune symptomatologie sévère n’est attendue. Les signes cliniques attendus sont : de la fièvre pouvant durer plus d’une semaine, de l’anorexie, de la prostration, des problèmes respiratoires, de la toux et des éternuements. Un soin particulier sera apporté au suivi clinique quotidien de chaque porc. Un suivi rapproché sera mis en œuvre dès que l’évolution de l’état de santé d’un animal le nécessitera. L’animal concerné sera observé le matin, en début d’après-midi et en fin de journée (y compris le week-end) afin d’évaluer l’évolution de son état de santé et de procéder à sa mise à mort en cas d’atteinte de l’un des points limites.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour pouvoir récolter des prélèvements d’organes et, pour certains d’entre eux, de gros volumes de sang.

Remplacement

Pour répondre aux objectifs de ce projet, il n’y a aucune possibilité de remplacement du modèle animal par une étude in vitro ou in silico.

Réduction

Pour répondre aux objectifs 1 et 2 de l’étude, il est nécessaire d’avoir 6 porcs infectés avec une souche de référence et qui seront suivis jusqu’à la fin de la procédure de façon à avoir des données statistiques fiables. Le nombre de 3 porcs témoins est l’effectif minimal pour permettre de s’assurer de la conservation de leur statut négatif et de la spécificité des techniques de prélèvement. Enfin, le nombre de 3 porcs infectés avec la souche nouvellement isolée est l’effectif minimal pour obtenir des données préliminaires relatives à cette souche, qui seront comparées aux données des 6 animaux précédemment mentionnés (objectif 4). L’effectif de 9 animaux pour la collecte d’organes (objectif 3) se base sur une estimation des besoins du laboratoire pour ses activités des dix prochaines années. Il n’est pas possible d’attendre la fin de la procédure et d’utiliser les 12 porcs mentionnés ci-dessus (pour les objectifs 1, 2 et 4) puiqu’à ce stade de l’infection, le virus de la MA ne sera plus présent dans la plupart des organes. Il est donc nécessaire de collecter ces organes lors de la phase aigüe de la maladie pour avoir des organes positifs.

Raffinement

L’expérimentation sera conduite dans le respect de l’éthique et du bien-être des animaux. Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de la durée du projet. Ils seront répartis dans 4 animaleries contenant chacune un à deux parcs. Du début à la fin de la procédure, chaque parc accueillera 3 animaux. Les porcs seront alimentés et abreuvés à volonté. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Ils auront accès à des jouets type "mordille", "tourniquet", etc. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine leur sera distribuée. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal pendant toute la durée de la procédure expérimentale. En cas d’atteinte d’un des points limites, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du virus de la maladie d’Aujeszky. Il est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de cette procédure. Les porcs seront sevrés à 4 semaines d’âge. Ils seront inoculés à 13 semaines d’âge (phase d’engraissement). Cet âge a été choisi pour que les animaux survivent à l’infection et ainsi permettre de suivre l’excrétion virale pendant 3 semaines post-inoculation.

Jusqu'à trente-six prélèvements de sang par an, à 1 % du poids vif à chaque fois, et deux à cinq injections annuelles d'antigène en émulsion avec un adjuvant huileux : 15 chèvres vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous les gestes sont pratiqués sur animal vigile, dès le jour de la naissance pour les dix-sept premières injections, et l'adjuvant provoque des inflammations locales douloureuses que le porteur dit suivre quotidiennement. Il indique que les chèvres sont ensuite gardées jusqu'à la fin de leur vie, la réinjection des globules rouges permettant de prolonger les prélèvements sur les mêmes animaux et d'en utiliser moins. Leur plasma alimente la fabrication de kits de dépistage de la toxoplasmose, de la rubéole et des hépatites A et B, une production de routine que le porteur déclare non reproductible in vitro.

Objectifs

L’objectif du projet est de produire des anticorps polyclonaux anti-immunoglobulines (Ig) humaines issus de caprins dans le but de fabriquer des kits de diagnostic in vitro pour la détection d’anticorps et le diagnostic de maladies en santé humaine. Il s’agit des tests de dépistage de la Toxoplasmose, la Rubéole, l’Hépatite A et l’Hépatite B. C’est une technique immuno-enzymatique où ces anticorps anti-Ig humaines servent à capturer les anticorps dans le sang des patients.

Bénéfices attendus

Les anticorps obtenus sont utilisés pour la fabrication de kits immuno-enzymatique permettant la détection d’anticorps et le diagnostic de maladies, en santé humaine : la Toxoplasmose, la Rubéole, l’Hépatite A et l’Hépatite B. La toxoplasmose est généralement bénigne ou asymptomatique chez les sujets immunocompétents, mais peut avoir des conséquences graves si elle se produit chez des sujets immunodéficients ou des fœtus. L’infection par le virus de la rubéole, chez les enfants comme chez les adultes, est bénigne et de courte durée. Elle peut cependant avoir des conséquences très sévères pour le fœtus si elle est contractée par une femme enceinte, surtout si l’infection survient pendant les trois premiers mois de grossesse. L’ infection par le virus de l’hépatite B est un problème majeur de santé publique. Le bénéfice est donc de produire les anticorps nécessaires à la confection de ces kits et ainsi tester un maximum de patients, afin de mettre en place un traitement médicamenteux, suffisamment prédictif, en cas de résultats positifs, pour éviter à ces patients de développer des symptômes graves de la maladie. Il n’existe pas de méthode in-vitro connue à ce jour pour obtenir des anticorps polyclonaux anti-immunoglobulines humaines ayant la spécificité et l’affinité requises.

Procédures

Tous les gestes sont réalisées sur animal vigile. De la naissance à 2 mois : 17 injections (10 secondes par injection) A l’âge adulte : 2 à 5 injections par an (1 minute 30 par injection). Prélèvement de sang pour contrôle du titre : 15 secondes 4 fois par an. Prélèvement de sang (1% du poids vif maximum) pour la production des plasmas : 10 minutes par prélèvement à raison de maximum de 36 prélèvements par an. Ré-injection des globules rouges (technique de plasmaphérèse) : 15 minutes par ré-injection en rapport avec le nombre de prélèvement de sang

Impact sur les animaux

Les injections d’antigène aux cabris durant les 2 premiers mois de vie peuvent entrainer des douleurs au moment de l’injection (piqûre). A l’âge adulte, les injections de l’émulsion de l’antigène avec de l’adjuvant huileux, créent une douleur, car cet adjuvant peut entrainer des inflammations locales au point d’injection. Ces inflammations, sont suivies quotidiennement et traitées si besoin par un protocole de traitement adapté.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux sont gardés jusqu’à la fin de leur vie.

Remplacement

Ces kits de diagnostics utilisent des anticorps polyclonaux anti-immunoglobulines (Ig) humaines ayant une forte spécificité et une forte affinité qui ne sont pas reproductible en vitro. Le fait de rendre le cabri tolérant à l’antigène dès son plus jeune âge n’est pas reproductible in-vitro. Dans l’état actuel des connaissances scientifiques, cette méthode de production d’anticorps n’est pas reproductible in-vitro à ce jour.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est fonction des besoins de production et est optimisé au plus juste. Les animaux sont prélevés avec la technique de plasmaphérèse qui consiste à prélever le sang total et à séparer les globules rouges pour les ré-injecter à l’animal. Ainsi cette technique permet de prolonger la durée des prélèvements sur le même animal en réduisant le nombre d’animaux. Aucune étude statistique n’est prévue.

Raffinement

Les animaux sont élevés en groupes constitués et stables permettant aux animaux une vie hiérarchique et sociale avec la possibilité de se percher. Ils sont hébergés sur une aire paillée avec un accès à la nourriture (foin) et à l’eau constante. Un concentré leur est apporté quotidiennement et fractionné. Un suivi quotidien est réalisé par un personnel qualifié, avec une surveillance intensifiée, dans des conditions conformes à la réglementation et assurant leur bien-être. L'observation de signes cliniques déclenche des soins spécifiques sur les conseils d'un vétérinaire (protocole de soins spécifique) qui assure par ailleurs un suivi régulier. De plus la réinjection systématique des globules rouge par la technique de plasmaphérèse permet de maintenir l’animal sur un plus long terme, sans atteindre les points limites.

Choix des espèces

L’espèce caprine a été choisie car c’est un modèle répondant correctement à ce type d’antigènes. La chèvre est un animal docile et patient permettant, d’obtenir un volume important de plasma hyper-immun avec un faible nombre d’animaux. Les animaux sont sélectionnés à la naissance, puisqu’ils doivent être injectés le jour de leur naissance.

Valider une voie d'administration en vue d'un dossier d'essai clinique, telle est la finalité affichée de ce projet, pour lequel 20 cochons de trois mois vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit quatre à cinq prises de sang sous sédation, une injection intramusculaire hebdomadaire d'immunorégulateur, des comprimés quotidiens et une à deux urétéroscopies sous anesthésie générale de une heure trente à deux heures. Après trois à quatre semaines, une dernière anesthésie sert à ouvrir l'animal, prélever ses organes et le tuer. Le porteur présente le porc comme la seule espèce possible et l'urétéroscopie comme une voie non invasive, voie que des chirurgiens viennent aussi apprendre sur des porcs.

Objectifs

--- La cystinurie est une maladie rénale qui aboutit à l’insuffisance rénale suivies de dialyse/transplantation. Bien que l'incidence de la cystinurie soit faible (≈1/7000), les calculs de cystine sont très récurrents et entraînent une morbidité importante : interventions chirurgicales fréquentes et lésions rénales dans près de 80% des cas. La précipitation de cystine est la seule manifestation de cette maladie rare, qui se traite par des mesures diététiques visant à obtenir des urines non sursaturées en cystine. Une information du patient et un suivi diététique pour réduire les aliments riches en méthionine, à boire >3L/j. Malheureusement, malgré un régime diététique efficace, plus de 85% des patients récidivent. Il existe des traitements médicamenteux qui visent à modifier la cystine urinaire pour la rendre incapable de former des cristaux mais, ces médicaments sont associés à des effets secondaires. --- Dans le contexte du développement thérapeutique de maladies rares, et notamment rénales, nous avons identifié un vecteur viral de thérapie génique qui permet le transfert de gène dans les parties malades du rein grâce à une injection dans les voies urinaires, en direction des reins. Dans le cadre d’une preuve de concept, le mode opératoire pour une telle administration a été réalisé chirurgicalement. Nous souhaitons dès lors, nous pencher sur des indications thérapeutiques et commencer par explorer l’usage atraumatique de la voie endourologique, c’est-à-dire en passant par les voies naturelles. Ceci est rendu possible par l’utilisation d’un urétéroscope flexible (endoscope souple, fin, équipé d’une microcaméra et d’instruments à son extrêmité) ammené jusqu’au centre des reins pour délivrer le vecteur de thérapie génique. Cette méthode est cliniquement pertinente et peut-être réalisée en ambulatoire – couramment utilisée en clinique pour détruire des calculs ou retirer des tumeurs rénales. Cette validation préclinique est indispensable pour la constitution à terme d’un dossier d’essai clinique de thérapie génique et nécessitera donc l’utilisation du modèle porc étant donné la similitude anatomique des voies urinaires avec l’Homme. En conclusion, notre projet repose sur l’usage du porc pour la validation du protocole d’administration en vue de la constitution d’un dossier d’essai clinique de thérapie génique dans une indication en néphrologie. --- Modification: une extension de la durée du projet a été demandée pour terminer l'étude en cours.

Bénéfices attendus

****Opportunités thérapeutiques : La confirmation que l’emploi d’un urétéroscope flexible permet d’atteindre ces résultats ouvrirait de multiples opportunités pour traiter un ensemble important de maladies rénales originaires du néphron, tels que la cystinurie ou encore la polykystose rénale. ****Sécurité thérapeutique : éviter les effets secondaires : La validation de la méthode d’administration par urétéroscope permet de concentrer le vecteur de thérapie génique dans l’organe cible (ici les reins) limitant ainsi la circulation sanguine et les effets secondaires comme ont pu en être observés dans le cas de thérapies géniques contre la myoptahie de Duchenne par exemple. ****Mode d’administration raffiné : une fois validée l’administration par les voies naturelles offrira aux patients un traitement rapide, non invasif, précis et ne nécessitant pas d’hospitalisation.

Procédures

Sur la durée du projet, les animaux subiront les interventions suivantes : -4 à 5 prises de sang (selon les groupes d’animaux) sous sédation ce qui représente une injection intramusculaire du sédatif d’une durée de moins d’une minute. La prise de sang dure environ 2 minutes. La sédation complète dure environ une demi-heure. -Un traitement immunorégulateur (pour éviter le rejet de la thérapie génique) qui se présentera sous la forme d’une injection intramusculaire par semaine (durée moins d’une minute) et de la prise de comprimés quotidienne qui seront mélangés à un aliment ou une boisson appétente. -1 à 2 procédures d’administration de vecteur de thérapie génique (selon les groupes d’animaux) qui se déroulent sous anesthésie générale. L’anesthésie inclut une injection intramusculaire pour la sédation (durée de moins d’une minute). L’animal est ensuite inconscient pour le reste de la procédure. La procédure totale sous anesthésie dure entre 1h30 et 2h, selon qu’un seul rein ou deux sont traités. -A la fin du projet (au bout de 3 à semaines selon les groupes) : les animaux feront l’objet d’une dernière anesthésie générale (injection intramusculaire de moins d’une minute), la suite de la procédure se déroule sous anesthésie générale. Au cours de celle-ci une chirurgie sera réalisée afin de réaliser des prélèvements d’organes. L’animal sera ensuite mis à mort, toujours lors de cette anesthésie générale.

Impact sur les animaux

La plupart des actes se dérouleront sous sédation ou sous anesthésie générale. Ainsi, les cochons vont recevoir une injection de sédatif en intramusculaire. Nous prenons nos dispositions pour que l’injection soit la moins stressante, la moins douloureuse et la plus courte possible. Lorsqu’une anesthésie est prévue, sous sédation, un cathéter intraveineux sera posé sur une veine de l’oreille, l’animal étant profondément sédaté, il n’y a que peu de réaction à cet acte qui dure environ une minute. La suite de la procédure se déroule sous anesthésie générale maintenue par un respirateur fiable permettant de nous assurer de l’absence de toute souffrance. Pour les injections intramusculaires du traitement immunomodulateur, là aussi, nous prenons nos dispositions pour que l’injection soit la moins stressante, la moins douloureuse et la plus courte possible. La prise de comprimés ne présente pas de contrainte pour les animaux grâce au mélange dans un aliment ou une boisson appétente.

Devenir

L’ensemble des animaux est mis à mort en fin de projet car une autopsie doit être réalisée afin d’étudier l’effet de la thérapie génique sur les reins post mortem.

Remplacement

Compte tenu que le but du projet est de démontrer l’emploi d’un urétéroscope flexible pour délivrer un vecteur viral de thérapie génique par les voies naturelles, il ne peut y avoir d’alternative à l’usage d’un modèle animal. Après administration intra-rénale du vecteur de thérapie génique, il sera nécessaire de maintenir l’animal en vie afin de pouvoir évaluer le niveau et la distribution de l’expression du gène transféré. Ainsi, nous ne pourrions substituer l’utilisation d’un animal vivant.

Réduction

****Stratégie de réduction: Ce projet se découpe en une Phase pilote incluant 6 porcs suivie d’une Phase de Consolidation incluant 14 porcs. La Phase Pilote aura la particularité d’injecter les 2 reins d’un même animal permettant ainsi de diviser le nombre d’animaux par 2. En fonction des résulats obtenus à l’issue de la Phase Pilote, la Phase de Consolidation n’injectera qu’un seul rein sur les deux afin de disposer d’un rein contrôle non exposé au vecteur de thérapie génique. Cependant, compte tenu qu’au cours de la Phase Pilote, les injections seront restreintes soit à la partie supérieure soit inférieure du rein, il est possible que le pôle rénal non directement exposé puisse servir de tissu contrôl interne. Auquel cas, là également, nous pourrons exploiter les 2 reins chez un même animal et ainsi diviser le nombre total d’animaux par 2. Il faudra donc attendre l’issue de la Phase Pilote avant de pouvoir décider la meilleure option pour promouvoir la Réduction du nombre d’animaux. ****Statistiques: cette étude ne prévoit pas d'analyse statistique des résultats. Il s'agit d'une étude qualitative qui est destinée à tester quelques paramètres d’injection car nous sommes en mode exploratoire. Une fois nous aurons identifiés les paramètres et conditions clés, une seconde session incluera des ‘n’ plus conséquent pour confirmer et valider les conditions optimales d’injection.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les porcs sont réceptionnés au sein de l’animalerie où ils sont acclimatés et hébergés en groupe sociaux dans de larges box enrichis de jeux à mâcher et de balles, avec des conditions d’ambiances contrôlées. Ils sont douchés quotidiennement à l’eau tiède et un programme de familiarisation basé sur la distribution de récompenses facilite les interactions avec les soigneurs et réduit leur stress lors des manipulations. Un programme musical apaisant est diffusé pour couvrir les bruits d’ambiance aversifs. Conditions expérimentales : L’urétéroscopie par les voies naturelles est justement choisie comme méthode d’administration des vecteurs de thérapie génique car cette voie n’est pas invasive. En effet, en clinique humaine, l’urétéroscopie ne nécessite pas de prise en charge particulière après l’examen. De plus, cet examen mobilisera l’intervention d’un urologue spécialisé dans cette pratique chez des patients humains mais également lors d’enseignements sur des porcs pour former des chirurgiens à cette abord chirugical non-invasive. Les animaux sont anesthésiés et recevront des analgésiques pour toutes les procédures et ils font l’objet d’un suivi au réveil afin de s’assurer qu’ils ont bien récupéré de leur anesthésie. Nous travaillerons de manière aseptique (matériel stérile, à usage unique ou stérilisable, champs stériles, tenue stérile de l'opérateur et du chirurgien, désinfection cutanée et des muqueuses) afin de pouvoir éviter les risques infectieux et garder en vie pendant 3 à 4 semaines l’animal injecté sans que sa fonction rénale et son état général n’en soit affectés. L'usage d'une antibiothérapie de couverture en peropératoire et posopératoire immédiat permettra également d'éviter les risques infectieux. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance.

Choix des espèces

Afin que l’étude que nous proposons ait une pertinence forte pour ensuite déposer un dossier de demande d’essai clinique aux agences réglementaires ad hoc, l’espèce animale doit permettre d’évaluer précisément la procédure d’administration du traitement avec un équipement identique et un protocol adapté à celui déjà utilisé chez les patients humains. Il faut également que l’anatomie de l’espèce animale et de l’organe ciblé soient similaires à l’homme. Le porc est donc la seule espèce qui nous permettra une validation préclinique de la procédure d’injection. Des porcs de 3 mois environ (soit 40-50 kg) seront utilisés. A ce stade de développement, le système urinaire du porc est très proche de celui de l’humain tant du point de vue anatomique que du point de vue de sa taille, permettant ainsi de se positionner dans les mêmes conditions que celles de la thérapie chez l’Homme.

Ce sont des brebis gestantes au dernier tiers de leur gestation qui sont opérées, à 125 jours pour un terme de 145, parce que la cible réelle de l'étude est leur fœtus. 212 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque brebis subit une chirurgie d'environ quatre heures sous anesthésie générale, puis une anesthésie loco-régionale destinée uniquement à prélever le sang du fœtus, à raison de huit prélèvements par journée de manipulation. Une même brebis sert à plusieurs expérimentations, ce que le porteur décrit comme une façon d'"optimiser au maximum l'utilisation de l'animal". À la fin du projet, il annonce la mise à mort d'environ 60 brebis gestantes et de leurs fœtus, et une vingtaine de brebis en adoption possible, celles qui auront perdu leur fœtus ou mis bas prématurément.

Objectifs

La majorité des patientes en salle de naissance bénéficie d’une analgésie devant les douleurs entraînées par les contractions utérines lors du travail. Leur mise en place peut provoquer une instabilité de la fréquence cardiaque et de la tension artérielle maternelle transitoire lors de l’injection des médicaments, et entraîner des anomalies du rythme cardiaque fœtal. L’impact d'une césarienne ou d'une anesthésie générale ou d'une péridurale maternelle sur l’hémodynamique fœtale et le retentissement sur le système nerveux autonome reste peu connu, et sa compréhension est nécessaire afin de diminuer la morbi-mortalité fœtale.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à observer une modification des paramètres fœtaux sanguins et cardiaques plus importante en cas d’analgésie type césarienne par rapport aux autres analgésies. L’impact serait en pratique clinique d’adapter l’analgésie maternelle pour diminuer le risque d’hypoxie foetale et ses complications (lésions cérébrales anoxo-ischémiques). Cette étude permettra également de déterminer l’effet sur le coeur et la tension artérielle des sédations foetales lors d’une réanimation à cordon intact afin d’optimiser la prise en charge des nouveaux-nés vulnérables.

Procédures

Chaque brebis sera soumise à une chirurgie sous anesthésie générale d'une durée d'environ 4 heures, une seconde anesthésie cette fois loco régionale sera réalisée sans objectif d' incision mais uniquement pour les prélèvements sanguins chez le foetus, ces prélèvements serviront pour la vérification des gaz du sang (valeur de pH, quantité d’oxygène et de dioxyde de carbone dans le sang etc), et l’évaluation du retentissement de l’anesthésie effectué. Les quantités prélevées seront de 0,3 ml à raison de 8 prélèvements par journée de manipulation. Chez la brebis ces prélèvements serviront à évaluer le retentissement son état sanguin en comparaison à l'état sanguin de son foetus.

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu serait la douleur modérée pendant et suite à la chirurgie de la brebis gestante, dont la prise en charge de la douleur est optimisée pendant les manipulations et par un protocole anti douleur après les manipulations durant 3 jours par Buprénorphine.

Devenir

Après une évaluation de l’état général des brebis à l’issue de la chirurgie par l’expérimentateur (sensibilisé au bien-être animal) et les zootechniciens, les animaux ne seront pas euthanasiés à la fin de la 1ere procédure. Ils seront hébergés dans une animalerie conventionnelle et agréée. A la fin des procédures et du projet, ou en cas de point limite atteint, les animaux seront euthanasiés, soit environ 60 brebis gestantes et leur fœtus. En cas de perte fœtale inopinée (mises bas prématurées ou perte fœtale due à l'anesthésie), nous comptons environ 20 brebis en possible adoption.

Remplacement

L’étude du fœtus humain n’est possible qu’en cas d’expérimentation non invasive et après validation des hypothèses au préalable chez l’animal. En effet d’un point de vue éthique, il n’est pas justifié de réaliser une expérimentation qui comporte un risque de perte fœtale (la réalisation de prélèvements sanguins ou la mesure de façon invasive de la pression artérielle moyenne sur le fœtus par abord cordonal est techniquement possible mais avec un risque de perte fœtale de 3 à 10%). Aucun modèle non animal ne pourrait permettre de réaliser ce projet.

Réduction

Plusieurs procédures expérimentales sont incluses dans ce projet. Les fœtus d’agneau seront leur propre témoin ce qui limitera le nombre d’animaux nécessaires pour le protocole. L’étude consistera à comparer l’état de base des paramètres de fréquence cardiaque et pression artérielle des foetus, de leur signal cérébral et des paramètres sanguins à la réponse obtenue lors d’une analgésie et sédation maternelle et fœtale. Le nombre d'animaux déterminé par une approche statistique est d'environ 8 à 12 animaux par groupe expérimental.

Raffinement

Chaque brebis arrive 10 jours au moins avant la date de la chirurgie afin de s'acclimater à son nouvel environnement. Les brebis sont livrées au minimum par 2 afin de réduire le stress du transport. Les brebis sont hébergées à plusieurs en permanence dans les box et aucune brebis ne sera seule hébergée afin de réduire le stress lié à la solitude. La manipulation sera effectuée sous anesthésie générale avec un protocole spécifique d'anesthésie, d'anti douleur et d'antibiotique préventif. Les expérimentations seront débutées 4 jours après la chirurgie et une même brebis sera utilisée pour plusieurs expérimentations afin d’optimiser au maximum l’utilisation de l’animal. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale : Après une pose de Voie veineuse centrale en jugulaire, un remplissage de 1L de Ringer Lactates, ainsi qu’une pré-oxygénation au masque, la sédation se fera par une injection de Kétamine IV 0.5mg/kg suivi de propofol IV 2 à 3mg/kg (titration jusqu’à perte de conscience), et un maintien à l’isoflurane (AErane®) enfin une injection per opératoire IV continue de kétamine à 0.1-0.25mg/kg/h. Les animaux bénéficieront de protocoles antalgiques adaptés (Buprénorphine BUPAQ® (0,04 à 0,06 mL/kg en intramusculaire) lors de la période pré et post-opératoire.

Choix des espèces

Le modèle animal doit avoir des caractéristiques morphologiques et physiologiques proches du modèle humain. C’est le cas de la brebis, qui est un mammifère avec une gestation de singleton ou de jumeaux, dépendante du placenta et de la circulation foeto-placentaire. Le poids et la circulation du fœtus d’agneau sont proches de ceux du fœtus humain. Sa taille est suffisante pour permettre la pose de cathéters vasculaire, en limitant le risque de perte fœtale liée à la chirurgie. Des études sur plusieurs jours sont possibles chez le fœtus d’agneau instrumenté ce qui permet de limiter le nombre d’animaux par projet. Ce modèle est reconnu par la communauté scientifique comme le modèle animal le plus proche pour étudier la physiologie fœtale, ce qui justifie la pertinence de notre choix. Notre protocole de recherche est sur le foetus. Il est donc nécessaire d’utiliser des brebis gestantes. Notre expéri-mentation aura lieu lors du dernier tiers de la gestation (intervention à 125 jours pour un terme de 145 jours). Cet âge gestationnel est nécessaire pour que le fœtus soit suffisamment gros pour la chirurgie, pour la pose de cathé-ters vasculaires (2500 à 3000 g) et pour limiter les risques de perte fœtale per opératoire.

Six journées de neuf heures, onze prélèvements sanguins sur chacun des deux cathéters à chaque journée, 165 ml de sang par journée : 20 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun subit d'abord trois heures de chirurgie pour la pose de cathéters permanents et d'une canule reliée à son intestin, puis quinze jours de récupération avant le premier jour de prélèvements, en cage individuelle pendant toute l'expérience. L'objet est de mettre au point un mélange de protéines de maïs et de légumineuses enrichi en leucine, destiné à des produits alimentaires pour personnes âgées, la zéine étant aujourd'hui vendue pour des aliments sans gluten. Le porteur retient le mini-porc pour son appareil digestif proche de celui de l'être humain et parce qu'il accepte de manger tous types d'aliments.

Objectifs

L’objectif du projet est d’élaborer, à partir de la zéine, un mélange de protéines végétales équilibré et optimisé en leucine qui permettra de prévenir et/ou lutter contre la sarcopénie sans recours à un régime hyperprotéique, dans un contexte de durabilité de l’alimentation.

Bénéfices attendus

La zéine est une protéine peu étudiée en France et son potentiel en alimentation de l'Homme n’est que peu envisagé dans les formulations protéiques. La végétalisation de l’alimentation est une préoccupation sociétale majeure ; les industriels veulent y répondre en optimisant les valeurs nutritionnelles et santé des ingrédients et produits qu’ils proposent. Les protéines de maïs en ingrédient sont aujourd’hui proposées pour élaborer des « gluten-free foods », sans préoccupation pour leur apport en leucine ou de leur digestibilité. Le projet posera les bases cognitives et expérimentales pour une utilisation de la zéine en tant que source de leucine dans des produits alimentaires à destination de populations cibles, notamment les personnes âgées. Le projet devrait lever les verrous principaux à son utilisation en définissant un mélange zéine-légumineuse équilibré en acides aminés, digestible et sans impact négatif sur le comportement alimentaire.

Procédures

Chaque animal subira une seule demi-journée (3h) d’intervention chirurgicale pour la pose de cathéters permanents et de canule iléale (1h de préparation pré-opératoire, et 2 h entre l’incision cutanée et le réveil de l’animal). Une période de récupération de 15 jours sera observée , entre la chirurgie et la première journée de prélèvements. Chaque animal participera au final à 6 cinétiques post-prandiales d’une durée de 9 h suivie d’une période de récupération de 5 jours minimum entre chaque cinétique. Lors d’une journée de prélèvement, les animaux recevront le matin comme seul aliment un des régimes à tester. Des prélèvements de sang seront réalisés simultanément dans les 2 cathéters avant et après le repas selon la cinétique de 11 prélèvements sanguins en simultanés sur chaque vaisseau pour chaque animal, étalés sur une journée de 9 heures. Pour chacune des journées de prélèvements, 5 ml de sang seront prélevés sur chaque cathéter à chaque point de cinétique. Le volume total prélevé sera de 165 ml par cinétique (moins de 10% du volume sanguin de l'animal).

Impact sur les animaux

La piqûre d'aiguille pour l'injection de la pré-anesthésie avant intervention chirurgicale entraîne une douleur légère de courte durée. La procédure chirurgicale entraîne une douleur abdominale modérée prise en charge par antalgiques, de courte durée. L'hébergement en cages individuelles entraîne un isolement de l'animal et une limitation de ses comportements sociaux.

Devenir

En fin d'expérimentation les animaux seront euthanasiés, afin de récupérer le matériel implanté et d'effectuer des prélèvements d'organes pour l'évaluation de l'effet des régimes sur la physiologie des animaux via des analyses biologiques, biochimiques et moléculaires.

Remplacement

La biodisponibilité des nutriments fait intervenir de nombreux processus biologiques coordonnés et régulés, qui à ce jour ne peuvent pas être reproduits in vitro.

Réduction

L'effectif prévu dans le schéma expérimental est réduit à son minimum en tenant compte de la variabilité du principal paramètre mesuré (apparition des acides aminés dans le sang), estimée à partir de nos précédentes études sur la biodisponibilité des nutriments réalisées avec un design expérimental similaire. Cette variabilité est liée non seulement à de la variabilité interindividuelle des animaux, mais aussi à la qualité des prélèvements effectuées et à la précision des données obtenues par l’analyse biochimique. Ces aspects sont parfaitement maitrisés par les expérimentateurs du projet qui ont une longue expérience dans le domaine. Le fait d’utiliser un schéma expérimental en carré latin permet de diminuer significativement le nombre d’animaux utilisés (chaque animal étant son propre témoin). L'équipe de recherche impliquée dans le projet a une longue expérience sur l'utilisation d'animaux porteurs de canules digestives et de cathéters sanguins, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés dans le projet, et de prévenir les processus douloureux. L’analyse statistique des données cinétiques (concentrations artérielles en acides aminés, flux de matière sèche et d’azote dans l’intestin chez le porc) sera réalisée. Un nombre minimal de 8 animaux a été déterminé par une approche statistique, ce nombre est nécessaire pour obtenir une différence significative entre les régimes sur le critère principal (biodisponibilité des acides aminés issus de la digestion des protéines). Chaque animal testera successivement les 6 conditions de régimes. 2 mini-porcs suplémentaires sont prévus pour faire face aux aléas (problème lors de l'opération chirurgicale, perte précoce de la perméabilité des cathéters, cochons qui refuseraient un ou plusieurs régimes).

Raffinement

L’approche développée sera peu invasive, et peu traumatisante pour l’animal. La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical lequel se déroule sous anesthésie générale avec monitoring des constantes vitales. Les animaux auront reçu en pré-opératoire un traitement antalgique. En post-opératoire, les animaux recevront pendant 6 jours un traitement anti-inflammatoire, anti-biotique, analgésique et spamolytique. Ce traitement a été validé par notre vétérinaire référent. Après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle. Des points limites ont été définis pour le projet, spécifiques de la période de récupération post-opératoire ou de la période d'expérimentation. En cas d'observation d'un point limite une discussion, entre les personnes en charge du soin aux animaux et les responsables du projet, sera mise en place pour décider du devenir de l'animal (soin et/ou sortie d'expérimentation ou euthanasie). Pendant toute la durée de la période d'expérimentation, les animaux seront hébergés dans des cages, individuelles de taille réglementaire, et avec des parois latérales en plexiglass pour que les animaux puissent se voir et interagir entre eux. Leur environnement est enrichi à l’aide de jouets en caoutchoux adaptés aux porcs. La pièce est à température régulée. Les animaux ont libre accès à l'eau.

Choix des espèces

Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études de nutrition. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments. Ce modèle animal est reconnu par la communauté scientifique comme pertinent pour des études sur la digestibilité d'aliments avec une transférabilité facilitée à des études de la physiologie humaine. La procédure expérimentale est réalisée sur des animaux en fin de croissance (âge>10 mois), afin de bénéficier d'une stabilité pondérale pendant la totalité de la période d'expérimentation.

Pour identifier des marqueurs de tolérance à la chaleur utilisables dans les programmes de sélection génétique en élevage, 72 porcs en croissance vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit deux prises de sang et deux interventions chirurgicales sous anesthésie de trente minutes, pour la pose puis le retrait de capteurs de température, et passe cinq semaines en case individuelle. 36 d'entre eux sont soumis pendant cinq semaines à une chaleur équivalente à celle d'un élevage tropical. Tous sont maintenus en vie et replacés en élevage à l'issue, l'objectif déclaré étant d'améliorer la robustesse et la productivité des porcs exposés aux vagues de chaleur.

Objectifs

Le stress thermique impacte à la fois le bien-être, la santé et la productivité des animaux d’élevage. Avec le changement climatique et l’augmentation de la fréquence et de l’intensité des vagues de chaleurs dans le monde, le stress thermique est devenu un enjeu majeur pour l’élevage. Le stress thermique induit une réduction de l’ingéré, ainsi qu’une diminution de l’absorption de certains acides aminés, ce qui va réduire la quantité de nutriments disponibles pour l’animal. En réponse au stress thermique l’animal doit donc ajuster l’ingestion, l’absorption et l’allocation des nutriments entre entretien et croissance pour maintenir l’homéostasie. Afin de pouvoir sélectionner des animaux résilients, c’est-à-dire ceux ayant une capacité à être affectés de façon minimale par la perturbation ou à récupérer rapidement, il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la réponse au stress thermique ainsi que leur variabilité génétique. Identifier des biomarqueurs ou des proxys liés à la réponse au stress thermique permettrait d’identifier plus tôt des animaux qui souffrent de stress thermique, mais aussi d’estimer la composante génétique de ces biomarqueurs et potentiellement de les intégrer dans des programmes de sélection génétique pour améliorer la réponse au stress thermique. L’objectif principal de ce projet est d’identifier des biomarqueurs candidats ou des proxys indicateurs de la tolérance à la chaleur, qui pourront ensuite être mesurés en routine pour estimer leur composante génétique. Nous proposons de comparer dans des conditions expérimentales contrôlées avec un phénotypage fin les réponses adaptatives de deux races de porcs contrastées, la race Large White sélectionnée pour ses performances de production et la race Créole caractérisée par sa bonne adaptation aux conditions tropicales, pendant la phase de croissance. Ainsi, ce projet permettra : 1) d’évaluer les effets directs et indirects du stress thermique sur les paramètres de croissance, sur la thermorégulation et sur le métabolisme, 2) d’étudier les interactions gènes-environnement, c’est-à-dire la différence de réponse au stress thermique entre 2 races contrastées.

Bénéfices attendus

Les données recueillies à la fois au niveau des performances, de la thermorégulation et du métabolisme permettront d’étudier les différences de réponses en fonction du génotype. Cette approche comparative de 2 génotypes contrastés permettra à la fois d’évaluer les interactions gènes-environnement en réponse au stress thermique mais aussi de caractériser finement la réponse thermorégulatrice chez des porcs d’une race locale adaptée à la chaleur. Cette étude sera la première à notre connaissance à quantifier les effets directs et indirects du stress thermique. De plus, les mesures en continu des différents paramètres de thermorégulation permettront de caractériser finement la capacité à dissiper la chaleur chez les 2 races et pourra indiquer de potentiels proxys indicateurs de tolérance à la chaleur. Identifier des biomarqueurs ou des proxys liés à la réponse au stress thermique permettrait d’identifier plus tôt des animaux qui souffrent de stress thermique, mais aussi d’estimer la composante génétique de ces biomarqueurs et potentiellement de les intégrer dans des programmes de sélection génétique pour améliorer la réponse au stress thermique.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à 2 prises de sang (en début et fin d'experimentation) qui seront effectuées en moins de 5 min chacune par animal. Tous les animaux subiront 2 interventions chirurgicales (pour la pose et le retrait des capteurs de mesure en continu de la température, au début et à la fin de l'expérimentation) avec une anesthésie de 30 min chacune. Tous les animaux seront hébergés en cases individuelles pendant 5 semaines. Une partie des animaux (n=36) sera soumis à un stress thermique équivalent aux conditions d'élevage en milieu tropical pendant 5 semaines.

Impact sur les animaux

L'hébergement en case individuelle, nécessaire pour le suivi individuel de l'ingéré, pourra induire un stress chez les animaux. La prise de sang et l’injection de l'anesthésiant pour l'opération peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site de prélèvement/injection. La prise de sang peut également engendrer un hématome. Les différentes manipulations peuvent également générer du stress, notamment la contention liée à la prise de sang. Le réveil suite à l'anesthésie peut également générer un stress.

Devenir

Tous les animaux sont maintenus en vie et replacés en élevage à la fin des différentes procédures.

Remplacement

L'objectif est de caractériser les mécanismes physiologiques et génétiques liée à la réponse au stress thermique. Il s'agit de caractères complexes dont le déterminisme est très probablement polygénique. Il n’existe pas à ce jour de modèle in vitro pertinent permettant d’appréhender l’étude de ces caractères complexes. L'utilisation de l'animal est donc nécessaire pour documenter les réponses physiologiques, génétiques et comportementales.

Réduction

L'effectif des différents lots est contraint par le nombre de loges disponibles dans chaque batiment (12 loges en batiment à ambiance controlée, 12 loges en batiment semi ouvert). Pour chaque répétition, les effectifs varient donc entre 6 et 12 animaux pour les différentes conditions environnementales testées. Nous nous intéressons à l'effet de la race et du traitement ainsi qu'à l'intéraction entre ces 2 effets. L'effectif de chacune des 6 modalités (entre 9 et 18 animaux au total sur les 3 répétitions) est l'effectif minimum pour mettre en évidence des effets statistiques significatifs . Par ailleurs, l'aquisition de données longitudinales (capteurs de température, de rythme respiratoire, d'activité associés à des caméras de suivi de comportement) permettra d'optimiser l'utilisation de chaque animal.

Raffinement

Les conditions d'hébergement sont raffinées par des installations prenant en compte l'enrichissement du milieu des animaux et où le personnel est formé à l'expérimentation animale, aux notions de santé des animaux et aux notions de points limites pour favoriser leur bien-être. Des temps d'adaptation aux loges individuelles et des temps de récupération après les opérations ont été prévus pour réduire l'impact de ces procédures sur les animaux. L'état de santé des animaux sera suivi quotidiennement. Ainsi des comportements anormaux pourront permettre la détection précoce des pathologies et de situations de mal-être. Les animaux en post-opératoire seront particulièrement suivis grâce à une grille de score clinique. La prise de sang sera raffinée en utilisant l'entrainement des animaux pour réaliser une prise de sang sans contention. Tous les animaux seront entrainés durant les jours précédents la prise de sang à lever la tête pour boire une boisson sucrée au biberon tout en massant l'encolure pour simuler la prise de sang jusqu'a pouvoir rélaiser la prise de sang elle-même. Si l'entrainement n'est pas suffisant pour certains animaux pour réussir la prise de sang, le lasso nasal sera utilisé en dernier recours. Dans tous les cas, un renforcement positif à base d'eau sucrée sera donné à tous les animaux juste après la prise de sang. Les prises de sang et la chirurgie seront réalisées par des personnes compétentes et formées pour réaliser les prélèvements en moins d'une minute entre la contention, le prélèvement, la désinfection et la libération de l'animal. Les animaux prélevés et opérés seront observés afin de prévenir d'éventuelles complications.

Choix des espèces

Le porc est particulièrement sensible au stress thermique, qui induit une diminution de sa consommation alimentaire. La compréhension des mécanismes de réponse au stress thermique permettrait d’améliorer la robustesse des animaux et leur bien-être. Nous utiliserons des porcs en croissance car ils sont particulièrement sensibles au stress thermique et soumis à ce type de stress dans les élevages lors des vagues de chaleur ou dans les pays tropicaux.