Macaques à longue queue

Réattribués à une nouvelle procédure après validation vétérinaire, dix macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque séance commence par une mise à jeun depuis la veille, se poursuit sous anesthésie continue avec trois cathéters posés, et comporte jusqu'à trente prélèvements sanguins, dans la limite de 15 % du volume circulant de l'animal. Le porteur reconnaît que des prélèvements trop répétés peuvent provoquer une anémie, et que l'hébergement individuel imposé le temps de la décroissance du radioisotope, jusqu'à 72 heures, constitue un stress. Il justifie le recours au macaque par la taille de ses veines, par la ressemblance de son cerveau avec celui de l'humain, et par le fait que ces études pharmacologiques ne sont "souvent pas autorisées chez l'homme".

Objectifs

Ce projet de recherche a pour objectif de vérifier si certaines molécules d’intérêt médical peuvent se fixer de manière fiable à une cible biologique précise, susceptible d’être utilisée en diagnostic ou en thérapie. Pour cela, nous utilisons une technique d’imagerie non invasive appelée tomographie par émission de positons (TEP), qui permet de suivre le comportement de ces molécules dans l’organisme vivant. La première question posée est de savoir si le radiotraceur utilisé se lie réellement à la cible visée, et si cette liaison est suffisamment spécifique et sélective. Autrement dit, il s’agit de vérifier que le signal observé correspond bien à la cible d’intérêt et non à d’autres structures biologiques. Cette étape est étudiée en administrant une molécule compétitrice connue, capable de prendre la place du radiotraceur. La deuxième question porte sur la reproductibilité des mesures, c’est-à-dire les différences de distribution du radiotraceur entre différents individus et également chez un même individu (test-retest). La troisième question concerne le devenir des molécules d’intérêt dans le sang et les tissus : sa répartition entre le sang total et le plasma, sa liaison aux protéines sanguines, sa stabilité dans le temps et sa distribution dans les organes. Enfin, la quatrième question vise à évaluer l’exposition globale de l’organisme au radiotraceur, un paramètre clé pour anticiper une utilisation future chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet apporteront des résultats significatifs dans la compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans certaines maladies, en particulier en ce qui concerne l’interaction entre des molécules d’intérêt médical et leurs cibles dans l’organisme. Ces connaissances contribueront à accélérer le développement de nouveaux outils diagnostiques et thérapeutiques. En définissant des critères clairs de sélection des molécules dès les premières étapes de la recherche, les résultats permettront de mieux orienter les efforts scientifiques vers les solutions les plus efficaces, tout en limitant le recours ultérieur à des études plus complexes et plus lourdes. Le projet produira également des données fiables sur la distribution des molécules dans le cerveau et dans l’ensemble du corps, informations essentielles pour comprendre leur mode d’action et leur devenir dans l’organisme. Ces résultats renforceront la qualité des évaluations pharmacologiques et faciliteront la comparaison entre différentes molécules candidates. À plus long terme, les données générées constitueront une base scientifique solide et réutilisable, pouvant servir à l’identification de biomarqueurs diagnostiques ou à la préparation d’évaluations thérapeutiques ciblant des pathologies spécifiques. Grâce à la forte proximité biologique du primate non humain avec l’être humain, les résultats obtenus permettront une meilleure transposition vers la clinique, augmentant les chances que les avancées issues de ce projet se traduisent en bénéfices concrets pour la santé humaine. L’optimisation des stratégies de recherche contribue aussi à une utilisation plus raisonnée des ressources expérimentales, au bénéfice d’autres espèces et de l’environnement.

Procédures

Avant l’imagerie les animaux sont mis à jeun depuis la veille au soir pour un examen d’imagerie réalisé le matin. Après l’induction de l’anesthésie, trois cathéters sont posés, l’un sert à administrer l’anesthésie de manière continue pendant l’imagerie, l’autre à administrer les ligands, et le troisième pour effectuer des prélèvements sanguins. Le volume sanguin total prélevé et le nombre de prélèvements (maximum 30) correspondra à moins de 15% du volume circulant de l’animal. L’hébergement individuel est limité à la durée de décroissance du radioisotope (min 4h, max 72h.

Impact sur les animaux

Chaque séance d’imagerie sur le PNH est un acte qui peut générer plusieurs nuisances ou effets indésirables : - L’anesthésie peut induire une hypothermie et perte de poids transitoire de l’animal : les animaux sont thermorégulés avec un suivi de la température corporelle. Au réveil, les animaux sont nourris avec quelques fruits ou légumes en plus de leur ratio de croquettes. - L’anesthésie peut induire une déshydratation de l’animal. - Des prélèvements sanguins trop répétés peuvent induire une anémie chez le PNH: le taux d’hémoglobuline est mesuré régulièrement et une période de repos est accordée aux animaux entre les examens. - L’hébergement temporaire en zone TEP lors de la décroissance est un stress pour l’animal : cette période est réduite à la période de décroissance réglementaire. - L’introduction des cathéters peuvent induire des hématomes et douleurs associées.

Devenir

A l’issue de la procédure, après validation par le vétérinaire, les primates non humains peuvent être attribués à une nouvelle procédure.

Remplacement

Avant toute utilisation d’animaux, les radiotraceurs font l’objet d’une stratégie de développement progressive visant à privilégier les méthodes de remplacement. Des approches in silico (modélisation numérique) sont d’abord mises en œuvre afin de sélectionner les candidats les plus pertinents. Ces candidats sont ensuite évalués par des méthodes in vitro (tests de liaison, de spécificité, de stabilité et de métabolisme sur systèmes cellulaires ou biochimiques) et, lorsque cela est possible, par des approches ex vivo. Ces étapes permettent un remplacement partiel de l’expérimentation animale et conduisent à l’élimination précoce des radiotraceurs ne répondant pas aux critères requis. La validation in vivo chez le rongeur constitue une étape intermédiaire indispensable pour étudier la biodistribution, la pharmacocinétique et le signal d’imagerie dans un organisme vivant. Toutefois, pour certains ligands à visée clinique, les données obtenues chez le rongeur ne permettent pas d’obtenir des résultats suffisants, notamment en raison de différences physiologiques, anatomiques et métaboliques limitant la transposabilité à l’homme. Dans ces situations spécifiques, l’évaluation chez le primate non humain devient nécessaire afin de se rapprocher au plus près des conditions cliniques humaines. À ce stade du développement, il n’existe pas d’alternative complète permettant de reproduire de manière intégrée l’ensemble des paramètres requis (biodistribution, métabolisme, cinétique du radiotraceur, passage de barrières biologiques et signal d’imagerie). Ces phénomènes ne peuvent pas être modélisés de façon fiable par des méthodes in silico, in vitro ou ex vivo seules. Seuls les radiotraceurs pour lesquels l’ensemble des approches alternatives et des modèles de rongeurs s’est révélé insuffisant sont testés chez le primate non humain, ce qui permet de limiter strictement le nombre d’animaux utilisés. L’imagerie TEP, méthode non invasive, autorise par ailleurs des études longitudinales chez un même animal, contribuant au raffinement des procédures et à la réduction globale de l’utilisation d’animaux.

Réduction

L’imagerie TEP est une technique d’imagerie peu invasive, ce qui permet de répéter l’examen chez le même animal, réduisant ainsi le nombre d’animaux. Les examens d’imagerie étant très bien tolérés par les animaux, nous faisons le choix de réduire le nombre d’animaux dans cette demande d’autorisation de projet et d’augmenter les répétitions. Si certaines informations sont déjà connues dans la littérature, ces expériences ne seront pas répétées.

Raffinement

L’examen se déroule sous anesthésie générale. Une assistance respiratoire est appliquée en cas d’arrêt respiratoire. Pendant l’examen, les paramètres physiologiques, tels que le rythme cardiaque, la pression artérielle et la fréquence respiratoire sont utilisés comme indicateurs pour adapter la profondeur de l’anesthésie. Avant chaque protocole, le taux d’hémoglobine est mesuré pour chaque primate non humain au début, et pendant toute la durée de la procédure. Pendant les examens, les animaux sont hydratés. Des points limites ont été identifié conduisant à l’arrêt de l’imagerie, suivi par le réveil, et une phase de récupération puis reprise normale du protocole ou prolongement période de repos.

Choix des espèces

Le primate non humain permet par sa taille d’effectuer des prélèvements sanguins simultanément à l’acquisition des images TEP, contrairement au rongeur. Ce projet utilise des jeune adulte d’au moins 5 ans pour assurer que : - le volume sanguin permette les prélèvements nécessaires, - la taille des veines/artères permette facilement la pose de cathéters. Chez l’homme, le prélèvement sanguin artériel demande une logistique hospitalière importante, et est difficile voire impossible à mettre en œuvre chez certains patients. L’utilisation du primate non humain se justifie par la ressemblance anatomique et fonctionnelle du cerveau par rapport à celui de l’homme. La taille et la structure du cerveau permettent des analyses anatomiques et fonctionnelles strictement comparables à celles réalisées dans les mêmes conditions chez les patients. L’utilisation du primate non humain se justifie par le fait que les études pharmacologiques ne sont souvent pas autorisées chez l’homme, car les pharmaceutiques utilisés dans ces études ne disposent pas toujours d’une autorisation de mise sur marché (AMM). Jeune adulte d’au moins 5 ans pour assurer que: - le volume sanguin permette les prélèvements nécessaires pour la mesure temporelle de la concentration sanguine du radioligand, - la taille des veines/artères permette facilement la pose de cathéters.

Une injection dans le cerveau sous anesthésie, une heure d'intervention, puis vingt-neuf jours avant la mise à mort, neuf macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois vecteurs de thérapie génique contre la maladie de Huntington sont testés, à raison de trois animaux par vecteur, l'enjeu déclaré étant de déterminer lequel atteint le mieux sa cible dans le cerveau. Le porteur indique que l'administration intracérébrale peut provoquer un saignement dans le cerveau et des troubles de la locomotion, et les neuf animaux sont tués à l'issue pour prélever leurs organes. Il justifie l'emploi de jeunes adultes par la volonté d'écarter les anomalies liées au vieillissement, et écrit que les similitudes entre cerveaux de macaques et cerveaux humains rendent cet emploi "indispensable".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser le suivi dans le corps de candidats médicaments innovants développés pour le traitement de la maladie d’Huntington après administration dans le cerveau. Huntington est une maladie qui affecte les fonctions motrices et entraine une détérioration physique et mentale chez l'Homme. Il n'existe actuellement aucun traitement sur le marché permettant de la soigner, de retarder son apparition ou de ralentir sa progression. Les candidats médicaments testés visent à corriger la cause sous-jacente de la maladie et non traiter ses symptômes. Cette étude permettra de sélectionner le médicament qui atteignera le mieux sa cible après administration.

Bénéfices attendus

En cas de succès, l’administration unique de ce médicament, au plus proche de sa cible (directement dans le cerveau) permettra d’induire un ralentissement significatif de la progression de la maladie.

Procédures

Après plus de trois semaines d’acclimatation et d’habitation, les 9 animaux inclus dans le projet recevront une injection du candidat médicament dans le cerveau sous anesthésie et analgésie (après mise à jeun inférieure à 16h). L’intervention durera environ 1h. Des prélèvements de sang seront réalisés avant et après administration sur animal vigile (3 prélèvements sanguins par animal seront réalisés sur une période de 29 jours). Le temps de contention nécessaire à la réalisation de ces prélèvements est compris entre 3 et 5 minutes. Le suivi des paramètres physiologiques (poids, température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Une pesée par semaine par animal sera réalisée. La température corporelle sera mesurée 1x/jour 3 jours avant administration, 2x/jour le jour de l’administration et 1x/jour durant 3 jours après l’administration. Le projet prendra fin 29 jours après l’administration du candidat médicament et les 9 animaux impliqués seront mis à mort sous anesthésie afin de récolter leurs organes.

Impact sur les animaux

L’administration dans le cerveau pourra provoquer une douleur modérée avec des risques neurologiques (saignement dans le cerveau, trouble de la locomotion…) et/ou l'apparition de réactions locales au niveau de la plaie chirurgicale (du type hématome, gonflement, saignement léger, infection par exemple). Durant les administrations, les animaux seront anesthésiés, ce qui pourra engendrer un stress ou une sensation d’inconfort lié à la mise à jeun (inférieure à 16h), à la procédure d’induction (contention, administration, perte de conscience…) ou lié au réveil de l’animal (risque de vomissement, perte d’équilibre…). Les prélèvements de sang pourront provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome léger). Les pesées et les mesures de température rectale peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux.

Devenir

Les 9 animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter leurs organes pour déterminer la biodistribution des candidats médicaments testés.

Remplacement

Les études permettant de déterminer le suivi des candidats médicaments dans le corps sont indispensables au développement de nouvelles thérapies. En effet, celles-ci permettent de déterminer sa localisation dans les différents tissus après administration. Cette étude dépend d’un grand nombre de facteurs qui interagissent en temps réel dans un organisme vivant et complexe (ex : échanges entre les tissus, barrières biologiques…). Seul un organisme complet, où tous les organes sont en interaction constante permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet. Ceci ne pourrait être obtenu en culture cellulaire et justifie le recours à des animaux.

Réduction

9 primates répartis en 3 groupes seront utilisés dans ce projet. 3 médicaments seront testées, chacun sur 3 animaux. 3 animaux seront utilisés par groupes car, en plus de pouvoir détecter une tendance dans le groupe, ce nombre permet de déceler toute valeur extrême, ce qui est un paramètre critique pour l’interprétation des résultats scientifiques du projet. Cette étude n’étant pas règlementaire, elle ne nécessite pas de réaliser des tests statistiques sur de grandes cohortes d’animaux.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet sera mis en place au sein de l'animalerie comprenant des enrichissements structuraux permettant aux primates d'évoluer dans un environnement tridimensionnel, de la litière pour leur permettre de fourrager, des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent, des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs). De la musique d'ambiance/des documentaires/dessins animés seront diffusés pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation de plus de 3 semaines sera mise en place avant le début de l’étude incluant un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif. Elle permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de température rectale, pesée, prises de sang). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l’étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. Un suivi spécifique neurologique sera également mis en place. Pour limiter le stress et l’ennui lié aux actes techniques, le personnel veillera à interagir avec les animaux en gardant une interaction quotidienne avec chaque animal. L'administration des médicaments dans le cerveau sera réalisée sous anesthésie et anti-douleurs. Des antibiotiques et des anti-inflammatoires seront également utilisés pour le confort des animaux. Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile afin d’éviter les modifications physiologiques de l’animal et le stress, engendrés par une anesthésie, ainsi qu’un risque plus important pour l’animal que la procédure elle-même. Des points limites seront mis en place afin de détecter précocement tout signe de stress ou de douleur. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’état de l’animal se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

Les primates constituent un modèle animal de référence pour déterminer le suivi de candidats médicaments dans le système nerveux avant les essais cliniques chez l’Homme. En effet, il est admis que les primates présentent de nombreuses similitudes avec l’Homme que l'on ne retrouve pas dans d'autres modèles animaux, par exemple une grande homologie d'ADN, de grandes similitudes entre les cerveaux de primates et les cerveaux humains contrairement aux cerveaux de rongeurs. Cette espèce apporte donc les meilleures données transposables à l’Homme. L’ensemble de ces similitudes avec l’Homme rend son emploi indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. De jeunes animaux seront utilisés dans ce projet. Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter le système nerveux, ce qui pourrait interférer avec les résultats scientifiques de l’étude et la qualité des échantillons prélevés. Leur organisme a atteint la maturité mais ne subit pas encore les variations liées au vieillissement. Il est donc préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge.

Pour tester un gel lubrifiant censé prévenir la transmission sexuelle du VIH, 25 macaques à longue queue femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir jusqu'à huit applications du gel, 25 anesthésies, 25 prélèvements sanguins, trois biopsies de tissus et trois colposcopies vaginales. Seize d'entre elles au maximum sont exposées au virus une fois par semaine pendant huit semaines, avec fièvre, diarrhées persistantes et perte de poids attendues en phase aiguë. Celles du test de tolérance sont réintégrées dans l'étude d'exposition, les animales infectées étant tuées pour mesurer la charge virale dans leurs tissus.

Objectifs

Les infections sexuellement transmissibles (IST) constituent un problème majeur de santé publique, avec plus de 1 million de nouveaux cas recensés chaque jour dans le monde, particulièrement chez les femmes. Malgré les efforts déployés à l’échelle mondiale, le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) reste un pathogène majeur à l’échelle mondiale. Il est donc nécessaire de développer des stratégies permettant de réduire et de prévenir ces infections. Le préservatif reste aujourd’hui le moyen de protection le plus efficace contre ces infections. Toutefois, son usage reste insuffisant dans certaines populations, pour des raisons sociales, culturelles ou liées à l’impossibilité de négociation au sein du couple. Dans plusieurs régions à forte incidence, notamment en Afrique subsaharienne, les jeunes femmes représentent 80 % des nouveaux cas de VIH. Le développement de moyens de protection autonomes, en particulier pour les femmes, ne nécessitant pas de négociation préalable avec le partenaire, représente ainsi un enjeu important de santé publique. Dans ce contexte, le projet vise au développement et à l’évaluation préclinique de gels lubrifiants microbicides pour prévenir de l’infection au VIH, conçus pour reproduire les propriétés protectrices du mucus naturel au niveau des muqueuses génitales. Dans un premier temps, la compatibilité du gel avec les tissus muqueux et les paramètres biologiques généraux de l’organisme au gel seront évalués après administration dans le vagin . Dans un second temps, la protection du gel contre l’infection sera évaluée par l’analyse des paramètres virologiques et immunologiques. Le modèle retenu est le macaque cynomolgus femelle, référence pour l’étude de la transmission muqueuse du VIH, en raison de la proximité de son système immunitaire avec celui de l’être humain, de la proximité anatomique et physiologique de son appareil reproducteur, de son cycle menstruel et de sa sensibilité à l’infection par un virus simien reproduisant les caractéristiques de l’infection HIV.

Bénéfices attendus

Le projet permettra le développement de nouvelles approches pour la confection de gel lubrifiant microbicide contre les infections sexuellement transmissibles (IST). Tout d’abord contre l’infection VIH chez la femme, et à long terme dans le développement d’un produit à plus large spectre contre les IST pour les femmes et les hommes.

Procédures

Les interventions prévues dans ce projet sont : • Administration du gel lubrifiant candidat ou contrôle (jusqu’à 8 administrations, sur 25 animaux, 1x par semaine, 2min) • Anesthésie des animaux (jusqu’à 25x, sur 25 animaux, 30min) • Prélèvements sanguins (jusqu’à 25x, sur 25 animaux, 5 min) • Biopsie de tissus (maximum 3, sur 25 animaux, 30min). • Suivi de l’environnement vaginal (récolte de fluides vaginaux, jusqu’à 25x, sur 25 animaux 2min) • Infection de 16 animaux maximum, (jusqu’à 8 infections à une fréquence d’une exposition par semaine, 2min) • Colposcopie vaginale, (3x maximum sur 25 animaux, 10min)

Impact sur les animaux

Nuisance liée au traitement Suite au traitement, une réaction locale d’inflammation peut apparaitre : démangeaison, douleur de façon transitoire. Nuisances liées aux prélèvements sanguins et biopsies tissulaires -Une réaction locale après prélèvement sanguin -Une réaction locale, suppuration, démangeaisons/douleur peuvent apparaitre après une biopsie tissulaire de façon transitoire. Nuisance liée à l’anesthésie Les anesthésies répétées peuvent entrainer une baisse de l’alimentation et par conséquent une perte de poids. Nuisance liée à l’infection sexuellement transmissible Les animaux infectés peuvent développer de la fièvre, des diarrhées persistantes, une perte de poids et une baisse du niveau de lymphocytes T de façon transitoire en phase aigüe (durée : quelques semaines). Nuisances liées aux colposcopies La colposcopie n'est pas un examen douloureux mais des crampes peuvent être ressenties après l’examen.

Devenir

Les animaux issus du test de tolérance seront gardés en vie et ils pourront être inclus dans l’ étude de protection afin de réduire le nombre d’animaux utilisés après avis du vétérinaire. Les animaux exposés au virus seront euthanasiés pour l’évaluation de la charge virale tissulaire et des réponses immunitaires dans les tissus.

Remplacement

L es études de tolérance et de l’efficacité d’un produit prophylactique contre des virus aussi critiques que VIH, ne peuvent pas être testées directement chez l’ être humain mais doivent montrer une efficacité dans des conditions proches de ce qui ce qui passe chez l’être humain. L’étude de tolérance et d’efficacité d’un produit au niveau vaginal implique un modèle proche de l’humain au niveau anatomique, du système immunitaire et de sa capacité à être infecté par le VIH. Aucune méthode alternative ne permet actuellement d’évaluer simultanément : • La tolérance locale sur une muqueuse génitale fonctionnelle ; • La protection induite dans un modèle d’exposition répétée au virus reproduisant les conditions de la transmission sexuelle.

Réduction

La taille des groupes a été réduite au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats par des tests adaptés pour pouvoir conclure de la tolérance et de l’efficacité de traitements prophylactiques candidats tout en prenant en compte une certaine variabilité individuelle.

Raffinement

Hébergement Les animaux seront hébergés en groupes avant le début des expérimentations et pendant le test de tolérance. Pendant la phase d’infection, les animaux seront en hébergements individuels proches afin d’éviter la surexposition virale tout en permettant des interactions sociales entre eux. L’enrichissement sera renforcé pour les animaux hébergés individuellement (distribution 2 fois/semaine d’enrichissements destructibles ou de sachet surprise au lieu d’1). En plus, du raffinement (nourriture plus variée, compléments alimentaires) sera mis en place quotidiennement. Anesthésie Les interventions (administrations, prélèvements de tissus, colposcopies) et les prélèvements de fluides seront regroupés autant que possible et réalisés sous anesthésie générale afin d’éviter le stress et d’éventuelles douleurs. Les anesthésies répétées pouvant entrainer une baisse de l’alimentation, une diversification et complémentation de celle-ci pourront être instaurées. Le recours à des techniques d’analgésie et d’antalgie pourra être mis en place lors d’apparitions de signes particuliers. Prélèvements sanguins et tissulaires En cas de signes cliniques liés aux biopsies tissulaires => signalement au vétérinaire, afin de mettre en place un traitement symptomatique en local. Traitement intravaginal Le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques (rougeurs, démangeaisons) afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Infection lors du test d’efficacité Les animaux seront observés quotidiennement. Les expositions virales seront interrompues dès confirmation de l’infection. En cas de modifications majeures des paramètres biologiques après analyses des prélèvement sanguins (, associées à l’apparition de signes cliniques, un avis vétérinaire sera demandé. Examens colposcopiques Des colposcopies permettront de déterminer l’intégrité de la muqueuse vaginale et des signes d’inflammation avant et après traitements. Les colposcopies seront effectuées sous anesthésie pour éviter le stress, aucune douleur n’est attendue lors de cet examen.

Choix des espèces

Le macaque cynomolgus femelle de plus de 3 ans a été choisi en raison de la pertinence scientifique de ce modèle pour l’étude de la transmission muqueuse du VIH retrouvé chez la femme. L’environnement vaginal et le système immunitaire varie au cours de développement et de l’âge de l’animal et ont donc un impact sur la susceptibilité à l’infection virale et sur les effets d’un traitement prophylactique. Ces études seront donc réalisées chez des macaques cynomolgus femelles de plus de 3 ans possédant un système immunitaire « mature ». Le macaque Cynomolgus partage à la fois une grande similarité avec l’être humain au niveau anatomique et morphologique du système reproducteur féminin, mais aussi au niveau de son système hormonal, et de son cycle menstruel. De plus le macaque cynomolgus possède un système et une réponse immunitaire proche de l’ être humain. Ce modèle est susceptible à l’infection par le virus simien, et développe une physiopathologie proche de celle observée chez l’humain atteint du VIH. Aucun autre modèle animal ne permet d’évaluer simultanément la tolérance au niveau de la muqueuse, l’impact hormonal et l’efficacité prophylactique dans un contexte d’exposition virale répétée.

Gardés en vie et réutilisés à la fin, 7 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une crème inflammatoire est appliquée sur leur dos une à deux fois par jour pendant quinze jours, avec quatre biopsies de peau sous anesthésie et cinq prises de sang, pour valider un modèle de psoriasis. Le modèle avait été testé sur quatre animaux, aux réponses inconstantes. Trois macaques sont ajoutés pour tenter d'obtenir l'effet recherché.

Objectifs

L’objectif du projet est de valider un modème d’inflammation cutanée chez le primate non humain afin de reproduire une réponse inflammatoire cutanée comparable à celle observée chez l’homme dans le cadre d’un psoriasis. Le psoriasis touche 2 à 3 % de la population, ce qui en fait une maladie chronique fréquente et un véritable enjeu de santé publique. Son caractère inflammatoire systémique justifient une recherche active pour mieux comprendre ses mécanismes. Enfin, son fort impact sur la qualité de vie rend indispensable le développement de traitements plus efficaces et mieux tolérés. De plus, le psoriasis partage des mécanismes inflammatoires avec d’autres maladies auto-immunes extrêmement invalidante, comme l’arthrite rhumatoïde. Les modèles expérimentaux de psoriasis sont donc aussi utilisés comme des portes d’entrées sur d’autres maladies inflammatoires pour lesquelles il n’y a pas de modèles satisfaisants. Mieux caractériser ce modèle au niveau des mécanismes inflammatoires impliqués permettra de l’utiliser pour tester des candidats médicaments dédiés à d’autres indications thérapeutique et accélérera leur développement. Dans le cadre de cette validation, des prélèvements cutanés et sanguins seront réalisés, cette approche permettra de caractériser les profils d’expression génique associés à la réponse inflammatoire et de confirmer la pertinence biologique du modèle. Un modèle similaire a été décrit chez la souris puis chez le primate non humain mais une revalidation est nécessaire : • les données existantes concernent une autre espèce de primate non humain, susceptible de présenter des différences immunologiques. De plus, les données méthodologiques sont lacunaires et ne permettent de pleinement juger de la pertinence du modèle ou de le reproduire. • il faut spécifiquement vérifier l’activation de certaines voies de signalisation inflammatoires dans les lésions induites, étape indispensable pour le développement de candidats thérapeutiques ciblant certaines populations immunitaires. La validation du modèle dans cette espèce vise ainsi à confirmer sa pertinence biologique, sa reproductibilité et son adéquation aux besoins du programme de recherche, en vue de son utilisation ultérieure pour l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques destinées aux maladies inflammatoires cutanées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ces projets sont à terme, la validation d’un modèle préclinique qui induit une réponse inflammatoire cutanée similaire au psoriasis humain, tant sur le plan clinique qu’immunologique, d’étudier les mécanismes immunitaires induits par cette crème chez le primate, plus proche de l’homme que les rongeurs, pour mieux caractériser les voies impliquées et enfin d’avoir un modèle validé pour évaluer l’efficacité et la tolérance de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux vigiles auront une application de crème sur le dos quotidiennement pendant 15 jours pour 4 animaux et bi quotidiennement pour 3 animaux. L’application de la crème et la contention durera environ 10 à 15 minutes. Cette contention pour l’application de la crème permettra également de faire une observation dermatologique rapprochée quotidienne du site d’application. Les animaux auront également 5 prélèvements de sang de 2,5ml, pour un volume total prélevé de 12,5 ml sur 2 semaines. Les animaux seront vigiles lors des prélèvements de sang uniquement les jours sans biopsie de peau. Les jours de biopsie, les animaux seront anesthésiés, les prélèvements de sang se feront donc à ce moment-là. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris). Quatre prélèvements de peau par animal seront réalisés chez tous les animaux et sous anesthésie générale et analgésie (après une mise à jeun inférieur à 16h). Pendant cette anesthésie, des mesures spécifiques dermatologiques tel que l'hydratation ou le pH de la peau seront prisent de manière non invasive avec des appareils de mesure spécialisé pour 4 animaux uniquement. Le prélèvement durera environ 30 minutes (anesthésie et mesures comprises) et environ 20 min sans les mesures pour les 3 autres animaux. Le suivi des poids tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Sur la base du mode d’action de la crème utilisé et de sa cible cutanée des lésions au niveau de la peau pourront être observées. La réalisation de prélèvements sanguins peut également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome ou oedème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction. Les prélèvements de peau sous anesthésie pourront provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement ainsi qu’un hématome et dans de très rare cas une déhiscence de plaie ou infection de la zone de prélèvement. L'anesthésie des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (maximum 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...).

Devenir

À la fin du projet, tous les animaux seront gardés en vie après examen et avis du vétérinaire de l’établissement utilisateur.

Remplacement

Le modèle d’inflammation cutanée présenté vise à reproduire une réponse inflammatoire cutanée complexe, impliquant des interactions immunitaires proches de celles observées chez l’homme. Ces caractéristiques sont essentielles pour garantir la pertinence des résultats et la prédictivité des réponses thérapeutiques. Bien que des modèles de peau in vitro permettent d’étudier certains mécanismes cellulaires, ils restent limités dans la reproduction de la complexité immunologique, vasculaire et systémique observée in vivo. À ce jour, aucune méthode alternative in vitro ou in silico ne permet de capturer de manière fiable cette dynamique intégrée. L’utilisation des animaux demeure donc indispensable pour valider le modèle et assurer la transposabilité des données vers la clinique dans le cadre du développement de nouvelles thérapies.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 4 primates. Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats fiables interprétables. Le but étant aussi de faire des analyses génétiques, il était important d'avoit au moins 4 animaux pour avoir une diversité de profils et de variations potentielles. AJOUT : Lors de la première procédure, quatre animaux ont été utilisés et ont montré des réponses différentes : certains ont bien réagi, d’autres moins. Ces résultats indiquent que le modèle fonctionne, mais que l’effet recherché n’a pas été obtenu de manière constante. L’ajout de trois animaux supplémentaires est donc proposé afin de mieux comprendre cette variabilité et d’augmenter les chances d’observer l’effet attendu.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l’espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux primates d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, application de la crème). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude. Enfin, des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Choix des espèces

L’utilisation du primate non humain pour le modèle d’inflammation cutané induit par l’application d'une crème sur la peau est justifiée par sa similarité immunologique avec l’humain. Les primates ont un système immunitaire proche de celui de l’humain. Ce modèle induit une inflammation de la peau et une activation immunitaire locale. Chez le primate, l'activation immunitaire est exprimé de manière comparable à l’humain, ce qui garantit une réponse pertinente pour l’évaluation des thérapies. Le développement de ce model permettra d’avoir des résultats transposables et prédictifs pour l’homme. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements de peau pendant l’étude seront réalisés en fin d’étude dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Jusqu'à deux chirurgies cérébrales de quatre heures et des séances répétées d'IRM et de TEP sous anesthésie générale sur un an: 60 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Des protéines pathologiques humaines sont injectées dans leur cerveau pour y reproduire une maladie de Parkinson ou d'Alzheimer et suivre l'apparition de troubles moteurs et cognitifs. Le porteur juge le primate "indispensable" au motif que les rongeurs ne reproduisent pas les symptômes cognitifs. Tous les cerveaux sont prélevés après la mise à mort pour analyse.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer ou la paralysie supranucléaire progressive se caractérisent par l’accumulation progressive d’agrégats protéiques spécifiques dans le cerveau. Avec l’évolution de la maladie et le vieillissement cellulaire, ces agrégats deviennent toxiques, entraînant la mort des neurones et l’apparition de symptômes moteurs et cognitifs. Il est donc essentiel de comprendre le rôle de ces agrégats dans le développement des déficits, d’évaluer leur impact fonctionnel et d’explorer des stratégies thérapeutiques visant à favoriser leur élimination, telles que les immunothérapies. Les modèles animaux classiques, notamment les rongeurs, permettent de reproduire certaines lésions mais ne reflètent pas pleinement les symptômes, en particulier cognitifs. Cette limite pourrait s’expliquer par les différences anatomiques entre le cerveau humain et celui des rongeurs. Ainsi, l’utilisation d’un modèle animal phylogénétiquement proche de l’Homme apparaît indispensable pour étudier les conséquences fonctionnelles de l’accumulation de protéines pathologiques. Des travaux récents montrant le caractère « infectieux » de certaines protéines ont ouvert la voie au développement de modèles chez le primate non humain. Ces modèles animaux permettent de reproduire les mécanismes d’agrégation protéique et d’induire des troubles moteurs et cognitifs similaires à ceux observés chez les patients même à des stades précoces de la maladie. Ils offrent également la possibilité d’un suivi longitudinal (au cours du temps) des lésions et du comportement grâce à des techniques d’imagerie non invasives directement applicables à l’Homme telles que l’IRM, les examens ophtalmologiques et la tomographie par émission de positons (TEP). L’objectif du projet est double: développer des modèles de maladies neurodégénératives chez le primate non humain par différentes approches (surexpression de protéines pathologiques humaines ou de protéines de synthèse), et suivre in vivo l’évolution des agrégats protéiques en lien avec l’apparition et la progression des déficits moteurs et cognitifs.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer de nouveaux modèles animaux plus robustes et pertinents d’un point de vue biologique des principales maladies neurodégénératives, telles que la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer ou la Paralysie Supranucléaire Progressive. L’utilisation de méthodes non-invasives similaires à celles utilisées dans les hôpitaux va permettre une meilleure application à l’Homme. Sur le long terme, ces nouveaux modèles animaux permettront de valider des thérapies innovantes ou des biomarqueurs diagnostiques ciblant ces maladies neurodégénératives.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés pour inoculer des protéines mutées synthétisées in silico ou isolées et amplifiées à partir de cerveaux de patient. . Un maximum de deux chirurgies de 4h maximum espacées de 6 mois sont prévues. Les animaux seront ensuite réévalués à 6 mois et 12 mois post injection. Les animaux seront évalues de la façon suivante à 3 temps espacés de 6 mois : - Comportement moteur spontané sans restriction alimentaire ou hydrique (1h/j/4j à 4 temps différents maximum). - Comportement cognitif sur écran tactile avec renforcement positif et sans restriction alimentaire ou hydrique (1h/j/4j à 4 temps différents maximum). - Imagerie IRM sous anesthésie générale pendant 1 à 3 heures maximum par session avec un minimum de 1 session et un maximum de 3 sessions espacées d’au moins une semaine par temps et un maximum de 4 temps. - Imagerie TEP sous anesthésie générale durant 2 à 4 heures maximum par session avec un maximum de 3 sessions espacées d’une ou deux semaines (voir renouvelée une fois à 6 mois) en fonction de la nécessité de réaliser des prélèvements sanguins (tous les traceurs TEP ne demande pas des prélèvements de sang pour l’interprétation des résultats). Un maximum de 3 temps 12 mois. - Imagerie ophtalmique sous anesthésie générale durant 1 à 3 heures maximum par session avec un maximum de 3 sessions espacées d’au moins une semaine et un maximum de 3 temps sur 12 mois. - Un prélèvement sanguin et de LCR sous anesthésie (15min).. Ces prélèvements sont couplés à l’un des examens d’imagerie pour réduire le nombre total d’anesthésies.

Impact sur les animaux

L’administration de vecteurs viraux ou des protéines entraine une douleur locale, de courte durée et légère. La délivrance de ces composés dans le cerveau entraine une douleur locale due à l’ouverture de la peau et la rétraction du muscle. Les anesthésies, qu’elles soient de courte durée ou plus longues, génèrent un risque d’hypothermie (stress thermique) si la température n’est pas contrôlée. De plus, la mise à jeun la nuit qui précède l’anesthésie et la manipulation des primates avant anesthésie pourraient induire un stress jusqu’à leur réveil, nourrissage et remise en groupe social. Les anesthésies de longue durée nécessitent la pose d’un cathéter veineux pour maintenir une anesthésie en continue et une intubation ce qui entraine une douleur locale, légère, et de courte durée. Pour les chirurgies et les examens d’imagerie, la nécessité d’immobilisation peut entrainer une nuisance locale transitoire au niveau du canal auditif jusqu’au retrait du cadre. Le maintien de l’œil ouvert lors des examens ophtalmologiques peut entrainer une douleur locale transitoire. Les anesthésies répétées peuvent induire une perte de poids, raison pour laquelle un suivi du poids sera réalisé tous les mois pendant toute la durée de l’expérience.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés à la fin du projet afin de pouvoir prélever leurs cerveaux. Des analyses histopathologiques et biochimiques seront réalisées afin de caractériser l'expression des protéines aberrantes dans les différentes régions du cerveau, ainsi que l’inflammation, afin de valider les résultats obtenus in vivo.

Remplacement

Pour ce projet, le recours à l’animal est nécessaire, car aucun milieu de culture, organoïdes ou système synthétique, ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité architecturale et fonctionnelle du système nerveux au point de prédire la cinétique d'accumulation des protéines anormales et leur impact fonctionnel. Par ailleurs, la réaction du système immunitaire suite à la surexpression d’une protéine doit aussi être évaluée dans un modèle animal proche de l’Homme pour augmenter sa valeur prédictive en termes de sureté et absence d’effets adverses.

Réduction

Une veille de la littérature est faite pour éviter de refaire des expériences déjà publiées. Le nombre d’animaux prévu dans ce projet a été réduit au minimum afin de pouvoir exploiter correctement les résultats. Un calcul statistique de puissance a été réalisé afin de dimensionner les groupes expérimentaux. De plus, le suivi longitudinal chez le même individu par des méthodes d’évaluation fonctionnelle non-invasives (imagerie et comportement) permet de réduire le nombre d’animaux en évitant l’euthanasie pour une confirmation histologique à différents temps, et sans compromettre la possibilité d’observer un effet pathologique significatif.

Raffinement

Afin de minimiser le stress et l’angoisse des animaux d’élevage importés pour des utilisations scientifiques, les primates seront acclimatés pendant au moins un mois en dehors de la quarantaine et avant la date de début du protocole. Le protocole d’anesthésie pour la réalisation des études comporte des analgésiques pour minimiser l’inconfort. La surveillance rapprochée suite aux anesthésies et plus particulièrement après les chirurgies à l’aide d’une grille d’évaluation péri-opératoire, l’évaluation du comportement moteur tous les 6 mois à l’aide d’une grille adaptée au modèle , le suivi régulier du poids, l’interaction avec la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA) et la mise en place de points limites clairs permettent de limiter les nuisances liées aux interventions. De plus, le nombre d’interventions ainsi que leur durée sont réduits au maximum. L’interaction positive au quotidien avec les personnels impliqués dans l’étude constitue aussi une forme d’enrichissement.

Choix des espèces

Le macaque adulte est retenu comme modèle d'étude sur les critères suivants : - il n'est pas possible de reproduire tous les signes pathologiques des maladies neurodégénératives dans les modèles cellulaires/organoïdes ou les modèles rongeurs, et par conséquent, il est difficile de prédire l'effet d'une thérapie chez l'Homme. - il permet d'intégrer des méthodes d'évaluation fonctionnelle, telles que l'imagerie, le comportement et les signes cliniques, qui peuvent être directement extrapolés à l'Homme dans une démarche translationnelle et utilisant des équipements d’imagerie et de tests comportementaux identiques ou similaires à ceux utilisés en clinique. - sa ressemblance anatomique et fonctionnelle du cerveau par rapport à l’Homme. La taille et la structure du cerveau permettent des analyses anatomiques et fonctionnelles strictement comparables à celles réalisées dans les mêmes conditions que chez les patients. Les animaux seront adultes (6 ans ou plus) pour mieux mimer le stade auquel les maladies neurodégénératives donnent lieu à des signes cliniques et pour éviter toute plasticité cérébrale présente chez les jeunes individus.

Dix macaques à longue queue subissent une même opération de quatre heures combinant une injection dans l'œil, une dans l'oreille interne et une par voie intraveineuse, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Tous seront tués pour analyser où se distribuent les vecteurs viraux testés. Le porteur reconnaît des risques d'hémorragie du vitré, de décollement de rétine et de troubles de l'audition et de l'équilibre. Il justifie le recours au primate par l'échec fréquent, chez le singe, des vecteurs sélectionnés sur la souris.

Objectifs

Le projet est une étude préliminaire visant sélectionner des vecteurs viraux AAV permettant d’apporter à un type de cellule une molécule thérapeutique sensible à la lumière. Cette sélection sera faite d’après l’affinité de ces vecteurs pour les organes cibles (oreille interne, rétine, estomac, cerveau), ainsi que leur distribution dans l’organisme. L’étude sera effectuée comme une étude de toxicologie pour évaluer tout effet potentiellement toxique. La sélection sera faite après leur administration intraoculaire, dans l'oreille interne et intraveineuse au cours d’une même anesthésie chez le macaque fascicularis. Les vecteurs viraux AAV sont dérivés d'un virus non pathogène et sont couramment utilisés dans la recherche biomédicale afin de développer des thérapies chez l’humain. Ils permettent une transduction efficace de nombreux types de cellules de mammifères et une expression génétique stable après un seul traitement d’un ou plusieurs gènes, ce qui permet de compenser un déficit génétique. Les protéines sensibles à la lumière sont utilisées pour développer la thérapie optogénétique, une méthode prometteuse pour compenser la perte des cellules de la rétine ou de restaurer l’audition via des implants intra-auriculaire chez des patients atteints de surdité. Les résultats obtenus permettront de sélectionner les vecteurs viraux les plus prometteurs dans le développement de thérapies optogénétiques chez l’humain.

Bénéfices attendus

Il permet de sélectionner les vecteurs viraux capbles de transduire efficacement dans les différents cellules et tissus cibles pour la réalisation d’études de toxicologie règlementaire prérequis aux essais cliniques de phase I, II et III chez l’humain

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale d'environ 4h et pendant laquelle une injection dans l'oeil, une injection dans l'oreille interne et une injection intraveineuse du produit testé seront effectués successivements. Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang effectués vigiles, dans un système de contention adapté, à raison d'un par jour au maximum sur 7 jours. Le prélèvement de sang dure quelques minutes. Un prétraitement sous forme d'une perfusion pourra être effectué selon des résutlats préliminaires, d'une durée maximal de 2h. Un isolement physique pendant la durée d'observation (7 à 15 jours) après les administrations est possible, si aucun animal compatible socialement et scientifiquement n'est disponible.

Impact sur les animaux

Quatre catégories de nuisances peuvent être provoquées chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises en compte de manière préventives pour réduire leur impact. 1)Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des primates. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaire mais cela peut néanmoins engendrer un stress chez ces espèces non domestiques 2) Liées à la chirurgie : un risque de nuisance modérée pour les animaux (inflammations, douleurs opératoires et post opératoire, etc) est possible 3) Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de sang, peut provoquer des lésions locales (hématomes) et un stress modéré des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire. De plus, même si ces effets délétères sont rares lorsque le geste est réalisé par un opérateur expérimenté, il existe un risque d’infection lors d’administration dans la cochlée ou l’œil. Enfin, dans de rares cas, l’injection intravitréenne peut entrainer une augmentation de la pression intraoculaire, hémorragie du vitré, déchirures et décollement de la rétine, inflammation intraoculaire et endophtalmie et l’administration intra cochléaire peut provoquer des troubles auditifs et de l’équilibre se traduisant par exemple par des maux de tête ou des nausées. 4) Liées à une toxicité du mélange de vecteurs testés : ce type de nuisances est difficilement estimable, mais semblent faibles selon les données scientifiques des études chez d’autres espèces. Si des effets toxiques apparaissent, ils seront liés à la biodistribution des vecteurs dont l’évaluation est le but de cette étude.

Devenir

Les animaux utilisés seront euthansiés pour procéder à une analyse de la distribution des vecteurs dans l'organisme.

Remplacement

Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d'obtenir toutes les informations collectées grâce à ce type étude, qui visent à sélectionner des variants de vecteurs viraux les plus efficaces pour poursuivre le développement de thérapies optogénétiques. Il faudra pour cela pouvoir modéliser un organisme entier, ce qui n'est pas réalisable pour le moment avec les méthodes alternatives existantes.

Réduction

L’utilisation d’un male et d’une femelle par lot est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation pertinente des données. L’administration successive des variants AAV chez les mêmes animaux a pour but de réduire le nombre d’animaux d’un facteur 3 à 4 (par rapport à un criblage séparé pour chaque voie d’administration), sans introduire de charge supplémentaire pour l’animal individuel. Les 3 voies d'administrations n'interfèrent pas ensemble car chaque vecteur est identifié par un code spécifique. Les principaux organes cibles sont les cellules cilliées auditives, la rétine, le cerveau et l'estomac, d’où les 3 vois d'administration.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 15-21 jours est respectée à réception des animaux, suivie de 1- 2 semaines de training. Les animaux bénéficient d’un programme de training par renforcement positif pour réduire le stress/favoriser la coopération (habituation aux systèmes de contention -boîtes taxi, chaises, gilets- et manipulations progressives reproduisant les gestes techniques de l’étude). Un programme d’enrichissements validé par la structure en charge du bien-être animal est appliqué quotidiennement pour garantir des conditions de vie optimales/minimiser les impacts des expérimentations. Les animaux sont hébergés collectivement, sauf exceptions (bagarre, blessure), avec des enrichissements adaptés à leurs besoins. L’isolement est validé par un vétérinaire et fait l’objet d’un suivi SBEA. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux compatibles pour réduire le stress/le risque de blessures liés à un réallotement. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter tout signe clinique anormal et prendre rapidement les mesures nécessaires (réhydratation, isolement pour soin). Toute anomalie est rapportée au vétérinaire, qui prescrit un traitement si nécessaire. Un suivi clinique et pondéral est en place, un fois par semaine pendant la phase de suivi après l’administration. Un vétérinaire est présent aux heures ouvrées, et une astreinte vétérinaire est disponible 24h/24 et 7j/7. À leur inclusion dans le projet, tous les animaux font l’objet d’un examen clinique par un vétérinaire pour s’assurer de leur bon état de santé et exclure ceux jugés inaptes. Une traçabilité des animaux/des actes est assurée pour permettre leur suivi et analyse lors des bilans rétrospectifs. Des systèmes de contention adaptés sont développés pour limiter les manipulations directes et la contention manuelle des primates vigiles (boîte taxi, chaise à contention). Les volumes prélevés/administrés respectent les guidelines vétérinaires. Concernant les administrations : ce sont des voies standard en médecine humaine. Elles seront effectuées sous anesthésie et analgésie par des chirurgiens expérimentés ayant pratiqués ces chirurgies chez l’humain et différents modèles animaux. La réalisation de l’ensemble des administration en une seule anesthésie limite l’accumulation des anesthésies et permet d’évaluer à modérée le degré de sévérité. Pour l'isolement des animaux, celui ci ne serait que physique, et l'ajout d'enrichissements spécifique sera mis en place dès la phase de réveil.

Choix des espèces

Le macaque fascicularis est une espèce reconnue pour son aptitude à prédire les effets pharmacologiques, indésirables et/ou toxiques de produits à visée thérapeutiques humains pour des produits thérapeutiques dont la cible est la plus proche de l’humain, ce qui est le cas pour les structures oculaires et auditives. De plus, les variants AAV sélectionnés sur des modèles murins pour ce type de thérapies se révèlent souvent peu efficace chez le primate humain et non humain, ce qui explique la nécessité de passer par un primate non humain pour les sélectionner plus finement. Il convient d’utiliser de jeunes animaux sains ; les macaques sont utilisés à partir de 2 ans, et jusqu'à 5 ans.