Primates

30 ouistitis vont être utilisés, gardés vivants et réutilisés d'une étude à l'autre, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des captures, des contentions, des séances d'IRM sous anesthésie et une biopsie de peau sous anesthésie, pour caractériser leurs capacités socio-cognitives et établir des corrélats cérébraux et génétiques. Le porteur classe les tests comportementaux, réactivité à l'humain et à la nouveauté, hors du champ des procédures réglementées, ne comptant comme telles que l'imagerie et la biopsie. Il affirme que le primate non-humain est "nécessaire" en neurosciences et que le recours à l'animal est "indispensable".

Objectifs

Ce projet vise à caractériser le phénotype des ouistitis hébergés dans notre établissement. Pour cela, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux. La plupart des tâches comportementales seront réalisées grâce à des dispositifs installés sur les cages d'hébergement. Ces tests ne sont pas considérés comme des procédures selon la définition de la Directive, car ils n'entraînent pas de stress/souffrance/angoisse supérieurs à ceux causés par l'introduction d'une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires. En parallèle de ces tests comportementaux, certains animaux pourront être amenés à être testés dans un dispositif en 3 dimensions ou dans un dispositif de réalité virtuelle, qui se situent en dehors de la zone d'hébergement et nécessitent donc une capture et un isolement des animaux. De plus, afin de caractériser au mieux nos animaux, nous pourrons être amenés à réaliser des imageries cérébrales anatomiques (IRM) sous anesthésie afin d'avoir un corrélat entre le comportement et les structures cérébrales. Pour compléter la caractérisation, nous réaliserons le génotypage des animaux étudiés grâce à une biopsie de peau, sous anesthésie.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux caractériser les capacités cognitives des ouistitis en captivité et d'établir des corrélats neuroanatomiques et génétiques avec ces capacités. Les observations des animaux dans leur groupe permettront de compléter cette caractérisation avec des informations sur l'organisation sociale des groupes.

Procédures

Les captures sont réalisées en quelques minutes.Si les animaux doivent être identifiés par rasage, la contention durera 5 minutes au maximum, environ une fois par mois (au maximum, en fonction de la visibilité de l'identification). Le transport dans les pièces de test durent entre 2 et 5 minutes. Chaque animal sera impliqué dans les tests comportements de réactivité à l’humain ou à la nouveauté sur la même période de temps, environ 5 fois/mois mais jamais dans la même journée. Ils resteront une heure au maximum dans les dispositifs. La procédure d’imagerie sera réalisée 2 fois (renouvelée une fois si les images recueillies ne sont pas correctement exploitables). Une session dure 3 heures environ (de la capture au réveil). L'isolement suivant le réveil dure environ 30 minutes. Une seule biopsie sera réalisée par animal (30 minutes d'anesthésie environ si réalisée en dehors d'une autre intervention).

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet les nuisances attendues seront liées - à la capture, le transport et l'isolement des animaux lors des tests dans les dispositifs extérieurs aux hébergements, - au stress lié à la présentation d'intrus/d'objets nouveaux, - au stress éventuel lié au retour dans le groupe, - à la capture et le rasage d'une petite partie de la queue ou du dos pour l'identification des animaux si cela s'avère nécessaire. - à la capture et l'anesthésie lors des biopsies de peau, - à des infections qui pourraient survenir suite à la biopsie, - à la capture et l'anesthésie et au retour dans le groupe pour les sessions d'IRM

Devenir

Les animaux seront gardés en vie pour poursuivre leur caractérisation comportementale et les observations pour déterminer les interactions sociales.

Remplacement

D’une manière générale le modèle primate non humain est nécessaire en neurosciences pour des raisons de proximité anatomiques, physiologiques et éthologiques avec l’Homme. Ce projet a pour objectif de caractériser les comportements socio-cognitifs chez le ouistiti, cette étude nécessite donc l'utilisation d'animaux en comportement, et ne peut pas être remplacé par une étude in silico ou par une étude comportementale chez l'Homme. L'utilisation d'animaux est donc indispensable.

Réduction

Des statistiques descriptives seront utilisées pour l'évaluation des comportements et pour calculer un score pour les tests de réactivité (comptages, pourcentages, moyennes et modes) et des comparaisons pourront être effectuées entre individus. Ces données pourront être utilisées comme données contrôle pour des études ultérieures. Le nombre d'animaux utilisés est estimé à N=30 sur 3 ans. Ce nombre correspond au nombre d'individus hébergés dans notre animalerie et du turn-over potentiel. Le projet vise à caractériser l'ensemble des individus de notre colonie.

Raffinement

Afin de réduire le stress lié à la manipulation des animaux, des visites préalables seront réalisées pour que les animaux s'habituent à l'expérimentateur. En ce qui concerne la capture, deux solutions sont possibles et seront choisies en fonction de la tolérance des individus au contact humain : soit ils seront capturés à la main ou au filet, soit ils seront conditionnés à entrer dans une boîte de transport. Les observations comportementales ne pourront être réalisées et correctement interprétées qu'à la condition que les animaux ne présentent pas un niveau de stress important. Si les animaux sont capturés à la main/au filet, de la gomme arabique leur sera systématiquement proposée immédiatement après la capture. Généralement, lors des premières captures, les animaux peuvent vocaliser (cris d'alerte/cackles) mais ce comportement peut être réduit en les plaçant dans l'obscurité (creux de la main), ou en leur proposant des friandises. Ce comportement indicateur de stress disparaît en général lors des captures suivantes si aucun acte pouvant entraîner une gêne n'est pratiqué lors des premières. Si ce comportement venait à se prolonger, la capture serait alors systématiquement réalisée via une boîte de capture, qui sera ensuite placée dans une boîte de transport qui sera elle-même recouverte de tissu opaque lors du transport dans la pièce de test. De la même façon, une fois les animaux capturés à la main ou au filet, ils seront placés dans cette boîte. Les imageries seront réalisées sous anesthésie générale ainsi que les biopsies de peau. Dans la mesure du possible ces biopsies seront réalisées lors d'une anesthésie prévue par ailleurs (session IRM ou acte zootechnique - pose de puce ou contrôle sanitaire). La réintroduction dans le groupe après toute sortie sera monitorée afin de s'assurer qu'aucun conflit ne survienne. Dans le cas où des tensions seraient détectées une surveillance accrue serait mise en place.

Choix des espèces

Nous avons choisi le ouistiti pour les similarités qu'il présente avec l’Homme en terme de structure sociale et de capacités sociales (prosocialité) et cognitives. Le ouistiti est un modèle émergent dans le domaine des neurosciences, il est important de caractériser au mieux ses comportements cognitifs, ses interactions sociales, ainsi que son tempérament en lien avec le génotype des individus afin de mieux connaître l'espèce et de pouvoir raffiner les procédures expérimentales qui impliquent des individus de l'espèce. Tous les individus de notre colonie seront observés et étudiés, quel que soit leur stade de développement. En effet, cela permettra de suivre les modifications comportementales lors de la caractérisation de la colonie. Les tests comportementaux nécessitant un isolement des animaux ne débuteront pas avant 18 mois (âge adulte). Une session d'imagerie pourrait être réalisée avant atteinte de l'âge adulte afin d'étudier d'éventuels changements au cours du développement.

68 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 4 étant réutilisés et les autres tués. Ils sont infectés par le SIV, l'équivalent simien du VIH, reçoivent un anticorps et un traitement antirétroviral quotidien pendant dix-sept à vingt-trois semaines, avec des prélèvements répétés de sang, de ganglions, de moelle osseuse et des biopsies rectales sous anesthésie. Le porteur indique une phase aiguë avec fièvre et baisse des lymphocytes, et justifie la mise à mort par la mesure de la charge virale dans les tissus profonds. Il affirme que le primate est "le seul modèle" permettant d'étudier cette infection et qu'aucune méthode alternative n'est possible.

Objectifs

A ce jour, il n’y a aucun vaccin efficace contre le Sida, principalement en raison d’un manque de compréhension des mécanismes utilisés par le VIH pour échapper au système immunitaire. La reconnaissance d’un pathogène par une population cellulaire appelée cellules dendritiques, est une étape clé pour initier une réponse immunitaire efficace. Or l’infection par le VIH induit des dysfonctions des cellules dendritiques. Des expériences in vitro montrent qu’un récepteur immunitaire (LILRB2), qui est exprimé à la surface des cellules dendritiques, est responsable de ces dysfonctions. Ce récepteur peut intéragir avec les molécules de présentation et ainsi induire un contrôle de la réponse immune... Le VIH utiliserait les propriétés de ce récepteur pour déréguler les fonctions des cellules dendritiques. Néanmoins la démonstration du rôle de l’interaction de LILRB2 avec ses ligands in vivo au cours de l’infection par le VIH n’a jamais été faite. L’objectif de ce projet vise à caractériser, in vivo, le lien entre le récepteur LILRB2 et les dysfonctions des cellules dendritiques induite par le VIH. Aucun dispositif cellulaire ne pouvant reproduire la complexité d’une réponse immunitaire in vivo, il est nécessaire de recourir à des modèles animaux. Le primate non humain (PNH) a été choisi pour ce projet puisque c’est le seul modèle animal permettant l'étude de la physiopathologie de l'infection par le SIV, virus responsable du SIDA dans le modèle macaque. A cet égard, nous avons développé un anticorps à visée thérapeutique capable de bloquer la fixation du récepteur LILRB2 sur les moléculesde CMH-I. Cet anticorps a été développé pour fonctionner dans le modèle macaque et l’Homme afin de faciliter son transfert vers une application clinique. Différents protocoles seront appliqués. Ceux-ci incluront l’injection de l’anticorps seul ou en combinaison avec des antirétroviraux en phase précoce ou chronique de l’infection. Les résultats de cette étude pourraient ouvrir la voie vers la mise en place de nouveaux protocoles cliniques visant une rémission des patients infectés par le VIH.

Bénéfices attendus

Le suivi de l’évolution de la charge virale SIV, virus responsable du Sida chez le modèle macaque, permettra de comprendre si un anticorps monoclonal dirigé contre un récepteur présent sur les cellules immunitaires (LILRB2) à visée thérapeutique peut améliorer les réponses immunitaires et conduire à un contrôle de du virus.

Procédures

procédures sous anesthésies: - Injection unique d’anticorps. (entre 5 et 10 min) - Infection SIV (une occurrence). - Anesthésie des animaux lors des prélèvements. La durée d’anesthésie pour les prélèvements est inférieure à une heure - Différents Prélèvements sanguins,de ganglions, lavages broncho-alvéolaires, biopsies rectales et moelle osseuse seront effectués à 4 reprise chacun. La durée du prélèvement peut aller de 2 min (LBA) à 20 min (biopsies ganglions). Procédure sans anesthésie : - Traitement anti-rétroviral injecté quotidiennement du début de traitement à l’euthanasie (moins d’une minute par injection). Cette période durera entre 17 et 23 semaines, en fonction de si le traitement commencera en phase précoce ou en chronique

Impact sur les animaux

Dans les premiers jours de l’infection (phase aiguë), des effets cliniques transitoires comme de la fièvre ou une baisse du nombre de lymphocytes T CD4, peuvent apparaitre pendant quelques jours.

Devenir

Nécessité d’euthanasier les animaux exposés au SIV pour l’évaluation de la charge virale tissulaire et des réponses immunitaires dans les tissus profonds.

Remplacement

Aucune méthode alternative n’est possible pour étudier les effets de l’anticorps monoclonal sur les réponses immunitaires contre le SIV in vivo. Cette étude sur le long terme ne peut être réalisée que sur des animaux vivants.

Réduction

Quatre macaques pour l’étude pharmacodynamique et huit macaques par groupe d’animaux infectés par le SIV sont les nombres d’animaux minimum nécessaires pour déterminer si les variations observées sont bien dues aux conditions expérimentales et non à des variations biologiques inter-animal. Comme mentionné précédemment, ce nombre permet d’avoir des résultats statistiques en utilisant des tests non paramétriques adaptés à des petits échantillons.

Raffinement

- Les injections d’anticorps seront réalisées sous anesthésie. De même les prélèvements de sang, de ganglion, de moelle osseuse et les lavages broncho alvéolaires seront également réalisés sous anesthésie. Les animaux recevront 1 à 2 fois par semaine des dispositifs d’alimentation supplémentaire type pebble toy ou minibrik popcorn et une fois par mois des sachets surprises contenant des friandises et des morceaux de fruits. Des jouets à ronger et à manipuler seront mis à disposition. Enfin, un dispositif de renforcement de contact positif est mis en place via la distribution de fruits sec et/ou de graines. Les animaux qui recevront des traitements antirétroviraux journaliers par voie sous cutanée, seront entrainées préalablement (training) à la contention afin de réduire le stress et les mouvements de l’animal lors de l’injection sous cuntanée. Suite à l’injection, du renforcement de contact positif sera réalisé par l’expérimentateur. Une rotation des sites d’injection sera opérée (haut, milieu, basn droite, gauche) permettant ainsi d’avoir 6 sites en rotation quotidienne.

Choix des espèces

Pour cette étude sur le long terme, le choix s’est porté sur le modèle PNH (Primate non humain) macaque pour plusieurs raisons : 1/ les PNH sont physiologiquement plus proches de l’Homme 2/ les PNH sont l’un des seuls modèles animaux permettant la caractérisation de la réponse immune au SIV: les réponses immunitaires sont similaires à celles de l’Homme, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire sont disponibles et maitrisés. 3/ le gène LILRB2 est conservé chez les primates et Il n’existe pas de récepteur immunitaire équivalent chez les rongeurs. 4/ l’étude se fera sur des animaux adultes qui possèdent un système immunitaire mature.

Les 70 rats de ce projet portent un gène ABCA4 non fonctionnel, une lignée de la maladie de Stargardt, et les 6 macaques à longue queue, des primates, sont sains. Ces 76 animaux non-humains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Outre une injection de vecteurs viraux sous la rétine des deux yeux, chaque macaque peut subir en six mois jusqu'à 15 séances d'imagerie sous anesthésie, avec prise de sang, et jusqu'à 8 tests de la fonction rétinienne, eux aussi sous anesthésie, et le porteur indique que ces anesthésies répétées peuvent stresser rats et macaques. Il affirme qu'une toxicité immunitaire liée aux intéines ne peut être mise en évidence chez les rongeurs, et qu'il est donc "nécessaire de passer au modèle macaque". Tous sont tués pour prélever sang, yeux, foie, rate, nerf optique et cerveau.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie génétique liée à des mutations sur le gène ABCA4. Elle a une prévalence de 1 pour 8000 à 10000 personnes, et se traduit par une dégénérescence rétinienne avec une cécite diurne, qui impacte à la fois les hommes et les femmes à partir de l’adolescence. La protéine ABCA4 est un transporteur essentiel pour le métabolisme des photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine. En absence d’ABCA4, on observe une accumulation de déchets métaboliques dans les photorécepteurs, qui finissent par dégénérer. Actuellement, il n’existe pas de traitement efficace pour cette maladie. La thérapie génique, qui consisterait à venir ramener une copie fonctionnelle du gène ABCA4 dans les cellules rétiennes, est une approche prometteuse. Mais une limite de cette approche est que le gène ABCA4 est trop grand pour être intégré dans les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV), vecteurs de choix pour transférer un gène dans la rétine. Une approche alternative consiste à délivrer deux vecteurs rAAVs, chacun porteur d’une moitié du gène ABCA4, associé à des structures spécifiques appelées ‘intéines’. Les deux moitiés de la protéine ABCA4 sont produites dans les cellules transduites, et une ligation s’effectue grâce aux intéines pour reconstruire une protéine ABCA4 entière. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité et la potentielle toxicité d’un traitement de thérapie génique basé sur l’utilisation de vecteurs recombinants «AAV-ABCA4-intéine» pour la maladie de Stargardt. L’évaluation de l’efficacité de ces vecteurs sera réalisée après injection sous-rétinienne chez le rat ABCA4-/-, modèle de la maladie de Stargardt dans lequel le gène ABCA4 est non fonctionnel. L’objectif sera de réduire le taux de déchets métaboliques dans la rétine, après expression de la protéine complète d’ABCA4, tout en vérifiant qu’une structure correcte de la rétine est maintenue. En parallèle de cette étude d’efficacité chez ce modèle de rat, nous évaluerons le risque de toxicité des «AAV-ABCA4-intéine» chez le macaque sain. En effet, les intéines étant des éléments protéiques exogènes, étrangers au système immunitaire, elles pourraient induire une toxicité immunitaire. Une telle toxicité ne pouvant pas être mise en évidence chez les rongeurs (connus pour tolérer un certain nombre de protéines exogènes, après transfert avec un vecteur AAV), il est donc nécessaire de passer au modèle macaque pour répondre à cette question.

Bénéfices attendus

Le but de cette étude est d’évaluer l’effet thérapeutique des vecteurs les vecteurs «AAV-ABCA4-intéine» après injection sous rétinienne chez des rats pour lesquels le gène ABCA4 n’est pas fonctionnel et de valider l’absence de toxicité de cette approche thérapeutique chez le macaque. L’évaluation in vivo des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » nous permettra de statuer sur la faisabilité et les bénéfices d’une telle approche chez les patients. De plus, si cette approche est validée pour le gène ABCA4, elle pourra potentiellement être transposée pour soigner d’autres maladies génétiques ayant un gène trop grand pour être inséré dans un seul vecteur AAV.

Procédures

(i) Injection sous-rétinienne des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » dans les 2 yeux : Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 2h maximum pour les macaques. (ii) Imagerie rétinienne : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 4 fois le premier mois puis maximum deux fois par mois, soit un maximum de 15 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 20 minutes maximum pour les rats et 1h pour les macaques. (iii) Test de fonctionnalité de la rétine : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 2 fois le premier mois puis maximum une fois par mois, soit un maximum de 8 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 1h30 pour les macaques. (iv) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois avant l’injection des vecteurs puis une fois par mois post-injection, soit au maximum 4 fois pour les animaux gardés 3 mois. Pour les macaques lors des mêmes anesthésies que les imageries rétiniennes soit un maximum de 15 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée du geste 10 minutes maximum pour les deux espèces.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection sous rétinienne. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. Les animaux peuvent être stressés par les anesthésies répétées mais celles-ci seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur. La récupération devrait être rapide car les animaux seront soit sous anesthésie.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie, rate, nerf optique, cerveau) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.

Remplacement

La rétine, structure complexe composée de multiples couches de neurones et cellules nourricières, ne peut être reconstituée parfaitement in vitro. Il existe aujourd’hui des protocoles modélisant la rétine à partir de cellules souches différentiées, mais l’interaction complexe du cycle visuel ne peut pas être testée in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la pathophysiologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme. D’autre part, la pathologie de Stargardt est induite par une toxicité liée au métabolisme de la vitamine A présent dans l’œil à la naissance et supplémenté via la circulation choroidale. Cet effet systémique de la vitamine A ne peut pas être reproduit in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience précédente de précédents projets, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de ces tailles, que ce soit avec le modèle de rat ABCA4-/- ou le macaque sain. Pour les rats ABCA4-/-, nous nous laissons la possibilité d’inclure entre 1 et 3 animaux supplémentaires par groupe, en cas d’échec des injections sous-rétiniennes. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi pour les analyses quantitatives et généré par une analyse de puissance (puissance de 80% et significativité de 5%). Le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec le vecteur thérapeutique est plus important que le nombre d’animaux inclus dans les groupes non injectés ou injectés avec un tampon, pour tenir compte du fait d’une certaine variabilité de l’efficacité thérapeutique. Avec 10 animaux (20 yeux) maximum par groupe nous pourrons réaliser un certain nombre d’analyses post-mortem avec des analyses statistiques pertinentes. Le suivi longitudinal non invasif par imagerie de la rétine permettra aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour les analyses chez le macaque le nombre d'animaux utilisés est réduit à son strict minimum (n= 4 animaux injectés avec le vecteur, et n=2 animaux injectés avec un tampon, avec injections bilatérales). Malgré tout, nous savons que ce nombre permettra d'apporter les réponses aux questions posées dans cette étude. Les facteurs d’évaluation principaux seront la quantification de l’expression du gène ABCA4, la présence ou non s’il y a une réponse immunogénique contre ABCA4 et une analyse statistique sur les amplitudes des résultats d’électrorétinogrammes (analyse de la réponse électrique de la rétine). Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels pour les rats, et dans un milieu enrichi comprenant des enrichissements alimentaires, physiques, sonores et visuels variés pour les macaques. L’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. L'application de critères d'arrêts et un suivi des animaux à l’aide de grilles de score, d’un arbre décisionnel nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés voir de décider d'une mise à mort prématurés.

Choix des espèces

Le modèle rat est un très bon modèle préclinique pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique avec un œil suffisamment large pour permettre une distribution uniforme du fluide sous la rétine. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats transgéniques pour la maladie de Stargardt. Nous avons validé que ce modèle montre le phénotype attendu avec des défauts métaboliques des rétinoïdes dans la rétine. Mais les études menées chez les rongeurs ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une organisation de l’œil comparable à celle de l’homme, comme c’est le cas chez les cercopithécidés. Le choix de macaca fascicularis se trouve pleinement justifié par le fait que l’on trouve dans cette espèce une organisation du système visuel, une dimension et une structure du globe oculaire mais également de la rétine, avec la présence d’une macula (absente chez les rongeurs) ainsi qu’un système immunitaire comparable à ceux de l’homme.

6 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés en vie et réutilisés. Chaque animal subit sous anesthésie une injection sous-cutanée, seize prélèvements sanguins sur cinq semaines et deux biopsies de peau, pour comparer une nouvelle formulation d'un médicament anticancéreux à un traitement de référence. Le porteur mentionne des hématomes et une inflammation possible au site d'injection. Il présente le motif du projet comme économique, proposer aux hôpitaux une alternative "à moindre coût", et affirme qu'aucun modèle autre que le primate ne convient.

Objectifs

Le cancer du sein est une maladie qui touche de nombreuses femmes, une sur huit sera confrontée à cette maladie au cours de sa vie. Seules 20 à 30 % des cas, peuvent bénéficier d’un traitement par un anticorps commercialisé sous le nom d’Herceptin®. Il a transformé la maladie cancéreuse aiguë en maladie chronique pour une majorité de patiente. Actuellement, le schéma thérapeutique consiste en plusieurs perfusions intraveineuses toutes les 3 semaines sur 1 an. Le 2 septembre 2013, une nouvelle voie d’administration, la voie sous-cutanée a été autorisée par la Commission de l’Union européenne pour le traitement de ce type de cancer. Cette nouvelle voie est très prometteuse en termes de confort pour la patiente et de gain de temps pour le personnel hospitalier. Depuis, des médicaments biosimilaires (équivalents des médicaments génériques dans le cas des petites molécules) sont apparus sur le marché. Ces derniers ne sont actuellement disponibles que pour des traitements par voie intraveineuse. Avec l’arrivée des biosimilaires IV, les cliniques/hopitaux sont revenus pour des questions de coûts aux injections IV au détriment de l’utilisation de la forme sous-cutanée d’Herceptin. Dans ce projet, nous proposons de développer une formulation sous-cutanée pour la diffusion progressive de l’anticorps, permettant donc de proposer une alternative à moindre coût pour les cliniques/hôpitaux, mais améliorant grandement le confort des patientes tout en conservant la même efficacité. Dans ce projet, 6 macaques cynomolgus seront utilisés et répartis en deux groupes (anticorps testé versus traitement de référence).

Bénéfices attendus

Si ce projet démontre que l’utilisation de cette nouvelle formulation d’un médicament biosimilaire est équivalente à l’utilisation du médicament de référence, cela permettra aux patientes atteintes d’une forme spécifique de cancer du sein de bénéficier du même confort de traitement (administrations sous-cutanées versus intraveineuses répétées) à un coût beaucoup moindre, donc une meilleure accessibilité du traitement pour les patientes.

Procédures

Les procédures réalisées sur chaque animal (sous anesthésie générale) seront : - 1 injection sous-cutanée - 16 prélèvements sanguins sur 5 semaines (semaine 1 : 10 prélèvements, semaine 2, à 4 : 2 prélèvements/ semaine espacés au moins d’un jour) - 2 biopsies cutanée Chaque intervention durera au maximum 20 minutes.

Impact sur les animaux

Les dommages attendus seront principalement liés aux injections de l’anesthésique et aux conséquences des prélèvements sanguins répétés (potentiels hématomes aux sites de prélèvement) et d’une biopsie (plaies en cicatrisation). L’injection du traitement pourrait entraîner une possible inflammation au site d’injection.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à la fin du projet. Ils sont examinés par un vétérinaire pour vérifier qu’ils ont recouvré leur état de santé en fin de protocole.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative au model primate non-humain pour cette expérimentation. Les modèles rongeurs utilisés précédemment ont montré la non-toxicité de l’élément d’essai mais ne permettent pas d’injecter un volume suffisant similaire à celui utilisé chez l’Homme et permettant d’étudier la biodégradation du gel. Il en est de même avec les modèles sous-cutanés de peau humain ne permettant pas l’injection d’un volume suffisant pour valider la biodégradation du gel. De plus, les primates non-humains possèdent un récepteur de l’anticorps testé similaire à celui de l’humain.

Réduction

Dans ce projet, le nombre d’animaux utilisés a été réduit à son maximum pour répondre aux questions posées. Compte-tenu de l’apport des études préliminaires réalisées sur le modèle rongeurs, 3 animaux par groupe seront suffisants pour obtenir les données de pharmacocinétique, de biodégradation et évaluer la réponse inflammatoire (au niveau du site d’injection) et au niveau global (dans la circulation sanguine). Ce projet représente une phase préliminaire aux études réglementaires utilisant un effectif plus important.

Raffinement

- Hébergement : les animaux seront hébergés au minimum par paire. Un programme d’enrichissement spécifique à l’éspèce et à l’âge des animaux utilisés est mis en place sur tout le site, et supervisé par le responsable du bien-être animal. Les enrichissements sont structurels (perchoirs, balançoire…), alimentaires (graines pour fourragement, fruits, friandises…) ou consistent en l’apport d’objets de manipulation changés régulièrement. - Procédures : les animaux seront anesthésiés pour chaque intervention et seront sous couverture analgésique pour les biopsies. - Des points limites ont été définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance des animaux, évaluée grâce à une grille de scoring

Choix des espèces

Dans ce projet, des macaques cynomolgus seront utilisés, car ils possèdent un récepteur de l’anticorps testé similaire à celui de l’humain. Ce projet ne justifie pas d’utilisation d’animaux d’un stade de développement particulier. Néanmoins, les animaux seront âgés de plus de 18 mois (animaux juvéniles ou adultes).

60 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'injection de vecteurs viraux dans le cerveau, puis des prélèvements mensuels de sang et de liquide céphalo-rachidien, avant d'être tués par perfusion intracardiaque pour prélever leur cerveau. Le projet valide des outils de thérapie génique avant un passage chez l'humain. Le porteur justifie le recours au primate en invoquant explicitement l'"éthique spéciste" qui interdit ces approches invasives chez l'humain, et la proximité anatomique du macaque avec l'espèce humaine.

Objectifs

En raison du vieillissement progressif de la population et de l'absence de traitements curatifs, le nombre de personnes souffrant de maladies neurodégénératives (maladie de Parkinson, Alzheimer et autres démences, sclérose latérale amyotrophique…) a considérablement augmenté au cours des dernières décennies et devrait croître de manière régulière dans les années à venir. Qu’elles soient génétiques ou acquises, un grand nombre de ces affections pourraient bientôt bénéficier de l’apport de nouvelles stratégies innovantes basées sur la thérapie génique. Cette approche utilise des virus modifiés ; ils ont perdu leur pouvoir de se multiplier mais peuvent apporter après modification de leur génome, dans des cellules ou des organes malades, un gène réparé, ou des molécules qui soignent. On parle alors de vecteurs viraux. La famille des virus adéno-associés (AAV) sont des outils de thérapie génique très utilisés. De nombreuses recherches « in vitro » sont menées pour améliorer sans cesse leur efficacité en termes de quantité /qualité produite, de tolérance, de diversité de molécules rapportées, de ciblage des cellules au sein des organes à soigner. La phase suivante de validation de ces outils sont des études « in vivo » chez l’animal pour vérifier leur non toxicité, leur tolérance, leur diffusion, leur capacité d’entrée dans les cellules cibles (on parle de transfection). Pour le cerveau, la voie la plus efficace d’administration de ces vecteurs viraux pour l’heure est l’injection intracérébrale par stéréotaxie. La mesure des effets des vecteurs viraux se fait ensuite par des analyses biochimiques sur de prélèvements biologiques puis cellulaires après leur mise à mort pour prélever le cerveau. Les études précliniques nécessitent de valider ces outils chez le Primate Non Humains (PNH). Le but de ce projet est de valider dans le cadre d’une activité pré-clinique de service chez le macaque de nouveaux vecteurs viraux qu’ils soient porteurs d’une molécule « contrôle » fluorescente ou de protéines d’intérêt à visée thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensable avant les essais chez l’homme. Les expérimentations sont essentiellement menées sur l’animal. En effet, il n’est pas envisageable d’administrer un nouveau composé à l’homme sain ou malade compte tenu des risques non connus susceptibles d’apparaître. A terme, nous souhaitons démontrer l’efficacité et la tolérance d’outils de thérapie génique chez un modèle de grand animal, pour demander par la suite une autorisation d’essai clinique chez des patients atteints de formes précoces et sévères (formes génétiques en particulier) des maladies neurodégénératives.

Procédures

Procédure chirurgicale: 1 par animal, la durée de la chirurgie est de 60-120 min en fonction du nombre de structures ciblées et leur volume d’injection. Prélèvement sanguins: 2 par animal mensuel et LCR (liquide céphalo-rachidien): 1 par animal mensuel, la durée d'un prélèvement est de environ 15 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie ou au prélèvement biologique fait sous anesthésie générale. Pour la chirurgie: stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible, infection au niveau des points de sutures. Pour les prélèvements (sang, LCR) : : stress de la contention et de l’anesthésie, stress, hématome, douleur possible. L’effet l’administration des AAV et de leur toxicité possible est l’objet de ce projet, même si les AAV sont réputés pour leur faible toxicité, une surveillance des paramètres biologiques et comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de les détecter.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque aux temps expérimentaux définis pour étudier l’efficacité du traitement sur le modèle animal pathologique. Le cerveau et éventuellement d’autres tissus seront alors prélevés puis mis à disposition pour réaliser les analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité pré-clinique de service. Des études préliminaires réalisés chez le rongeur ont permis de valider la diffusion et la non-toxicité des vecteurs AAV. Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du PNH, vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique « spéciste » actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs) ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; 3) Enfin, dans le cadre des modèles de maladies neurodégénératives, l’objectif à terme (bien que non décrit dans le présent projet) est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (moteur, cognitif) de ces affections qui en tant que telles ne peuvent être étudiées sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale, de répertoire comportemental etc.) pour étudier les manifestations comportementales et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Enfin, dans les tests pré-cliniques que nous abordons et dont le but est de se poursuivre chez l’homme, le recours exclusif au rongeur ne peut être satisfaisant. Dans bien des cas par exemple les immunothérapies (ce qui est le cas avec les AAV) testées ne peuvent interagir qu’avec des tissus provenant de PNH, ce qui impose souvent l’utilisation du modèle primate.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques avec un nombre évalués à 3 études par an, comprenant 4 animaux par étude (soit un total de 60 animaux sur 5 ans). Nous bénéficions d’un plateau de haute technicité (cadre stéréotaxique, Imagerie, stabulation) nous permettant la manipulation des animaux dans les meilleures conditions (chirurgie, déplacement…) et une grande reproductibilité dans les différents modèles ce qui limite le nombre d'animaux. Les composés testés en traitement sur nos PNH auront été préalablement testés in vitro par nos clients, pour déterminer les doses à utiliser et s'affranchir d’éventuels effet toxiques. Enfin, les prélèvements cérébraux réalisés à chaque fin d’étude s’ils sont destinés de prime abord pour des études histologiques visant à confirmer l’efficacité au niveau cellulaires des différents traitements, peuvent également renforcer notre banque de tissus (cérébrothèque). Ceci afin de proposer à la communauté scientifique des tissus de PNH et ainsi réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties, et des dispositifs de raffinement (monitoring cardiaque et respiratoire, maintien de la température corporelle, asepsie). Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’état des animaux est observé et quantifié selon des critères objectifs permettant d’établir des scores de bienêtre et de déterminer des points limites à partir desquels les actions adaptées sont menées (des massages, le maintien de l’animal au chaud autour d’une couverture, la modification de la nature et le change plus régulier de la litière, l’augmentation de la fréquence des pesées, le gavage avec des complément alimentaire, lait enrichi et jus sont quelques outils dont nous disposons en dehors de la sphère médicamenteuse pour améliorer l’état de santé de nos animaux).. Pour un score sup à 10, le sujet sort immédiatement du protocole d’expérimentation, pour réaliser les traitements et les soins nécessaires en accord avec le vétérinaire jusqu’à son rétablissement (score inférieur à 5). Au-delà de 15 , la décision d’euthanasie compassionnelle sur avis vétérinaire est prise. Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adapté au poids de l’animal, Les prélèvements de LCR sont faits sur animaux sédatés. Les prélèvements de sang sur animaux vigiles avec une légère contention. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée. L’échelle de bien être est là aussi utilisée pour estimer la gêne occasionnée par ce geste. Les animaux seront hébergés ensemble, dans une structure spécialement agrée pour l’hébergement et l’utilisation des PNH en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (volière, nourriture variée, « jouet », fond sonore, etc.).

Choix des espèces

L’utilisation des vecteurs viraux a déjà fait l’objet d’une validation préalable chez les rongeurs (rats, souris) tant chez des modèles naifs que sur des modèles de maladies neurodégénératives. Bien que notre projet n’implique pas la modélisation d’une maladie neurodégénérative per se chez le PNH, l’utilisation de la thérapie génique en tant qu’expérience préliminaire permettra une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques sous-tendant les déficit mnésiques et/ou moteurs observés dans ces pathologies. A terme, nous souhaitons démontrer l’efficacité et la tolérance de notre stratégie de thérapie génique chez un modèle de grand animal, pour demander par la suite une autorisation d’essai clinique chez des patients atteints de formes précoces et sévères (formes génétiques en particulier) de ces maladies. Enfin, ce passage par le PNH avant la clinique relève d’un principe éthique visant à protéger les patients, en démontrant la faisabilité de l’approche thérapeutique de l’espèce la plus proche de l’homme. Les maladies neurodégénératives sont des maladies chroniques progressives qui touchent le système nerveux central. Leur fréquence augmente avec l'âge chez l’homme. Afin d’être au plus prêt de cet état, dans ce projet, les animaux utilisés seront donc adultes.

Des babouins sont immunisés contre trois candidats médicaments développés par un partenaire, pour obtenir de leur sang des anticorps qui serviront de contrôle positif dans les tests réglementaires de ce partenaire, chez le singe comme chez l'humain. 6 babouins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, deux au plus par groupe. Chacun reçoit deux injections intradermiques du candidat médicament, à J0 et J21, et subit deux prises de sang, à J0 et J31, chaque fois sous anesthésie légère, hébergé pendant le protocole dans une cage individuelle accolée à celles de ses congénères. Le porteur qualifie cette immunisation de "vaccination non invasive". Les babouins peuvent venir d'un protocole précédent, et ils sont gardés en vie à l'issue pour intégrer un autre protocole de niveau léger ou modéré, après avis du vétérinaire.

Objectifs

Notre partenaire, développe des candidats médicaments , dont l’objectif thérapeutique est soit dans le traitement de cancer soit dans des indications en auto-immunité. Trois candidats médicaments (CM) sont actuellement en développement et sont prévus d’être introduits en clinique dans les 2 ans. Dans le cadre du développement de tests permettant la détection et la mesure des anticorps dirigés contre les candidats médicaments (anti-CM-1, anti-CM-2 et anti-CM-3), produits chez le primate et chez l’homme, tests utilisés respectivement lors d’études précliniques réglementaires effectuées chez le primate et dans le cadre des études cliniques réalisée chez l’homme, notre partenaire désire générer des anticorps polyclonaux de primate qui seront utilisés comme contrôle positif dans ce test. Ces anticorps peuvent être obtenus par vaccination non invasive de primates, suivie d’une prise de sang limitée au volume éthiquement acceptable, à partir duquel seront purifiés les anticorps.

Bénéfices attendus

Les anticorps produits chez le primate dans ce protocole seront purifiés et serviront de contrôle positif dans le tests d'anticorps anti-candidat médicament, utilisés respectivement lors d’études précliniques réglementaires effectuées chez le primate et dans le cadre des études cliniques réalisée chez l’homme.

Procédures

Injection du candidat médicament (30 min) à J0 et à J21 sur animaux sous anesthésie légère, et prélèvement de sang en petit volume (30 min) à J0, et à J31, sur animaux sous anesthésie légère.

Impact sur les animaux

Les animaux reçoivent deux injections intradermiques lors de l’immunisation, qui peut induire une légère inflammation cutanée, et donc une légère douleur (type vaccin). Nous n'attendons pas d'effet indédirable suite aux 2 prélèvements sanguins espacés d'un mois (petits volumes).

Devenir

Les animaux issus de cette procédure peu invasive, de sévérité modérée, seront gardés en vie, et pourront intégrer un autre protocole de classe légère ou modérée en fonction de la compatibilité des objectifs scientifiques et uniquement après avis du vétérinaire référent.

Remplacement

Il n'existe pas de remplacement possible pour ces expérimentations qui répondent cependant aux exigences de réduction et de raffinement. L'alternative non animale serait d’utiliser des anticorps humains anti-candidat médicament (anti-CM) comme contrôles positifs dans les tests d’immunogénicité. Cependant, ces molécules ne sont pas disponibles. Il est nécessaire d’obtenir des anticorps anti-CM comme contrôles positifs dans les tests d’immunogénicité, qui puissent être reconnus par des anticorps secondaires anti-humains. Or des anticorps de ce type ne peuvent pas être obtenus in vitro, car ils ne seraient pas reconnus par les anticorps secondaires anti-humains. Bien que l’utilisation de tels anticorps anti-CM déjà disponibles ait été envisagée, elle ne permettait pas la détection d’anticorps anti-CM humains. Cela aurait invalidé le test, qui présente un caractère réglementaire. Ainsi l'immunisation d’animaux dont les anticorps peuvent être reconnues par des anticorps humaines doit être utilisée à cette étape du développement.

Réduction

Le nombre maximum de 2 animaux par groupe est suffisant pour la production et la purification d’une quantité suffisante d’anticorps polyclonaux. Cependant si l'immunisation d'une seul animal satisfait à la quantité et à la qualité des anticorps produits, le second animal ne sera pas utilisé. Aucun test statistique n’est nécessaire. D’autre part, de façon à réduire le nombre d’animaux utilisés et dans la mesure du possible, les primates inclus dans cette procédure expérimentale, pourront être réutilisés d’un protocole précédent après avis favorable du vétérinaire.

Raffinement

De façon à diminuer le stress, la souffrance et la douleur, toutes les procédures seront réalisées chez ces animaux sous anesthésie et un traitement analgésique leur sera donné de façon adaptée en cas de réactions secondaires suite à l’immunisation. La fréquence d'observation des animaux est doublée lors des immunisations, passant de 3 à 6 fois par jours, et consiste en des examens cliniques de l’animal vigile, permettant une prise en charge individuelle et adaptée. Les animaux seront hébergés avant protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur de mode vie en communauté. Au cours du protocole expérimental les individus traités seront hébergés dans des cages séparées, mais jointives permettant la vision et la communication entre congénères. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de l’espace.

Choix des espèces

Les PNH, particulièrement les babouins, représentent l’espèce animale de choix pour la génération d’anticorps de référence pouvant servir de contrôles positifs pour doser les anticorps anti-anticorps thérapeutique générés à la fois chez le singe (macaque) et chez l’homme. Il s’agit d’animaux jeunes adultes (4 à 15Kg) dont le système immunitaire est mature.

9 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie stéréotaxique d'environ trois heures pour implanter une canule cérébrale, puis reste maintenu en chaise de contention pendant environ six heures lors des séances de microdialyse. Le projet évalue la capacité d'un médicament à franchir la barrière hémato-encéphalique. Le porteur justifie le recours à ces primates non-humains par leur proximité phylogénétique avec l'humain.

Objectifs

Le présent projet a deux objectifs liés entre eux : le premier objectif est d’évaluer la capacité d'un médicament à traverser la barrière hémato-encéphalique après son administration (par voie intraveineuse, sous-cutanée ou orale), le second objectif est d’évaluer la capacité du médicament à induire une réponse pharmacodynamique dans le cerveau. Le premier objectif est donc de démontrer la pénétration cérébrale, pour cela, il est nécessaire d’évaluer la concentration tissulaire libre du médicament dans le cerveau à l’aide de la microdialyse. Le second objectif est de démontrer que le médicament permet d’activer le récepteur cérébral cible.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’évaluer la capacité d’un médicament à traverser la barrière hémato-encéphalique et sa capacité à induire une réponse pharmacodynamique dans le cerveau. En cas de réussite, le médicament pourra être testé chez l’homme.

Procédures

Après une période d'acclimatation suffisante (un mois minimum), les animaux subiront une chirurgie d'implantation de canule cérébrale. Ces canules de guidage seront implantées sous anesthésie générale et analgésie lors d'une chirurgie stéréotaxique d'une durée approximative de 3 heures. Les animaux bénéficieront d'une période de récupération de 7 jours afin notamment que la barrière hémato-encéphalique se reforme. A la fin de cette période de récupération, les animaux seront placés en chaise à contention pour laquelle ils auront été entraînés précédemment. La sonde de microdialyse sera insérée, via la canule de guidage dans le cerveau. Le microdialysat à la sortie de la sonde sera collecté et la sonde stabilisée le temps nécessaire. Après l'administration du médicament, la collecte des microdialysats sera poursuivie avec des aliquots prélevés toutes les 20 minutes. Des prélèvements sanguins seront réalisés à intervalle régulier. La perfusion et collecte cérébrale sera poursuivie pendant 6h. Une semaine après cette première microdialyse cérébrale, les animaux seront à nouveau placés en chaise à contention. la sonde de microdialyse sera insérée, via la canule de guidage, dans le cerveau. Le microdialysat à la sortie de la sonde sera collecté et la sonde stabilisée le temps nécessaire. Après l'administration du médicament (par une autre voie ou à une autre dose que la première fois), la collecte des microdialysats sera poursuivie avec des aliquots prélevés toutes les 20 minutes. Des prélèvements sanguins seront également réalisés à intervalle régulier. La perfusion et collecte cérébrale sera poursuivie pendant 6h. Les volumes et les doses administrés aux animaux seront en accord avec les recommandations éthiques en vigueur et validés par les sponsors. Les volumes prélevés et le temps de repos accordé aux animaux entre chaque prélèvement seront en accord avec les recommandations éthiques. Les administrations et prélèvements sont donc très ponctuels, la contrainte principale étant le séjour d'environ 6 heures en siège à contention. Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de la procédure afin de détecter tout signe clinique de douleur ou de détresse. En fin de protocole, les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés pour récolte de liquide céphalorachidien et de différents organes pour analyses.

Impact sur les animaux

Pendant et après la chirurgie d’implantation de la canule, comme toute chirurgie et malgré les moyens mis en place, il subsiste un risque de douleur ou d’inflammation. Des signes cliniques au niveau du site chirurgical et des sites d'administration (intraveineux ou sous-cutané, liés ou non à la molécule) peuvent apparaître (hématome, œdème léger, etc.). Pour les besoins de la microdialyse cérébrale, les animaux seront maintenus en siège à contention plusieurs heures d’affilée. Malgré les mesures mises en place, il est possible, du fait des différences intra-individuelles, qu’un animal présente toujours des signes de stress pendant les contentions en siège.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour récolte et analyse des organes.

Remplacement

Les études de preuve de concept chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de démontrer la faisabilité ou de valider un nouveau procédé. Ici, l’objectif est de prouver que la molécule est capable à la fois de passer la barrière hémato-encéphalique et d’agir sur les cibles du cerveau, le modèle animal est donc indispensable.

Réduction

Dans ce projet, un nombre maximum de 9 animaux (3 animaux par étude) sera utilisé afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant d'atteindre les objectifs scientifiques.

Raffinement

Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l’étude afin de détecter tout signe clinique de douleur ou de détresse (grille d’observation du bien-être). Des périodes de récupération suffisantes seront accordées aux animaux après la chirurgie et entre les prélèvements ainsi qu’entre les administrations. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress seront déterminées au préalable de la procédure. Les animaux bénéficieront du programme d’enrichissement défini par la structure du bien-être animal de l'installation, notamment la mise disposition de jouets dans les hébergements et la distribution de friandises systématique en fin de journée. Une rotation du matériel d’enrichissement, incluant une désinfection, sera organisée une fois par semaine pour éviter la lassitude et renouveler l’intérêt des animaux. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux dans des volières conformes aux recommandations pendant toute la durée de l’étude. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. La chirurgie d'implantation de la canule sera réalisée par une équipe experte (extérieure à la société) qui a déjà réalisé cette chirurgie à de nombreusezs reprises et notamment il y a quelques années au sein de notre société. La technique chirurgicale est donc parfaitement maîtrisée ainsi que le protocole d'anesthésie/d'analgésie et de récupération de chirurgie. Le site chirurgical et les sites d'administration seront suivis pendant plusieurs jours après la chirurgie et les administration pour détecter tout signe clinique potentiel. Pour les besoins de la microdialyse cérébrale, les animaux seront maintenus en siège à contention plusieurs heurex d'affilée, la chaise à contention sera donc adaptée pour améliorer le confort des sièges et permettre aux animaux d'être quasiment autonomes (accès aux jouets, aux friandises, au biberonà, tout en gardant une interaction constante avec le manipulateur. Un entraînement spécifique des animaux sera mis en oeuvre pendant la phase d'acclimatation afin de réduire au maximum leur stress le jour des mises en siège prolongées.

Choix des espèces

En raison de la grande proximité phylogénétique entre le Primate Non-Humain (PNH) et l’Homme et en particulier des similitudes du fonctionnement cérébral et des comportements entre ces deux espèces, le modèle primate constitue un modèle de choix pour l’évaluation de molécules qui ont pour cible des récepteurs cérébraux. Le macaque cynomolgus a été choisi car le système nerveux central est connu pour être différents entre les rongeurs et les primates concernant par exemple l'expression ou le métabolisme des transporteurs d'efflux. Il apparaît qu'il existe une meilleure corrélation entre l'expression des protéines d'adhésion et de transport entre l'homme et le singe cynomolgus qu'entre l'homme et les rongeurs. De plus, il existe une meilleure corrélation entre le taux de recyclage du LCR du macaque cynomolgus et l'homme qu'entre la souris et l'homme.

12 macaques rhésus vont être utilisés, gardés vivants et réintroduits dans leur groupe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'environ quatre heures pour poser un plot de tête, un entraînement à l'IRM éveillée de 6 à 12 mois et des séances d'imagerie sous anesthésie avec injection d'un agent de contraste, pour comparer la perception de la voix entre espèces. Le porteur indique que la capture et la séparation du groupe provoquent du stress, que le contrôle hydrique limite la ration d'eau à la séance d'entraînement, et que l'anesthésie et l'agent de contraste comportent des risques pour le foie. Sur le remplacement, il affirme qu'une étude comparative entre espèces ne peut se faire sans recourir à des animaux.

Objectifs

Ce projet vise à utiliser l'IRMf pour mesurer l'activité cérébrale dans des conditions d'écoute passive et la comparer entre des groupes de sujets de taille comparable entre marmousets, macaques et humains. Les macaques seront scannés soit éveillés soit sous anesthésie en IRM 3T. Deux expériences seront réalisées: la localisation d'un patch vocal (neurones sensibles et spécifiques au traitement des vocalisations des macaques) et comparaison inter-espèces.

Bénéfices attendus

Nous espérons que cette recherche fournira de nouvelles informations cruciales sur les bases cérébrales du traitement de l'information vocale chez les macaques. En particulier, nous mesurerons la localisation anatomique et la variabilité interindividuelle des patchs vocaux des macaques avec une taille d'échantillon et une puissance statistique comparables à celles des études humaines, pour une comparaison optimale entre espèces.

Procédures

Entrainement à l'IRM éveillé: 1 à 2 sessions par jour de 10 minutes (pour les nouveaux animaux) à 1h (lorsque les animaux sont habitués) par animaux pendant 6 à 12 mois. Chirurgie pour la pose du plot de tête pour le scanning IRM éveillé; durée chirurgie: environ 4h. Durée session imagerie sous anesthésie: 3h environ pour les premiers animaux puis environ 1h30-2h pour les suivants.

Impact sur les animaux

Des nuisances sont attendues chez les animaux pour la partie imagerie : (1) lors de la préparation : mise à jeun, séparation de l’animal de son groupe et capture provoquent du stress ; la chirurgie de pose du plot de tête et ses potentielles complications pendant l’anesthésie, la chirurgie elle-même ou les infections post-chirurgicales ; durant l’entrainement à l’IRMf éveillée le contrôle hydrique est aussi une nuisance pour l’animal car il n’obtient sa ration journalière d’eau que pendant et après la séance d’entrainement(2) lors de l’acquisition IRM : l’anesthésie et ses potentielles complications respiratoires/cardiaques, l’injection intraveineuse de MION en agent de contraste et ses potentiels effets secondaires au niveau du foie, l’intubation si l’anesthésie le nécessite et (3) après la séance :injection d’un chélateur pour limiter l’effet de l’agent de contraste sur l’organisme et le foie en particulier.

Devenir

Le projet ne prévoit la mort d'aucun individu, ils seront tous réintroduit dans leur groupe sociaux.

Remplacement

Il s’agit d’une étude comparative : par définition celle-ci compare des résultats obtenus chez l’humain à ceux obtenus chez d’autres espèces existantes, afin d’inférer des mécanismes potentiellement présents chez un ancêtre commun, ici les mécanismes comportementaux et neuronaux de la perception de l’information vocale. Il n’est pas possible d’utiliser cette approche expérimentale sans avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera minimal pour réduire autant que possible le nombre de singes impliqués, mais sera suffisant pour permettre une puissance statistique importante pouvant rendre les données interprétables.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en binômes, avec de l'enrichissement structurel et alimentaire renouvelé fréquemment. La réduction du temps d’isolement du singe de son binôme permet de réduire le stress et la possibilité de tensions lorsque le singe sera replacé dans sa cage. La modification de la mise à jeun n’affectera pas le binôme puisque la mise à jeun aura lieu pendant la nuit. Les singes seront sédatés puis anesthésiés et le contrôle des constantes se fera tout le temps du scan jusqu’au réveil. L’ajout d’agent de contraste permettrait d’améliorer la qualité des images tout en diminuant le nombre de sessions de scan par animal. Si un quelconque problème arrive lors de l’anesthésie gazeuse pendant l’IRM, alors le scan sera stoppé immédiatement et l’animal sera réveillé et surveillé.

Choix des espèces

Cette étude comparera les données observées chez l’humain à celles mesurées chez deux espèces de primates nonhumains: macaques et marmousets. Les raisons justifiant le choix des macaques comme espèce de comparaison sont les suivantes : - Ils sont relativement proches de nous sur le plan phylogénétique de sorte que les résultats nous renseigneront sur l'histoire de l'évolution relativement récente ; - Ils utilisent des vocalisations complexes et variées, bien caractérisées acoustiquement ; - Il s'agit d’un modèle neuroscientifique largement étudié, en particulier pour les neurosciences auditives, de sorte que les résultats obtenus seront interprétables en relation avec une grande quantité de données complémentaires ; - Enfin, ils peuvent être scannés en IRMf sur le même scanner que les humains, ce qui constitue un pont unique entre l'IRMf humaine et la littérature électrophysiologique sur les singes. Nous constituerons un groupe formé de sub-adultes afin de faciliter la gestion et l’entraînement dans les premières phases du projet, et afin qu’ils soient à un âge de jeune adulte pendant le durée du projet, pour comparaison optimale avec les groupes d’humains aussi constitués de jeunes adultes.

60 microcèbes, primates non-humains, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis replacés dans l'élevage. Chaque animal subit une mise à jeun et deux séances d'imagerie cérébrale sous anesthésie, IRM puis TEP avec traceur radioactif, pour évaluer l'effet des matières grasses laitières sur le métabolisme cérébral au cours de la croissance et du vieillissement. Le porteur signale les risques d'hypothermie et d'arrêt respiratoire liés à l'anesthésie. Il affirme que ces interventions nutritionnelles portant sur l'organisme entier ne peuvent être remplacées par des expériences sur cellules.

Objectifs

Les preuves scientifiques permettant de démontrer l'intérêt de l'introduction de matières grasses laitières dans l'alimentation des jeunes et des plus âgés sont peu nombreuses. Toutefois, les études chez les rongeurs laissent penser que la matière grasse laitière pourrait avoir des effets bénéfiques tout au long de la vie, lors de la croissance mais aussi, lors du vieillissement. Des études pilotes suggèrent même que l’ingestion de produits laitier au plus jeune âge pourrait avoir un impact à long-terme bien au-delà de la période pendant laquelle ils sont consommés. Ce projet permettra de mieux comprendre si l’ingestion de matières grasses laitières à différents âges de la vie peut avoir un impact positif sur les fonctions cognitives tout au long de la vie, incluant la phase critique du vieillissement, période pendant laquelle les fonctions cognitives déclinent naturellement. Nous émettons ici l'hypothèse que la matière grasse laitière pourrait avoir un impact favorable sur les fonctions cérébrales, et en particulier sur les fonctions cognitives, à plusieurs moments de la vie. Cet impact positif pourrait être procuré notamment grâce aux acides gras oméga-3 à longue chaîne qu’elle contient, contrairement à la matière grasse végétale qui n’apporte que des acides gras oméga-3 à courte chaîne. Ces acides gras oméga-3 pourraient permettre une meilleure utilisation par le cerveau de sa principale source d’énergie, le glucose. Pour tester notre hypothèse, nous proposons une étude pour déterminer si l'introduction de matières grasses laitières dans le régime alimentaire de primates non-humains omnivores, par rapport à un régime à base d'huiles végétales, a un impact sur le fonctionnement cérébral et en particulier sur l’utilisation par le cerveau de l’énergie apportée par les matières grasses) lors de deux périodes de la vie : la croissance (allant de la conception jusqu’à la maturité sexuelle, soit environ l’âge d’un an) et le vieillissement. Par conséquent, le projet aura pour objectif de démontrer que l’introduction de matière grasse laitière dans l’alimentation de modèles animaux âgés permettrait d’améliorer l’utilisation du glucose par le cerveau. Cette dernière partie sera étudiée en utilisant l’imagerie cérébrale TEP (Tomographie par émission de positrons) afin d’identifier des changements locaux d’activité métabolique cérébrale.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude permettront pour la première fois d’évaluer l’impact de la matière grasse laitière sur le fonctionnement cérébral dans deux contextes importants pour la physiologie humaine en s’appuyant sur les résultats obtenus avec un modèle primate non-humain : 1) au cours de le croissance (jusqu’à l’âge de 12 mois) et 2) au cours du vieillissement. L’étude au cours de la croissance permettra d’évaluer les effets à long terme de la matière grasse laitière. L’étude chez les animaux âgés est aussi importante que celle réalisée en période périnatale. En effet, cette étude visera à décrypter les mécanismes cérébraux associés au vieillissement. Ce projet présente l'avantage d'étudier l'impact de la matière grasse laitière au cours des périodes clés ciblées (croissance et vieillissement). Il s'agit d'un projet unique, original et pertinent, qui permettra d'étudier l'impact de la matière grasse laitière sur les fonctions cognitives mais aussi de décrypter les mécanismes métaboliques, physiologiques et moléculaires qui les sous-tendent. Ces travaux sont menés chez un primate omnivore afin de pouvoir être mieux appliqués à l’Humain par la suite et de participer à élaborer des conseils nutritionnels adaptés à tous les âges de la vie pour une meilleure santé cognitive.

Procédures

Ce projet comporte 1 procédure, comprenant 2 actes expérimentaux par animal, chacun appliqué aux animaux jeunes et âgés. Le premier acte expérimental consiste en une cartographie par imagerie par résonnance magnétique (IRM) de l’anatomie cérébrale des individus (environ 1h), étape nécessaire et préalable au deuxième acte qui consiste en la réalisation d’une mesure de l’utilisation cérébrale du glucose par tomographie par émission de positrons (TEP, environ 1h). L’ensemble des actes expérimentaux sera réalisé sur une période maximale de 4 semaines, incluant les temps d'acclimatation, la mise à jeun, l’imagerie, la décroissance radioactive et la récupération post-anesthésie.

Impact sur les animaux

Le présent projet nécessite la mise à jeune et l'anesthésie d'animaux. Les anesthésies nécessaires aux protocoles d'imagerie IRM et TEP constituent une nuisance potentielle, comme la mise à jeun, ou le risque d’hypothermie et d’arrêt respiratoire, Cependant, les protocoles d’anesthésies sont bien maîtrisés au sein du laboratoire et validé par le vétérinaire. , En en plus, les paramètres physiologiques comme la température corporelle et la respiration sont suivis sur chaque animal sous anesthésie afin d’évaluer en continu l’état de profondeur de l’anesthésie.

Devenir

Les actes expérimentaux décrits ci-dessus n'induisant pas d'effet indésirable à long terme, le replacement de l'ensemble des animaux dans l'élevage est prévu.

Remplacement

Ces expériences ne peuvent être remplacées par des méthodes alternatives puisqu’elles nécessitent l’exposition précoce au régime alimentaire pré-définiet notamment l’allaitement des petits par les mères. Les interventions nutritionnelles ayant par définition des effets sur l’organisme entier (de la digestion à l’utilisation des micronutriments et de leurs métabolites par les différents organes), ces expériences ne sauraient être remplacées par des expériences in vitro sur cellules.

Réduction

Afin de répondre à l’exigence de réduction du nombre d’animaux, ces expériences seront réalisées sur un nombre limité d’animaux (10 animaux par condition expérimentale, soit un total maximal de 60 animaux). Ces animaux sont issus d’une cohorte, dont le descriptif a été détaillé lors d’une précédente saisine. Ce nombre est suffisant pour évaluer les effets de régimes car les deux procédures (IRM et TEP) sont hautement sensibles et répétables. Les effectifs, déterminés à partir d’un test , prennent en compte la variabilité interindividuelle attendue au sein des groupes expérimentaux pour les mesures d’IRM et TEP (paramètres qui présentent la plus grande variabilité) et permettront de réaliser des tests statistiques avec assez de puissance

Raffinement

Les conditions générales de l’élevage seront conservées (fréquence de nourrissage, enrichissement, maintien des groupes sociaux) et les procédures appliquées seront organisées de sorte à laisser des temps de récupération longs entre deux procédures. Toute procédure entraîne un suivi attentif de chaque animal afin de s’assurer de leur bien-être. Des points limites ont été mis en place pour éviter toute souffrance de l’animal.

Choix des espèces

Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte (12 mois an) pour le groupe « jeune » et à l’âge de 7 ans pour le groupe « âgé ». L’objectif scientifique du projet étant d’étudier l’impact des matières grasses laitières sur les fonctions cérébrales au cours du développement et du vieillissement, ces deux catégories sont nécessaires. Les interventions nutritionnelles nécessitent l’exposition périnatale au régime et notamment l’allaitement des petits. Le microcèbe gris présente la particularité d'être omnivore, se nourrissant aussi bien de végétaux (feuilles et fruits) que d'animaux (petits mammifères ou reptiles, insectes). En tant que mammifère, il se nourrit naturellement de lait maternel (contenant donc naturellement de la matière grasse animale) pendant les 2 premiers mois de sa vie. Les altérations liées à l'âge, comparables à celles observées chez l'homme, apparaissent dès l'âge de 5 ans. De nombreuses études ont montré les similarités des changements cérébraux liés à l’âge entre ces deux espèces. Ce modèle représente donc un parfait compromis entre une longévité relativement longue, des facilités d'élevage dues à sa taille et une bonne proximité phylogénétique et physiologique avec l'homme.

1 710 primates, 1 625 macaques à longue queue et 85 macaques rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée pour analyse histopathologique et une soixantaine réutilisée dans d'autres projets. Ils reçoivent un candidat médicament par voie orale ou injectable, de façon quotidienne ou hebdomadaire, avec des prélèvements sanguins et urinaires répétés. L'objectif est l'évaluation réglementaire de la toxicité avant les essais chez l'humain. Le porteur affirme que cette évaluation ne peut pas se faire in vitro et décrit le primate comme "parfois l'unique espèce pertinente", "indispensable" avant toute mise sur le marché.

Objectifs

Le projet réalisé dans un cadre réglementaire a comme objectif de permettre l'évaluation du potentiel toxique d'un candidat médicament dans le cadre de son développement préclinique. Les lignes directrices ICH guideline M3(R2), ICH-S6, ICH-S9 et EMA/CPMP/ICH/286/1995 ; December 2009, rendent indispensable ce projet chez un non-rongeur pour chaque nouveau médicament avant tout essai clinique et mise sur le marché. Selon la guideline ICH Topic S6(R1), EMA/CHMP/ICH/731268/1998 - June 2011, l'espèce primate est parfois l’unique espèce pertinente pour le développement préclinique de composés biologiques (protéines thérapeutiques, anticorps monoclonaux, vaccins anti-cancer). Ces études sont validées par la direction scientifique de notre laboratoire et celle du sponsor, basées sur des informations complémentaires aux études réglementaires requises pour une phase clinique ou la soumission d'un dossier.

Bénéfices attendus

Le projet, réalisé dans un cadre réglementaire, a comme objectif de permettre l'évaluation du potentiel toxique d'un candidat médicament pendant son développement pré-clinique. Conformément aux lignes directrices ICH guideline M3(R2), ICH-S6, ICH(S9 et EMA/CPMP/ICH/286/1995; December 2009, l'évaluation du potentiel toxique d'un candidat médicament chez un non-rongeur est indispensable pour chaque nouveau candidat médicament avant de pouvoir démarrer les essais cliniques chez l'homme, et avant toute autorisation de mise sur le marché. Selon la guideline ICH Topic S6(R1), Step 4 Note for Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Products (EMA/CHMP/ICH/731268/1998 - adopted June 2011), l'espèce primate peut même être la seule espèce pertinente pour les essais pré-cliniques des composés biologiques (protéines thérapeutiques, anticorps monoclonaux, vaccins thérapeutiques anti-cancer...). Ces études permettent d’évaluer le schéma thérapeutique envisagé et de réduire le risque potentiel encouru par le volontaire sain à la suite de l’administration du candidat médicament au cours des premiers essais cliniques.

Procédures

Les animaux sont traités, par différentes voies (principalement orale et injection intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse) de façon journalière ou hebdomadaire (ex : composés biologiques), avec un produit, pour évaluer le potentiel effet toxique de ce produit. Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement aux effets pharmacologiques du produit administré (exemple : action au niveau du système nerveux central, à l’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée) et à des effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) peuvent aussi être observés.

Devenir

Les études de toxicologie incluent une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus. Seule la procédure 1 (études préliminaires) où les animaux participant à des études où une analyse anatomopathologique n'est pas nécessaire pour atteindre les objectifs, et ayant reçu un traitement n'entraînant pas d'effets secondaires ou des effets légers et réversibles, i.e. classe de sévérité réelle =1 (légère) ou 2 (modére) après analyse rétrospective, peut amener à garder les animaux en vie, et possiblement à être réutilisé dans un autre projet après une période de récupération et un aval du vétérinaire. Une estimation est faite en considérant que la moitié des animaux de la procédure 1 seront gardés en vie.

Remplacement

L'évaluation de la toxicité d'un candidat médicament ne peut pas être réalisée in vitro. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ce type de procédure de traitement identique à celle utilisée chez l'homme, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est celui recommandé dans les lignes directrices ICH ou OCDE, et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude. Le besoin de groupe contrôle, le nombre de doses nécessaires, ainsi que les techniques de prélèvements sanguins sont évalués systématiquement pour assurer une réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Les procédures, les conditions d’hébergement et matériel utilisés ainsi que les enrichissements fournis sont adaptés aux animaux utilisés dans ce projet (ex : sonde de gavage). Des enrichissements variés (graines dans des copeaux, tablettes à différentes hauteur, …) sont fournis aux animaux leur permettant d’exprimer les comportements physiologiques et activités qu’ils auraient dans leur habitat naturel (ex. recherche d’aliment, épouillage, temps d’isolement, …). L’attention portée aux animaux et leur surveillance clinique sont adaptées aux études, en tenant compte des points limites éthiques établis par procédure. En cas de plaie et/ou douleur, possibilité de traitement avec un cicatrisant cutané local et/ou un anti-inflammatoire, un antibiotique. Les mesures sont prises dès que possible pour réduire la souffrance des animaux. D’autres traitements peuvent être mis en place suivant les recommandations des vétérinaires, selon les observations, conditions d’expérimentation.

Choix des espèces

Le choix du primate est justifié par : - les homologies avec l'homme (anatomiques, physiologiques, métaboliques...) et souvent l'impossibilité d'utiliser d'autres espèces telles que le chien ou le porc en raison de l'absence d'homologies - la disponibilité d'études préliminaires dans cette espèce, - les données de pharmacocinétique, pharmacodynamie… Certains composés biologiques, ayant des effets sur le système immunitaire, en particulier les anticorps monoclonaux, protéines thérapeutiques et vaccins thérapeutiques (anti-cancer, anti-Alzheimer…) doivent être testés dans des espèces pertinentes. Le singe est généralement l’espèce non-rongeur de choix car son système immunitaire est le plus proche de celui de l’homme s'il n'existe pas de modèle rongeur humanisé (souris transgéniques). Animaux d’au-moins 24 mois en début d'étude. Age moyen généralement requis dans les études de toxicité. Des animaux un peu plus âgés (jusqu'à 35-40 mois) peuvent être utilisés dans les études standards. Pour certains composés, des animaux mâtures (d'un point de vue maturité sexuelle ou maturité du système immunitaire) doivent être utilisés (par exemple nouveau produit contraceptif, des anticancéreux, des immunomodulateurs). Dans ce cas les femelles ont en général au-moins 4 ans, et les mâles au minimum 4 à 5 ans. Pour certaines indications, il sera indispensable de tester le candidat chez un animal plus jeune que 24 mois (études de toxicité juvénile).