Souris

Des femelles gestantes subissent une chirurgie abdominale sous anesthésie générale pour atteindre les embryons et y introduire du matériel génétique par électroporation, d'autres reçoivent des injections quotidiennes pendant six jours sur souris vigile. 3 388 souris sont utilisées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les souriceaux et les fœtus sont placés sous anesthésie générale sans réveil pour le prélèvement du cerveau, une mise à mort que le porteur qualifie d'"indispensable" faute d'imagerie atteignant la résolution cellulaire voulue. La chirurgie des mères est donnée pour "environ 45 minutes" dans la description des procédures, et "limitée à 30 minutes maximum" dans celle des mesures de raffinement.

Objectifs

Comment se construit notre c?blage c?r?bral ? Vous ?tes-vous d?j? demand? comment les milliards de cellules de notre cerveau parviennent ? se ranger exactement au bon endroit pour nous permettre de penser, de bouger ou de ressentir ? Tout se joue avant la naissance. Au stade embryonnaire, de jeunes cellules (les futurs neurones) naissent et entreprennent un v?ritable voyage pour rejoindre leur destination finale dans le syst?me nerveux. Pour se guider dans ce labyrinthe, ces cellules utilisent des signaux chimiques appel?s morphog?nes. Imaginez ces signaux comme des phares dont l'intensit? diminue avec la distance : selon qu'une cellule per?oit un signal fort ou faible, elle sait o? elle se trouve et ce qu'elle doit faire. Cependant, nous ignorons encore comment ces cellules apprennent ? interpr?ter ces messages qui changent tout au long de leur croissance. L'objectif de notre projet est de comprendre comment les cellules nerveuses modifient leur mani?re de r?pondre ? ces signaux pour construire une architecture c?r?brale parfaite. Pour cela, nous utilisons des outils biologiques pour introduire avec une pr?cision chirurgicale des instructions g?n?tiques dans certaines cellules. Cela nous permet d'activer ou d'?teindre certains g?nes interrupteurs. Les ciseaux g?n?tiques (CRISPR) : Nous modifions l'ADN pour observer comment une petite modification change le comportement de la cellule et son d?placement. Pourquoi est-ce important ? Comprendre ces m?canismes, qui restent encore aujourd'hui un myst?re pour la science, est essentiel. De nombreuses maladies, comme les troubles du spectre autistique, les malformations du cerveau ou certaines d?ficiences intellectuelles, trouvent leur origine dans un bug lors de ce voyage des cellules. En d?couvrant comment le syst?me nerveux se construit normalement, nous posons les bases de futurs traitements capables de r?parer ou de pr?venir ces anomalies pr?coces.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche explore les myst?res de la fabrication du syst?me nerveux. Gr?ce ? des technologies de pointe, nous voulons comprendre comment les cellules s'organisent pour cr?er un cerveau fonctionnel. 1. Une meilleure connaissance de nos origines (Court terme) Le cerveau se construit gr?ce ? des signaux complexes que les cellules doivent apprendre ? lire. En utilisant des outils de pr?cision, nous pouvons modifier localement certains g?nes. Cela nous permet d'identifier les moments cl?s o? une cellule d?cide de se d?placer ou de se transformer. L'objectif est de passer d'une simple observation ? une compr?hension r?elle du mode d'emploi du cerveau. 2. Des pistes pour soigner les maladies (Long terme) M?me si les retomb?es m?dicales prendront du temps, elles sont porteuses d'espoir : a) Comprendre les causes : Beaucoup de maladies (autisme, ?pilepsie, malformations) naissent d'un probl?me durant le d?veloppement de l'embryon. Nos travaux permettront de comprendre l'origine de ces troubles. b) R?parer avant la naissance : En testant ces outils g?n?tiques, nous pr?parons les traitements du futur. ? terme, il pourrait devenir possible de corriger des d?fauts de d?veloppement tr?s t?t. c) Nouvelles cibles : Nous identifierons des prot?ines cl?s qui serviront de cibles pour de futurs m?dicaments ou des outils de diagnostic.

Procédures

Des femelles gestantes peuvent ?tre soumises ? une chirurgie abdominale sous anesth?sie g?n?rale d'une dur?e d'environ 45 minutes. Une injection d'analg?sique est administr?e avant l'intervention, et un traitement analg?sique est poursuivi 24 ? 48 heures. Par ailleurs, d?autres femelles re?oivent ?galement des injections de substances sur animal vigile, d'une dur?e d'environ 30 secondes, en une fois ou quotidiennement pendant six jours. En fin de protocole, les souriceaux ou f?tus sont places sous anesth?sie g?n?rale sans r?veil avec et un traitement analg?sique, par une proc?dure d'environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de la chirurgie, des douleurs sont possibles en p?riode post-op?ratoire, correspondant ? la cicatrisation. L?anesth?sie utilis?e peut induire dans de rare cas une hypothermie, une d?tresse respiratoire, voire un arr?t cardiorespiratoire. L?injection d?agents pharmacologiques peut induire une p?ritonite au niveau du site d?injection. Enfin, la manipulation r?p?t?e des animaux peut provoquer un stress.

Devenir

L'ensemble des animaux utilis?s dans ce projet seront euthanasi?s ? l'issue des proc?dures. Cette euthanasie est indispensable car les objectifs scientifiques reposent sur l'analyse des tissus c?r?braux embryonnaires et postnataux, qui ne peuvent ?tre pr?lev?s que post mortem. Aucune technique d'imagerie non invasive ne permet aujourd'hui d'atteindre la r?solution cellulaire n?cessaire pour ?tudier le d?veloppement cortical chez la souris. Les analyses r?alis?es comprennent des coupes histologiques, des marquages par immunofluorescence, des dosages de lipides c?r?braux, des analyses d'expression g?nique et du s?quen?age ? l'?chelle cellulaire. Toutes ces approches requi?rent l'acc?s direct au tissu c?r?bral.

Remplacement

Pourquoi ne peut-on pas se passer d'animaux ? Avant d'utiliser des animaux, nous avons examin? toutes les alternatives possibles. Malheureusement, aucune ne permet de r?pondre ? nos questions. Notre projet cherche ? comprendre comment les cellules s'organisent pour construire un cerveau fonctionnel. Ce processus repose sur des signaux chimiques qui se diffusent dans les tissus, sur des interactions complexes entre diff?rents types de cellules (neurones, cellules de soutien, vaisseaux sanguins), et sur une architecture en trois dimensions qui se met en place progressivement au cours de la grossesse. Or, les cultures de cellules en laboratoire, bien qu'utiles pour ?tudier des m?canismes isol?s, ne reproduisent ni cette organisation spatiale, ni ces interactions entre cellules. Les organo?des c?r?braux cultiv?s en laboratoire, repr?sentent une avanc?e prometteuse, mais ils ne poss?dent ni vaisseaux sanguins fonctionnels, ni l'organisation rigoureuse du cerveau r?el selon ses diff?rents axes. Ils ne permettent pas non plus d'?tudier les ?changes entre la m?re et l'embryon, notamment le passage de substances ? travers le placenta, qui est au c?ur de notre second volet de recherche. La mod?lisation informatique nous aide ? formuler des hypoth?ses, mais elle doit imp?rativement ?tre confront?e ? la r?alit? biologique pour ?tre valid?e. Le recours ? la souris est donc indispensable. C'est le mod?le de r?f?rence pour l'?tude du d?veloppement c?r?bral : sa grossesse est courte, son cerveau se d?veloppe de mani?re tr?s similaire ? celui de l'homme, et il existe des outils de manipulation g?n?tique ?prouv?s et sp?cifiquement adapt?s ? cette esp?ce. C'est le seul mod?le qui nous permet d'observer la construction du cerveau dans un organisme vivant complet, tout en restant au plus proche de la physiologie humaine.

Réduction

Comment avons-nous r?duit le nombre d'animaux au strict minimum ? Le nombre d'animaux a ?t? calcul? avec soin pour chaque exp?rience, en s'appuyant sur notre exp?rience pass?e et sur des m?thodes statistiques adapt?es. Pour la premi?re partie du projet, qui consiste ? modifier l'activit? de certains g?nes dans le cerveau d'embryons, la technique utilis?e ne fonctionne correctement que dans environ un tiers des cas. Nous avons tenu compte de ce taux de r?ussite pour calculer le nombre d'embryons n?cessaires, en veillant ? disposer de suffisamment d'animaux pour obtenir des r?sultats fiables sans en utiliser plus que n?cessaire. Par ailleurs, cette technique permet de tester le r?le d'un g?ne directement chez l'embryon, ce qui ?vite de cr?er des lign?es de souris g?n?tiquement modifi?es (une approche qui n?cessiterait beaucoup plus d'animaux sur plusieurs g?n?rations). Pour la seconde partie du projet, o? nous ?tudions l'effet d'un traitement sur la fabrication du cholest?rol dans le cerveau embryonnaire, nous avons adopt? une m?thode statistique avanc?e qui permet d'analyser chaque embryon individuellement tout en tenant compte du fait que les embryons d'une m?me m?re ne sont pas totalement ind?pendants. Cette approche nous a permis de r?duire de pr?s de moiti? le nombre de m?res n?cessaires par rapport ? une m?thode classique. De plus, nous analysons syst?matiquement tous les embryons de chaque port?e : aucun animal euthanasi? n'est perdu ou inutilis?, ce qui est en accord avec le principe de r?duction. Le nombre total d?animaux de ce projet est 3388.

Raffinement

Comment prenons-nous soin des animaux ? Tout au long du projet, nous mettons en ?uvre des mesures pour minimiser la douleur, le stress et l'inconfort des animaux. Toutes les interventions chirurgicales sont r?alis?es sous anesth?sie g?n?rale, avec un traitement contre la douleur administr? avant, pendant et apr?s l'op?ration. Un anesth?sique local est ?galement appliqu? au niveau de l'incision. Pendant l'op?ration, la temp?rature corporelle de l'animal est maintenue gr?ce ? un tapis chauffant, et les yeux sont prot?g?s par un gel pour ?viter le dess?chement. La dur?e de la chirurgie est limit?e ? 30 minutes maximum. Apr?s l'op?ration, les animaux sont plac?s sur un tapis chauffant pour leur r?veil et surveill?s ?troitement deux fois par jour pendant 48 heures. Un aliment enrichi est mis ? leur disposition d?s la veille de l'intervention. Pour les injections quotidiennes (seconde partie du projet), nous utilisons des aiguilles tr?s fines et une technique adapt?e aux femelles en gestation, afin de rendre le geste le plus bref et le moins stressant possible. Chaque manipulation dure moins de deux minutes. Dans les deux cas, les animaux sont h?berg?s dans des conditions optimales : cages ventil?es, liti?re adapt?e, mat?riel de nidification, temp?rature et humidit? contr?l?es. Les femelles en gestation b?n?ficient d'un compl?ment alimentaire. Une grille de suivi du bien-?tre est appliqu?e quotidiennement : poids, ?tat du pelage, comportement, signes de douleur. Tout animal pr?sentant des signes de souffrance significatifs est imm?diatement pris en charge ou, si n?cessaire, exclu du protocole et euthanasi? de mani?re rapide et indolore afin de lui ?viter toute souffrance prolong?e.

Choix des espèces

Chez la souris, la gestation est courte et chaque port?e compte beaucoup de petits. Autre avantage : au sein d'une m?me port?e, on trouve ? la fois les souris que l'on veut ?tudier (dites mutantes) et leurs fr?res et s?urs normaux (les contr?les). Comparer des animaux issus de la m?me port?e rend les r?sultats plus fiables, car ils partagent le m?me patrimoine g?n?tique et le m?me environnement. Le d?veloppement du cerveau de la souris est par ailleurs tr?s bien connu, ce qui facilite les ?tudes d'anatomie et de fonctionnement et aide ? rep?rer des effets nets et reproductibles. Surtout, la formation du syst?me nerveux chez l'embryon de souris ressemble beaucoup ? celle de l'humain : c'est ce qui en fait un excellent mod?le pour comprendre ce qui se passe chez nous. Pour ?tudier le r?le des g?nes pendant cette formation, nous utilisons l'?lectroporation. C?est une technique mise au point chez la souris qui permet d'introduire du mat?riel g?n?tique directement dans le cerveau de l'embryon. La m?thode est simple, rapide et efficace, elle ab?me peu les cellules, et elle pr?sente un avantage ?thique majeur : en traitant environ 6 embryons par port?e, elle n?cessite beaucoup moins d'animaux adultes que la cr?ation d'une lign?e g?n?tiquement modifi?e classique. Nous examinerons ensuite les effets de ces modifications ? plusieurs moments du d?veloppement : soit chez l'embryon (aux 14ieme, 15ieme et 16ieme jours de gestation), soit chez le souriceau apr?s la naissance. Ce suivi ? diff?rents stades est indispensable, car les mol?cules que nous ?tudions (les morphog?nes et leurs r?cepteurs) ne jouent pas le m?me r?le d'un stade ? l'autre : leur action ?volue au fil du d?veloppement. Il faut donc observer chaque ?tape pr?cis?ment pour comprendre l'ensemble de leurs fonctions.

Exposées à l'acide perfluorooctanesulfonique dans leur eau de boisson du quinzième jour de gestation au vingt-et-unième jour après la naissance, des souris femelles transmettent ce polluant à leurs petits. Devenus adultes à 90 jours, une partie de ces souriceaux reçoit pendant six semaines une molécule mélangée à une nourriture en poudre pour détruire leur myéline, avec perte de poids, baisse d'activité et risque de défaut d'usure des dents, puis deux séances d'IRM d'une heure sous anesthésie générale. 276 souris sont utilisées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées à la fin pour les prélèvements de tissus, le porteur précisant que les mères ne peuvent pas être réutilisées "en raison de leur exposition à l'acide perfluorooctanesulfonique (PFOS)".

Objectifs

La scl?rose en plaques est une maladie du syst?me nerveux qui touche de plus en plus de personnes dans les pays d?velopp?s. Elle se caract?rise par une d?gradation progressive de la my?line, une substance qui entoure les fibres nerveuses et permet la transmission rapide des signaux dans le cerveau et la moelle ?pini?re. Si les causes exactes de cette maladie ne sont pas encore compl?tement connues, certains facteurs environnementaux pourraient jouer un r?le dans son apparition ou son aggravation. Ce projet vise ? ?tudier si une exposition pr?coce ? un type de polluants chimiques tr?s r?pandus dans notre quotidien, appel?s PFAS (utilis?s par exemple dans les rev?tements antiadh?sifs ou les textiles d?perlants), peut perturber la formation ou la r?paration de la my?line. Ces polluants, tr?s persistants dans l?environnement, s?accumulent facilement dans les tissus gras comme la my?line, ce qui pourrait en fragiliser la structure et nuire ? son bon fonctionnement. Nous chercherons d?abord ? comprendre si l?un de ces compos?s, le PFOS, influence la formation de la my?line chez le souriceau apr?s une exposition pendant la gestation et l?allaitement. Nous ?tudierons ensuite si cette exposition pr?coce entra?ne des effets durables ? l??ge adulte, en particulier sur la stabilit? de la my?line et sa capacit? ? se r?parer. Pour cela, nous analyserons si le PFOS s?accumule dans les r?gions riches en my?line dans le cerveau et si cela modifie sa composition, en utilisant des m?thodes de pointe bas?es sur la chimie analytique. Les r?sultats pourraient aider ? mieux comprendre comment certains polluants environnementaux influencent le d?veloppement c?r?bral et participent ? des maladies neurod?g?n?ratives comme la scl?rose en plaques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d?apporter de nouvelles connaissances sur les effets potentiels d?une exposition pr?coce ? certains polluants pr?sents dans notre environnement sur la sant? du cerveau. En particulier, il pourrait aider ? mieux comprendre si et comment une exposition ? l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS), pendant la grossesse et les premi?res semaines de vie, perturbe la formation et la stabilit? de la gaine de my?line, qui prot?ge les fibres nerveuses. Une telle alt?ration pourrait rendre le syst?me nerveux plus vuln?rable ? certaines maladies, comme la scl?rose en plaques. Les r?sultats attendus pourraient permettre de mieux identifier les m?canismes par lesquels ces substances chimiques peuvent affecter durablement le fonctionnement du cerveau. Le projet permettra aussi de d?terminer ? partir de quelle concentration ces effets apparaissent chez la souris, ce qui est important pour ?valuer les risques pour la sant? humaine. Enfin, ces travaux pourraient alimenter des recommandations de sant? publique concernant l?exposition des femmes enceintes et des jeunes enfants ? ce type de polluants, et contribuer ? la compr?hension des maladies li?es ? une alt?ration de la my?line.

Procédures

Les femelles gestantes expos?es recevront de l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS) dans leur eau de boisson entre le quinzi?me jour de gestation et le vingt-et-uni?me jour post-natal. Une partie des souriceaux obtenus suite ? cette exposition ? l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS) recevra ? l??ge adulte et pendant 6 semaines une mol?cule dans leur nourriture afin d?induire une d?my?linisation. Une partie d?entre eux aura ensuite une imagerie par r?sonance magn?tique sous anesth?sie g?n?rale (60 minutes maximum, deux fois) pour suivre l??tendu des l?sions de la my?line.

Impact sur les animaux

Le mod?le de d?my?linisation pourra provoquer de mani?re temporaire une perte de poids ou une baisse d?activit? chez les animaux. La modification de la texture de l?alimentation (poudre) pourra induire un risque de d?faut d?usure des dents des animaux. L?anesth?sie g?n?rale n?cessaire pour la r?alisation de l?imagerie par r?sonance magn?tique sera associ?e ? des risques d?hypothermie, de s?cheresse oculaire et de difficult?s cardiaque et respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasi?s en fin de proc?dure d?une part parce que des pr?l?vements de tissus post-mortem et des analyses sont n?cessaires pour r?pondre ? notre question scientifique. D?autre part les femelles ne pourront pas ?tre r?utilis?es en raison de leur exposition ? l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS).

Remplacement

Avant de recourir ? des exp?riences sur des animaux vivants, plusieurs ?tudes en laboratoire ont ?t? men?es sur des cellules en culture et des tissus isol?s du cerveau, ainsi que sur un mod?le animal alternatif, le t?tard de x?nope. Ces approches ont permis de d?montrer que l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS) perturbe la formation et la r?paration de la my?line ? court terme. Cependant, ces mod?les ne permettent pas de reproduire les conditions r?elles d?exposition, comme cela peut survenir pendant le d?veloppement chez un individu vivant. Ils ne permettent pas non plus d??tudier l?accumulation du polluant dans le cerveau ni ses effets ? long terme sur la structure de la my?line. Nous aurons donc recours ? la souris, une esp?ce chez laquelle la composition de la my?line est bien connue, ce qui permet de faire des analyses pr?cises et fiables. Ce choix s?appuie directement sur les limites identifi?es dans nos approches pr?c?dentes. Il s?agit d?un prolongement n?cessaire pour r?pondre ? une nouvelle question scientifique, en s?appuyant sur un mod?le physiologique complet. Le recours ? l?animal est donc justifi? ici puisque les autres mod?les ne permettent pas de r?pondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre d?animaux par groupe a ?t? optimis? en s?appuyant sur nos exp?riences ant?rieures, avec un effectif r?duit mais suffisant pour obtenir des r?sultats robustes et tenir compte de la variabilit? biologique entre individus. Les groupes exp?rimentaux incluent ? chaque fois des m?les et des femelles, ce qui permet d??valuer les ?ventuelles diff?rences li?es au sexe sans multiplier le nombre d?animaux. Le protocole inclut une r?partition ?quilibr?e entre m?les et femelles, afin d??viter d?avoir ? multiplier les groupes dans des exp?riences distinctes. Au total, 276 souris seront utilis?es dans ce projet. Ce chiffre tient compte d?une l?g?re marge de s?curit? pour pallier la variabilit? naturelle du nombre de petits par port?e notamment. L?ensemble de ces choix refl?te un souci constant de limiter l?utilisation d?animaux tout en garantissant la qualit? scientifique des donn?es. Pour analyser nos r?sultats sans compromettre la pr?cision statistique, nous utiliserons une m?thode adapt?e aux petits ?chantillons qui garantira la robustesse de nos conclusions.

Raffinement

Les animaux b?n?ficieront d?un enrichissement de leur environnement (carr? de coton, b?tonnets de bois ? ronger). Ils seront observ?s quotidiennement par l??quipe zootechnique et 2 fois par semaine minimum par notre ?quipe. En cas d'anomalie celle-ci sera g?r?e en collaboration entre notre ?quipe, la Structure charg?e du Bien Etre Animal (SBEA) et le v?t?rinaire afin de mettre en place une prise en charge adapt?e pour l?animal. Des points limites sont d?finis et seront respect?s pour ?viter toute souffrance animale. Les femelles gestantes et en lactation d?un m?me groupe de traitement seront plac?es en duo par cage, afin d??viter tout isolement social, favoriser les comportements naturels de nidification et permettre une entraide maternelle pendant la lactation. Apr?s deux jours d?acclimatation, valid?s par le SBEA, l?exposition d?butera au quinzi?me jour de gestation (jour embryonnaire 15, E15). Cette organisation permet de garantir la gestation des femelles tout en limitant le nombre d?animaux n?cessaires au projet. Ce sch?ma exp?rimental a d?j? ?t? utilis? sans effet d?l?t?re observ? chez les femelles gestantes ni sur le d?veloppement des port?es. Elles seront pes?es ? leur arriv?e puis 5 jours apr?s afin de suivre le bon d?roul? de la gestation mais ne seront pas plus manipul?es afin de r?duire au maximum le stress g?n?r? par les manipulations. A leur naissance, une v?rification visuelle des petits sera r?alis?e pour s?assurer de leur bonne prise en charge par leur m?re puis ils seront pes?s 1 ? 2 fois par semaine ? partir de 7 jours d??ge afin de nous assurer qu?ils ne pr?sentent pas de croissance anormale et, ou, difficult?s ? s?alimenter. A partir de leur sevrage ils seront peser et et surveiller hebdomadairement en plus de l?observation quotidienne. Pendant la d?my?linisation, l??tat g?n?ral et le poids des animaux seront surveill?s 1 fois par semaine minimum. Une transition alimentaire sera assur?e sur 48h pour que les animaux s?habituent ? la nourriture en poudre et un enrichissement suppl?mentaire sera ajout? dans la cage pour qu?ils puissent assurer leur comportement naturel de rongeur (ajout de b?tonnets de bois ? ronger suppl?mentaires). Lors des imageries, les animaux seront plac?s sous anesth?sie g?n?rale. Leur temp?rature corporelle sera maintenue pendant l'anesth?sie et un gel ophtalmique sera appliqu? pour ?viter toute s?cheresse oculaire. Nous v?rifierons la profondeur de l'anesth?sie et les surveillerons jusqu'? leur r?veil complet.

Choix des espèces

L?esp?ce choisie pour ce projet est la souris, qui est largement utilis?e en recherche scientifique. Ce mod?le pr?sente de nombreux avantages, tant sur le plan scientifique que pratique. Sur le plan scientifique, la souris est l?un des organismes les mieux connus : son g?nome a ?t? enti?rement s?quenc?, et de nombreux m?canismes li?s au d?veloppement du cerveau, ? la formation de la my?line et aux effets des substances polluantes ont ?t? d?crits. C?est ?galement l?esp?ce de r?f?rence pour l??tude des effets des perturbateurs endocriniens et pour l?analyse fine de la composition en lipides de la gaine de my?line. Enfin, elle est particuli?rement adapt?e pour l?utilisation du mod?le de d?my?linisation choisi ici et valid? pour ?tudier les m?canismes de perte et de r?paration de la my?line. Tous les protocoles que nous utilisons sont bien ma?tris?s pour cette esp?ce, ce qui r?duit les risques de complications et favorise son bien-?tre. Les animaux seront utilis?s ? diff?rents stades de d?veloppement, selon les objectifs de chaque exp?rience. Les femelles gestantes seront de jeunes adultes ?g?es d?environ trois mois afin d??tre sexuellement matures. L?exposition au PFOS sera faite ? partir du 15e jour de gestation jusqu?au 21e jour apr?s la naissance, ce qui correspond ? une p?riode particuli?rement sensible du d?veloppement c?r?bral. Pour les animaux expos?s pendant la gestation nous r?aliserons ensuite nos analyses ? diff?rents stades : tout d?abord 21 jours d??ge, un stade o? la formation de la my?line atteint un pic important chez la souris, cela permettant de mesurer pr?cis?ment l?accumulation du polluant et ses effets pr?coces. Puis dans un deuxi?me temps ? 90 jours d??ge, un stade adulte permettant d??valuer si les effets de l?exposition pr?coce persistent ? long terme, lorsque le cerveau a atteint un stade de maturit?. Pour le mod?le impliquant une d?my?linisation celle-ci sera r?alis?e ? partir de ce stade de 90 jours et pendant 6 semaines pour induire la perte de my?line, suivi d?une p?riode d?une semaine de r?cup?ration afin d??tudier les m?canismes de r?paration naturelle de cette gaine nerveuse.

614 souris femelles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue et le cœur prélevé pour analyse. Selon les lots, chacune reçoit 2, 7 ou 13 injections, un à deux prélèvements de sang et une à trois échographies de trente minutes, tous les gestes étant réalisés sous anesthésie. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative n'existe et que l'étude "doit être réalisée dans un organisme vivant complet". Le médicament visé, capable de prévenir les dégâts cardiaques de la chimiothérapie, n'existe à ce jour sous aucune forme, et le porteur écrit que le trouver "représenterait un progrès majeur pour la santé publique".

Objectifs

Certains traitements de chimioth?rapie, utilis?s pour traiter les cancers gyn?cologiques, notamment dans les formes agressives du cancer du sein, sont tr?s efficaces pour d?truire les cellules tumorales. Cependant, ces traitements peuvent endommager le c?ur, un effet secondaire appel? cardiotoxicit?. C?est pourquoi il est important de surveiller ?troitement la sant? cardiaque des patientes afin d??viter qu?elles d?veloppent une insuffisance cardiaque. Les causes pr?cises de ces dommages au c?ur ne sont pas encore totalement comprises, mais on sait qu?ils impliquent la formation de substances tr?s r?actives, appel?es radicaux libres, dans le muscle cardiaque. Le c?ur a peu de moyens pour se prot?ger contre ces radicaux libres, ce qui provoque un stress important. Ce stress entraine la mort des cellules cardiaques d?s la premi?re dose de traitement et s?aggrave avec le temps, leur causant des d?g?ts irr?versibles. Des ?tudes r?centes ont identifi? une prot?ine qui joue un r?le central dans la mort cellulaire induite par la chimioth?rapie. Notre ?quipe a par le pass? travaill? sur la protection du c?ur lors d?accidents cardiaques comme l?infarctus, et dans ce cadre nous avons pu rep?rer l?int?r?t de cette prot?ine que l?on appelle ? FAS ?. Nous avons notamment identifi? une mani?re de bloquer ses interactions et d?emp?cher la mort des cellules cardiaques. Nous pensons que cette m?me strat?gie de blocage pourrait aider ? pr?venir les dommages au c?ur caus?s par certains traitements anticanc?reux, c?est pourquoi notre projet vise ? tester nos mol?cules bloquantes pour prot?ger efficacement le c?ur contre les effets n?fastes de ces traitements.

Bénéfices attendus

? ce jour, il n?existe aucun m?dicament efficace pour prot?ger le c?ur des effets secondaires des traitements chimioth?rapeutiques, qui peuvent endommager durablement le muscle cardiaque. Ces dommages peuvent entra?ner une maladie du c?ur, qui se manifeste souvent plusieurs ann?es apr?s la fin du traitement. Chez les femmes, ces m?dicaments sont fr?quemment utilis?s pour soigner certains cancers gyn?cologiques, notamment ceux de l?ovaire, de l?endom?tre et du sein. De plus en plus, les cardiologues sont amen?s ? suivre des patientes en r?mission de leur cancer, mais qui d?veloppent ensuite des probl?mes cardiaques li?s ? ces traitements. Il est important de savoir que les femmes trait?es jeunes avec ces m?dicaments ont un risque de cardiotoxicit? quatre fois plus ?lev? que les hommes. Par ailleurs, des facteurs comme la m?nopause ou l?hypertension art?rielle augmentent encore ce risque. Prendre soin du c?ur des patientes ayant re?u ces traitements est donc essentiel, car cela influence fortement leur sant? ? long terme et leur qualit? de vie. Trouver un m?dicament capable de pr?venir ou limiter les d?g?ts cardiaques caus?s par la chimioth?rapie repr?senterait un progr?s majeur pour la sant? publique et permettrait aussi de r?duire les co?ts li?s aux complications cardiaques dans la soci?t?.

Procédures

Les animaux seront r?partis en plusieurs lots. En fonction du lot, les animaux pourront recevoir 2, 7 ou 13 injections espac?es dans le temps (geste durant 1 minute, maximum un geste par semaine), un ? deux pr?l?vements de sang (geste durant 5 minutes) et une ? trois ?chographies (examen durant 30 minutes). Tous les gestes seront r?alis?s sous anesth?sie.

Impact sur les animaux

Avant les traitements, les animaux seront manipul?s avec pr?caution pour ?tre pes?s, ce qui peut entra?ner un l?ger stress. Les injections et pr?l?vements sanguins pourront ?galement g?n?rer un stress li? ? la manipulation et ? la mise sous anesth?sie. La g?ne ressentie lors de ces gestes est comparable ? celle d?une piq?re d?aiguille. Le traitement de chimioth?rapie pourra entra?ner un inconfort g?n?ral, notamment digestif. Les injections pourront ?galement entra?ner une irritation locale au site d?administration.

Devenir

Tous les animaux ? l?issue de l?exp?rimentation seront mis ? mort et le coeur pr?lev? pour analyse.

Remplacement

Pour ce projet, il n?existe pas encore de m?thode alternative sans animaux. En effet, notre ?tude doit ?tre r?alis?e dans un organisme vivant complet. Cela est particuli?rement important car les mol?cules qui bloquent de la mort cellulaire prot?gent non seulement les cellules du c?ur, mais aussi les cellules des vaisseaux sanguins, qui sont elles aussi expos?es au traitement de chimioth?rapie. En r?alisant ces exp?riences sur des animaux vivants, nous pouvons aussi v?rifier que les mol?cules inject?es dans le sang atteignent bien tous les organes concern?s, notamment le c?ur. Ce protocole imite ainsi une situation r?elle que l?on rencontre en clinique.

Réduction

Le nombre d?animaux a ?t? d?termin? ? l?aide d?un outil statistique afin d?obtenir des r?sultats fiables tout en ?vitant l?utilisation excessive d?animaux. Plusieurs mesures sont mises en place pour r?duire au maximum leur nombre, notamment l?analyse de plusieurs param?tres chez un m?me animal, ce qui permet de limiter le recours ? des animaux suppl?mentaires. L?organisation des exp?riences a ?galement ?t? optimis?e afin d?obtenir un maximum d?informations ? partir de chaque animal.

Raffinement

Pour les 2 proc?dures de traitement et pour les enregistrements ?chocardiographiques, les conditions d?anesth?sie g?n?rale sont utilis?es pour r?aliser les injections sans stress ni douleur. Ce protocole a ?t? optimis? de mani?re ? ce qu?il soit le moins invasif possible Les pr?l?vements sanguins seront ?galement r?alis?s sous anesth?sie. Dans ce contexte, les animaux vigiles ne recevront qu?une injection d?anesth?sique.

Choix des espèces

La souris a ?t? choisie pour d?velopper les mod?les d??tude de l??quipe. Les raisons sont : -L?Homme et la souris poss?dent 99% de g?nes identiques donc le choix de la souris est tr?s avantageux pour une ?tude qui permet d??tudier les effets d?un futur m?dicament - Des ?tudes montrent que presque tous les g?nes associ?s ? des maladies humaines sont retrouv?s chez les rongeurs. - Les r?sultats ant?rieurs obtenus par l??quipe montrent que ce mod?le est proche de l?Homme (contrairement au rat). Des souris femelles ?g?es de 8 ? 12 semaines seront utilis?es pour repr?senter la population des femmes trait?es par chimioth?rapie en clinique humaine suite ? un cancer gyn?cologique.

10 000 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Un quart des femelles gestantes subissent trois séances de contention de trente minutes par jour pendant sept jours consécutifs, puis une injection et un prélèvement sanguin submandibulaire, avant une perfusion intracardiaque de fixateur sous anesthésie qui provoque leur mort. Les femelles gestantes sont tuées pour permettre le prélèvement des fœtus, eux-mêmes tués pour les analyses. Les femelles nées de ces gestations sont tuées à leur tour, le porteur indiquant qu'elles ne sont pas "nécessaires aux analyses réalisées dans ce projet", qui portent sur le développement testiculaire et la fertilité masculine.

Objectifs

Le testicule est un organe vulnérable aux perturbations hormonales pendant la grossesse. Toute altération d’un des type de cellule du testicule peut induire des problèmes durables de fertilité masculine. Ce projet vise à comprendre comment l’exposition aux hormones du stress pendant la gestation perturbent le développement testiculaire et programment des défauts de fertilité à l’âge adulte. Cette étude est indispensable pour plusieurs raisons. La dexaméthasone est un médicament qui imite une hormone naturelle du stress et qui est utilisé chez la femme enceinte en cas de risque d’accouchement prématuré. Malgré son efficacité clinique, ses effets secondaires à long terme sur la reproduction masculine restent mal connus. Aussi, le stress est devenu très fréquent dans la vie moderne, en raison des contraintes environnementales, professionnelles et sociales. Il augmente durablement les hormones du stress dans l’organisme mais les répercussions pendant la grossesse sont largement sous-estimées. Enfin, de nombreuses causes connues d’infertilité masculine comme les perturbateurs endocriniens, l’obésité, les infections, les maladies chroniques s’accompagnent d’une augmentation des hormones de stress, suggérant un rôle mécanistique encore insuffisamment exploré. L’objectif du projet est d’identifier comment ces expositions modifient l’état des cellules du testicule en étudiant en particulier la protéine qui permet aux cellules de répondre aux hormones du stress. Le projet analysera également les conséquences à long terme sur la spermatogenèse et la fertilité adulte, ainsi que la possible transmission de ces effets aux générations suivantes. En améliorant la compréhension des mécanismes biologiques impliqués, ce projet contribuera à réévaluer l’utilisation de ces traitements pendant la grossesse et à prévenir les effets à long terme sur la fertilité masculine.

Bénéfices attendus

Le projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes par lesquels le stress gestationnel et les glucocorticoïdes synthétiques, tels que la dexaméthasone, influencent le développement du testicule, la fertilité masculine et la production hormonale. À court terme, ce travail permettra d’identifier de manière précise les effets cellulaires et moléculaires induits par ces expositions au cours de la gestation. Les données obtenues fourniront des informations inédites sur les étapes critiques du développement testiculaire sensibles aux variations hormonales maternelles, ainsi que sur le rôle du récepteur des glucocorticoïdes dans ces processus. À plus long terme, ce projet pourrait contribuer à une meilleure évaluation du risque associé au stress maternel chronique ou à l’utilisation de glucocorticoïdes pendant la grossesse. Les résultats permettront d’identifier des mécanismes responsables d’éventuelles altérations persistantes ou transmissibles de la fertilité masculine. Ces connaissances sont importantes pour améliorer le conseil clinique concernant l’usage de la dexaméthasone en contexte obstétrical et pour renforcer la prévention des expositions délétères durant la gestation. Enfin, en mettant en lumière les mécanismes cellulaires impliqués dans la programmation fœtale de la fertilité, ce projet pourrait à terme favoriser le développement de stratégies thérapeutiques visant à limiter ou corriger les effets néfastes d’expositions précoces. Ces avancées bénéficieraient potentiellement à la santé reproductive humaine et animale, dans un contexte de baisse globale de la fertilité et d’augmentation documentée des situations de stress environnemental.

Procédures

25% des femelles gestantes subiront une contention à raison de trois séances par jour, d’une durée de trente minutes chacune, pendant 7 jours consécutifs. Puis, elles reçoivent une injection deux heures avant la mise à mort (durée de l’injection : moins de 1 minute). Puis un prélèvement sanguin réalisé une seule fois, juste avant la mise à mort (durée du prélèvement : moins de 1 minute, incluant la contention, la ponction et l’hémostase). 50% des femelles gestantes reçoivent une injection unique d’un médicament ou un placébo (durée de l’injection : moins de 1 minute) une fois par jour, sur une durée de sept jours consécutifs. Puis, elles reçoivent une injection deux heures avant la mise à mort (durée de l’injection : moins de 1 minute). Puis un prélèvement sanguin réalisé une seule fois, juste avant la mise à mort (durée du prélèvement : moins de 1 minute, incluant la contention, la ponction et l’hémostase). 25% des femelles gestantes reçoivent une injection deux heures avant la mise à mort (durée de l’injection : moins de 1 minute). Puis un prélèvement sanguin réalisé une seule fois, juste avant la mise à mort (durée du prélèvement : moins de 1 minute, incluant la contention, la ponction et l’hémostase). Les mâles reçoivent une injection deux heures avant la mise à mort (durée de l’injection : moins de 1 minute). Puis un prélèvement sanguin réalisé une seule fois, juste avant la mise à mort (durée du prélèvement : moins de 1 minute, incluant la contention, la ponction et l’hémostase). Un anesthésique sera administré par injection pour permettre la perfusion intracardiaque d’un fixateur histologique. Les souris sous anesthésie sub-létale/profonde en moins de 5 minutes. La perfusion (10 minutes) résulte en la mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels incluent un stress transitoire lié à la manipulation et à la contention, une douleur légère et brève au point d’injection ou de prélèvement, ainsi qu’une baisse temporaire de l’activité ou de la prise alimentaire après les procédures répétées. La contention répétée et les injections de médicament qui imite une hormone naturelle du stress induisent une élévation attendue des hormones de stress et une légère perte de poids. Elles induisent une augmentation temporaire de l’activité de l’axe du stress, se traduisant par une élévation des hormones glucocorticoïdes et un stress comportemental modéré chez les femelles gestantes. Ces effets sont attendus pendant la durée des séances de contention et sont réversibles après la fin du protocole qui n’excèdera pas 7 jours consécutifs. Aucun effet physique durable n’est attendu. Les injections répétées induisent un risque limité de rougeur, d’hématome ou d’inflammation locale. Le prélèvement sanguin submandibulaire peut entraîner un saignement transitoire et une ecchymose locale. La perfusion intracardiaque terminale est réalisée sous anesthésie profonde, éliminant toute perception douloureuse.

Devenir

Toutes les femelles gestantes sont euthanasiées afin de permettre le prélèvement des fœtus. Elles ne peuvent pas être gardées en vie, réutilisées ou replacées. Les embryons et fœtus prélevés sont euthanasiés pour la réalisation d’analyses moléculaires et histologiques. Ils ne peuvent pas être gardés en vie, réutilisés ou replacés. Les mâles issus des femelles gestantes expérimentales sont mis à mort afin de permettre le prélèvement des testicules nécessaires aux analyses moléculaires, histologiques et immunohistochimiques visant à étudier le développement testiculaire, la spermatogenèse et les mécanismes associés. Les femelles issues des femelles gestantes expérimentales sont mises à mort car elles ne sont pas nécessaires aux analyses réalisées dans ce projet, qui portent spécifiquement sur le développement testiculaire et la fertilité masculine.

Remplacement

Le développement du testicule fœtal, la mise en place des interactions entre cellules de Sertoli, cellules germinales, cellules de Leydig et macrophages testiculaires, ainsi que la mise en route de la spermatogenèse, sont des processus hautement intégrés qui dépendent de signaux hormonaux, paracrines et systémiques impossibles à reproduire dans des modèles in vitro. Les organoïdes testiculaires et les cultures cellulaires existantes permettent d’étudier certaines fonctions isolées, mais ne reproduisent ni l’organisation tridimensionnelle, ni la vascularisation, ni l’environnement endocrinien maternel, ni les variations physiologiques des glucocorticoïdes. Ils ne permettent pas non plus de modéliser un stress gestationnel, lequel implique une réponse neuroendocrinienne complexe propre à l’organisme entier. De plus, l’étude des effets du stress ou de la dexaméthasone sur la transmission transgénérationnelle nécessite la prise en compte de la reprogrammation épigénétique germinale, processus qui ne peut être étudié qu’in vivo. Le remplacement par des méthodes n’impliquant pas l’animal vivant n’est pas possible pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Pour obtenir des résultats statistiquement significatifs au risque de se tromper de 5%, aux stades intéressants, nous aurons besoin d’un nombre d’animaux assez important à savoir 10 individus par condition, par stade et par génotype. Plusieurs mesures ont été mises en place pour réduire le nombre total d’animaux. Les accouplements sont planifiés de manière à produire simultanément des animaux contrôles et mutants au sein des mêmes portées, limitant le nombre de reproducteurs nécessaires. Les analyses embryonnaires sont réalisées sur des stades choisis de façon ciblée, sur la base des phénotypes observés, afin d’éviter des prélèvements multiples et inutiles. Pour les adultes, seules les étapes développementales pertinentes seront examinées : aucun animal ne sera utilisé si les résultats des phases précédentes ne justifient pas la poursuite des analyses. Les tissus prélevés sont systématiquement partagés entre analyses histologiques, immunologiques ou moléculaires, de manière à éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires pour des examens complémentaires. Les analyses intégratives, incluant par exemple des approches combinant transcriptomique et épigénomique, permettent également de réduire le nombre d’animaux en regroupant plusieurs types de données à partir des mêmes échantillons. Enfin, l’absence d’études pilotes supplémentaires limite l’utilisation d’animaux, car les protocoles reposent sur des méthodes déjà établies dans la littérature ou validées au sein de l’équipe.

Raffinement

Les femelles gestantes font l’objet d’un suivi quotidien après l’induction du stress et lors des périodes de traitement ; incluant l’évaluation quotidienne du poids et du comportement spontané. Toute absence de prise de poids, diminution de mobilité, ou altération de l’état général entraîne une action immédiate avec mise à disposition d’une alimentation en gel et surveillance trois fois par jour. Le stress gestationnel est induit par une contention dans un tunnel ventilée, sur une durée et fréquence standardisée, ne provoquant ni douleur physique ni lésion. Les périodes de contention sont réalisées dans un environnement calme afin de limiter les stimulations additionnelles. Les femelles sont remises immédiatement dans leur cage d’origine après la procédure et leur comportement est contrôlé après chaque session. Les administrations de médicaments ou de substances sont réalisées avec des volumes minimaux et des aiguilles adaptées afin de réduire l’impact de la procédure. Le volume des prélèvements sanguins sont limités au strict nécessaire pour les dosages hormonaux. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux afin de limiter le stress et de respecter leurs besoins comportementaux. Des mesures de raffinement supplémentaires pourront être intégrées tout au long du projet comme des maisonnettes, des batônnets à ronger, une limitation du changement de cage et une mise à disposition de matériel de nidification supplémentaire. Des points limites ont été définis, en cas de souffrances constatés des mesures correctives adaptés seront mises en œuvre.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle constitue l’espèce la plus pertinente pour étudier le développement testiculaire, la fonction des glucocorticoïdes et les effets du stress gestationnel. Son organisation testiculaire, la dynamique de la spermatogenèse et la régulation endocrinienne du développement reproducteur présentent de fortes similarités avec celles de l’Homme. De plus, le développement embryonnaire du testicule y est décrit de manière très détaillée, ce qui en fait un modèle de référence. Le projet repose sur une approche de génomique fonctionnelle ciblant spécifiquement certaines cellules testiculaires, pour laquelle la souris est particulièrement adaptée en raison de son temps de génération court et de la disponibilité de nombreux outils génétiques. Son faible temps de gestation et sa descendance abondante facilitent les études intergénérationnelles. L’utilisation des femelles se limite aux fonctions reproductrices nécessaires à la production des animaux utilisés et à l’application des traitements gestationnels. Les femelles seront mises en accouplement entre 8 et 16 semaines d’âge, période correspondant à une maturité reproductive optimale. Les embryons et fœtus permettent d’analyser la différenciation sexuelle du testicule, la prolifération des cellules de Sertoli, la quiescence des cellules germinales, la mise en place de la vascularisation et la production de testostérone fœtale, tous processus sensibles aux variations hormonales maternelles et aux expositions gestationnelles expérimentales. Les nouveau-nés sont examinés pour le maintien de la quiescence des cellules germinales, la localisation et la prolifération des macrophages testiculaires anti-inflammatoires, ainsi que le développement initial des organes sexuels. Les stades néonatals correspondent à la reprise de la prolifération germinale, au début de la méiose et à l’apparition des progéniteurs de cellules de Leydig adultes. Les stades prépubères permettent d’étudier la maturation des cellules de Sertoli et la différenciation des cellules de Leydig immatures, la progression de la méiose et l’émergence des macrophages pro-inflammatoires. Les souris adultes permettent d'étudier la maturité sexuelle et le vieillissement testiculaire. Ces stades sont essentiels pour évaluer la spermatogenèse, la production hormonale, la fertilité et les conséquences à long terme des expositions gestationnelles.