Rats
Etude de l’activité respiratoire chez des modèles rongeurs d’hypoventilation centrale associée ou non à une encéphalopathie autoimmune
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 115
Tous tués à la fin des actes pour prélever des parties de leur système nerveux central, 658 rongeurs, 543 souris et 115 rats, vont être utilisés dans des procédures dont le niveau de souffrance va de l'anesthésie sans réveil au sévère. Des nouveau-nés de cinq jours au plus sont anesthésiés quelques minutes puis tués pour isoler une partie de leur système nerveux et y mesurer la commande respiratoire. Les souris adultes passent des mesures de respiration d'une heure en enceinte fermée, portent un collier qui mesure l'oxygène du sang et subissent deux ou trois chirurgies du cerveau en stéréotaxie, une partie recevant aussi cinq jours de traitement immunosuppresseur par le nez sous anesthésie. Pour justifier l'emploi de rongeurs dans l'étude de l'hypoventilation liée à une encéphalopathie auto-immune, le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier".
Objectifs
L’hypoventilation alvéolaire centrale est une maladie neuro-respiratoire grave, secondaire à l’atteinte de la commande automatique respiratoire. Cette atteinte peut survenir à différents niveaux, le principal étant une perte de la sensibilité du cerveau à l’excès de dioxyde de carbone, qui déclenche et augmente normalement la respiration. Cette ventilation insuffisante ne garantit plus les échanges gazeux et nécessite une ventilation mécanique, nocturne et parfois diurne, pour survivre. Ses causes sont multiples : génétiques, lésionnelles, médicamenteuses et, plus récemment, inflammatoires. Des travaux récents ont ainsi montré qu'un tiers des patients atteints d'encéphalopathie autoimmune (une inflammation cérébrale médiée par des anticorps) présentaient une hypoventilation centrale pendant le sommeil. Dans une partie des cas, les anticorps responsables sont identifiés. De plus, on ignore quelles structures cérébrales sont touchées et causent cette hypoventilation, ainsi que les moyens de la contrer, si ce n'est par le biais d'une ventilation mécanique. En l’absence de diagnostic et de prise en charge rapide, les patients atteints d’une encéphalite et d’une hypoventilation alvéolaire décèdent dans les semaines ou les mois qui suivent l’apparition de cette hypoventilation. Notre projet vise à identifier les mécanismes qui conduisent à la survenue des hypoventilations centrales.
Bénéfices attendus
Les hypoventilations centrales sont des maladies graves, mortelles chez l’humain. Les centres respiratoires situés dans le tronc cérébral ne sont pas accessibles à une biopsie et les informations apportés par l’imagerie cérébrale sont très peu précises chez l’humain. Une étude chez des modèles animaux présentant une hypoventilation centrale soit par expression d’une mutation soit induite par une injection d’auto-anticorps responsables d’une encéphalopathie autoimmune apportera des informations précieuses sur le plan anatomopathologique. La prévalence des encéphalopathies autoimmunes est estimée à 13,7 cas pour 100000 personnes et celle des hypoventilations centrales congénitales est de 1 sur 200000 naissances. L’étude vise à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques responsables de l’apparition d’une hypoventilation centrale, à identifier quelles structures de la commande respiratoire sont impactées. Et enfin a tester la réversibilité de l’atteinte ventilatoire par un traitement immunomodulateur ou pharmacologique.
Procédures
Des rongeurs nouveau-nés sont anesthésiés (quelques minutes) puis euthanasiés afin d’isoler rapidement une partie du système nerveux central afin de mesurer l’activité de la commande respiratoire. Des souris adultes vigiles seront utilisées pour la mesure des variables ventilatoires qui sera réalisée de façon non invasive pendant 60min (nécessite une habituation de 5 jours minimum) dans une enceinte hermétiquement fermée et alimentée par un flux d’air en continu (pléthysmographie) avant et après les chirurgies. Des souris adultes seront utilisées pour la mesure de la saturation en O2 (1h) et la mesure de pression artérielle (10 minutes) de manière non invasive (par un collier contenant un détecteur pour la saturation et un manchon placé au niveau de la queue pour la pression artérielle) avant et après les chirurgies. Un traitement immunosuppresseur sera appliqué à une partie des animaux en intranasal pendant 5 jours (5 minutes par jour), l'administration intranasale se déroule sous anesthésie générale. Les animaux seront soumis à une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale et analgésie (2 fois par animal, acte de 30 minutes pour une partie des animaux ; 3 fois pour une partie des animaux, acte de 30 minutes). Tous les animaux sont euthanasiés après la dernière mesure des variables physiologique (respiration, saturation en dioxygène et pression artérielle) en vue des prélèvements.
Impact sur les animaux
La manipulation des animaux pourra induire un stress. Le dispositif de collier d’enregistrement de la saturation en oxygène peut engendrer un stress et un inconfort pour l’animal. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Les interventions chirurgicales pourront engendrer des douleurs et des risques d’infections.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des actes en vue des prélèvements et pour les analyses anatomopathologiques de certaines parties du système nerveux central.
Remplacement
Un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement hypoventilations centrales associées ou non aux encéphalopathies auto-immunes à travers les différentes structures cérébrales nécessaire dans la mise en oeuvre de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu; en effet l'apparition et la diffusion des anticorps associés aux encéphalopathies auto-immunes dans les différentes structures cérébrales seront corrélées avec les caactéristiques clinique (tests respiratoires), non dissociables pour comprendre le mécanisme physiopathologique de ces maladies. La fonction respiratoire nécessite l’utilisation de modèles murins ex vivo et in vivo. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail sur des souris vivantes.
Réduction
Nous utilisons aussi bien les mâles que les femelles dans les études ex vivo chez les nouveau-nès dans nos travaux afin de limiter le nombre d’animaux. 658 rongeurs seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements (carré de lanière kraft/coton, batonnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette). Si un animal se retrouve isolé (seul mâle d’une portée, animal arrivé seul d’un fournisseur, agression entre congénères, dernier animal dans la cage…), il bénificiera de deux enrichissements et il sera vérifié par la Structure Bien Etre Animale (SBEA) pour valider son hébergement individuel. La températures et le taux d'humidité sont contrôlées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Nous nous efforçons de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Les souris adultes seront habituées pendant au moins 5 jours aux enceintes de pléthysmographie, pour diminuer le stress. Sous anesthésie, une surveillance du rythme cardiorespiratoire est assurée jusqu’au réveil complet. Si défaillance, l’anesthésie est stoppée, la souris est réanimée.
Choix des espèces
Les rongeurs sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude des mécanismes associés à la genèse et à la régulation de la commande respiratoire et les fonctions cardio-vasculaires. Nouveau-nés (0-5 jours) : étude de la commande respiratoire sur préparations ex vivo, au-delà de 5 jours, elles ne génèrent plus d’activité car problème d’oxygénation du tissu. Les nouveau-nés sont identifiés par l’expérimentateur par un code (nom expérimentateur et un chiffre incémenté au fur et à mesure des expériences) Adultes (8 semaines minimum) : l’enregistrement simultanée de la ventilation et de l’électroencéphalographie, la mesure de la pression artérielle et de la saturation en dioxygène n’est réalisable que chez les adultes du fait de contraintes liées au matériel.
Etude des effets de candidats médicaments dans un modèle préclinique d’hypertension artérielle pulmonaire (modèle SUGEN/Hypoxie) MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Injectés d'un composé qui freine la formation des vaisseaux, puis enfermés trois semaines dans une enceinte d'hypoxie où l'humidité dépasse 80 %, 1 800 rats sur les 2 000 du projet vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. De retour en air normal, la maladie s'aggrave et devient irréversible, au point que le porteur prévoit jusqu'à 40 % de morts dans les groupes suivis plus de trois semaines. Le but est de tester des candidats médicaments contre l'hypertension artérielle pulmonaire, donnés par gavage ou injection jusqu'à deux fois par jour, avant une ouverture du thorax pour mesurer les pressions et la mise à mort de tous les rats encore en vie. Le porteur décrit dans l'enceinte une humidité élevée, un risque d'accumulation d'ammoniaque et de CO2 et un bruit plus fort qu'en salle classique, puis affirme que les absorbeurs assurent des "conditions correctes pour les animaux".
Objectifs
L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie cardiovasculaire et pulmonaire rare et grave : sa prévalence dans la population générale en France est estimée à 15 cas par million et la survie médiane sans traitement après diagnostic est inférieure à 3 ans. Elle se caractérise par l’augmentation des résistances artérielles pulmonaires, responsable d'une hypertension, et aboutit à une insuffisance cardiaque. Cette maladie peut survenir de cause inconnue, dans un contexte familial ou compliquer l’évolution de certaines pathologies (insuffisance cardiaque). En identifiant et en traitant les patients le plus tôt possible, il est possible de retarder la progression de l'HTAP. Malheureusement, cette maladie est souvent mal diagnostiquée et traitée, car les symptômes initiaux sont légers et peu spécifiques (essoufflements, lipothymie et asthénie). Si les options thérapeutiques ont progressé ces dix dernières années et ont permis d'améliorer les conditions de vie des malades, la prise en charge de l'HTAP demeure incomplète car ne prolonge pas significativement le durée de vie après diagnostic. Ainsi, la recherche de médicaments ciblant de nouveaux mécanismes physiopathologiques reste un enjeu majeur pour les années à venir. Les tests de nouvelles molécules doivent se réaliser sur des modèles animaux suffisamment prédictifs de la maladie, afin d’optimiser la sélection des candidats médicaments qui entreront en phase clinique. Le modèle présenté d'HTAP chez le rat, induit conjointement par l’administration d'un composé diminuant la formation de vaisseaux sanguins et par une hypoxie (diminution des apports en oxygène) chronique, est un modèle qui reproduit l'ensemble des caractéristiques physiopathologiques décrites chez l'Homme, à savoir une atteinte vasculaire qui est associée à long terme avec le développement d'une insuffisance cardiaque droite. De plus, les traitements actuellement proposés chez l'Homme montrent des résultats bénéfiques significatifs dans ce modèle. Ainsi, ce modèle d'HTAP représente un modèle préclinique de choix pour l’étude de l’HTAP. Ce modèle nous permettra d’évaluer, chez le rat, l’efficacité de nombreux candidats médicaments qui s’intéressent à des mécanismes d’actions connus (atteintes vasculaires) et des cibles thérapeutiques nouvelles (atteintes cardiaques). Ce modèle nous permettra également une meilleure compréhension des mécanismes mise en jeu dans la maladie afin d’améliorer la prise en charge des patients.
Bénéfices attendus
L’HTAP est une maladie rare et grave pour laquelle il n’existe actuellement pas de traitements curatifs efficaces. Si les traitements prescrits actuellement, essentiellement des vasodilatateurs, permettent une amélioration de la qualité de vie des patients et une prolongation de la survie en freinant l’évolution de la pathologie, la moitié des patients décèdent dans les sept ans qui suivent le diagnostic. Compte-tenu de l’évolution de l’HTAP dans ce modèle animal qui mime fidèlement la maladie humaine, la réalisation d’études précliniques utilisant des candidats médicaments novateurs apparait primordiale pour mettre en évidence de nouvelles pistes thérapeutiques. Ainsi, à terme, l’utilisation de ce modèle animal permettra de sélectionner des composés présentant des bénéfices sanitaires significatifs en vue d’essais cliniques.
Procédures
Une injection sous-cutanée (S.C.) du composé diminant la formation des vaisseaux est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les animaux sont ensuite placés dans une enceinte d’hypoxie pendant 3 semaines avant de retourner en condition de normoxie (conditions d'hébergement classique) durant 0 à 6 semaines. Pendant la période de normoxie, les animaux pourront être traités quotidiennement, une à 2 fois par jour selon le composé testé, par gavage, injection intrapéritonéale (I.P.), sous-cutanée (S.C.), ou intranasale (I.N.). Les animaux pourront subir une chirurgie sous anesthésie générale afin de placer sous la peau une pompe contenant des substance, permettant la diffusion continue de candidats médicaments et dont la durée d'intervention est d'environ 15-25min. Des injections intraveineuses sous anesthésie gazeuse pourront également être réalisées 1 à 2 fois par semaine. Durant la normoxie, des prélèvements de sang à la veine jugulaire ou des examens échocardiographiques de suivi pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse. A la fin du protocole, une chirurgie sous anesthésie gazeuse et analgésie est réalisée afin de mesurer les pressions artérielles en insérant un cathéter relié à un capteur de pression dans l’artère carotide. Une thoracotomie est ensuite réalisée afin d’insérer un cathéter dans le ventricule droit puis dans l’artère pulmonaire pour des mesures de pressions. Un prélèvement de sang terminal intracardiaque pourra être réalisé avant la mise à mort des animaux par surdose de produit euthanasiant. [MODIFICATION: Les animaux seront soumis à un test d'effort sur tapis roulant dont la l'intensité maximale augmente progressivement jusqu'à l'épuisement de l'animal. Ce test sera réalisé au maximum 2 fois au cours du protocole, avant le début des traitements et à la fin du protocole (durée maximale du test 35 min).]
Impact sur les animaux
Les animaux sont soumis à une anesthésie et reçoivent une injection sous-cutanée pour induire une hypertension artérielle pulmonaire. Ils sont ensuite placés dans une enceinte d’hypoxie pendant 3 semaines. L’humidité dans l’enceinte est supérieure à 80%. En hypoxie, les animaux présentent une prise de poids ralentie de 50% par rapport à une stabulation conventionnelle à cause du stress et de l’asthénie provoqués par la déplétion en oxygène. De plus, le confinement dans l'enceinte d'hypoxie génère un inconfort, indépendamment de l'hypoxie elle même, via une humidité élevée et un risque d'accumulation d'ammoniaque et de CO2. De plus, le niveau sonore est plus élevé dans les caissons hypoxiques que dans les salles d'hébergements classiques pouvant engendrer du stress et de l'inconfort pour les animaux. A la fin de ces 3 semaines d’hypoxie, ils retournent dans la pièce d’hébergement conventionnelle pendant 0 à 6 semaines, période pendant laquelle la pathologie va s’aggraver et devenir irréversible. A long terme, les animaux peuvent mourir de la pathologie. Pendant la période de normoxie, les animaux pourront être traités quotidiennement, une à 2 fois par jour selon le composé testé, par gavage, injection intrapéritonéale, sous-cutanée, ou intranasale. Ces administrations peuvent êtres associées à des risques de fausses route, d'irritation ou de lésions de l'oesophage. Une chirurgie d’implantation de pompe contenant les composés pourra être réalisée après ouverture de la peau pouvant être source de douleur et/ou d'une gêne avec la présence de la pompe et de la diffusion des subtances. Des injections intraveineuses sous anesthésie pourront également être réalisées 1 à 2 fois par semaine. Des anesthésies gazeuses seront potentiellement réalisées au cours du protocole afin de réaliser des prélèvements de sang à la veine jugulaire ou des examens échocardiographiques de suivi. A la fin du protocole, les animaux sont anesthésiés afin de réaliser un acte chirurgical qui permet de mesurer les pressions artérielles en insérant un cathéter relié à un capteur de pression dans l’artère carotide. Une thoracotomie est ensuite réalisée afin d’insérer un cathéter dans le ventricule droit puis dans l’artère pulmonaire pour des mesures de pressions. Un prélèvement de sang terminal intracardiaque pourra être réalisé avant la mise à mort des animaux par surdose de produit euthanasiant. [MODIFICATION: Les tests d'efforts induisent un stress comportementale et physique.]
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux HTAP seront mis à mort afin de récupérer des organes pour des analyses de tissus (cœurs, poumons, artères pulmonaires) et/ou des analyses de morphologie des organes (pesée des deux ventricules du cœur). Les mesures de pressions dans le ventricule droit sont également trop invasives pour envisager un réveil des animaux. Un prélèvement de tissu sur les animaux Sham (non porteurs d'un HTAP) est nécessaire pour comparer aux conséquences cardiovasculaires des animaux porteurs de la maladie.
Remplacement
S'il existe un certain nombre de modèles de culture de cellules musculaires lisses, ces modèles in vitro sont utilisés en première intention (modèles de screening) et sont utilisés uniquement pour tester des activités moléculaires et identifier des voies de signalisation. Ces modèles cellulaires in-vitro ne permettent pas de tester l'efficacité d'un candidat médicament sur l'aspect de la restauration hémodynamique et morphologique mais sont utilisés en amont afin de sélectionner les meilleurs candidats à tester sur nos modèles in vivo. La validation de la formation aux techniques de mesures de pressions nécessite d’avoir recours à des animaux vivants car les phases critiques de l’approche chirurgicale reposent sur les risques hémorragiques qui peuvent entraîner des mesures de pression faussées, voir la mort de l’animal.
Réduction
Pour chaque groupe avec une HTAP, le nombre d'animaux nécessaire par groupe est fixé à 11. Ce nombre a été déterminé par un calcul de N, sur la base de données obtenues préalablement et prenant en compte les moyennes et déviations standards mesurées pour chaque paramètre. Basés sur les données historiques dans ce modèle d’HTAP, un pourcentage de perte de 15% est attendu jusqu’à 3 semaines de normoxie, correspondant aux animaux qui meurent au cours du protocole à cause du développement de la pathologie. Le nombre d’animaux inclus dans chaque groupe en début d’étude est donc de N=13. Lorsque le protocole inclus une période de normoxie supérieure à 3 semaines (jusqu’à 6 semaines), le nombre d’animaux par groupe est fixé à N=18 car le développement de la pathologie entraîne une mortalité plus importante des animaux (jusqu’à 40% de perte). Généralement, le groupe contrôle négatif (non malade) n’est composé que de 6 animaux car il y a peu de variabilité des paramètres cardiovasculaires étudiés. Ainsi, 1800 rats HTAP sont prévus dans le cadre de cette procédure et 120 rats Sham. Des échantillons de plasmas et/ou de tissus d'animaux sont prélevés à l'issue de certaines séries expérimentales et conservés pour pouvoir être utilisés dans le cadre d’autres projets de recherche (par exemple recherche d’un récepteur cible présent dans le plasma ou dans les tissus cardiaques ou vasculaires). L'utilisation de ces banques de tissus pour d'autres projets de recherches permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés car il permet de réduire le nombre de séries expérimentales réalisées.
Raffinement
A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. L'administration du composé induisant la pathologie est réalisée sous anesthésie. Pendant les 3 semaines d'hypoxie, les animaux sont hébergés dans des grandes cages en plexiglass prévues à cet effet avec une sciure particulièrement absorbante (8 animaux/cages). Les caissons d’hypoxie sont ouverts et nettoyés tous les jours. De la chaux sodée est placée dans le caisson pour absorber le C02 et changée tous les jours, de l'acide borique permet d'absorber l'ammoniaque générée par les urines et est remplacé toutes les semaines ; et des absorbeurs d'humidité sont présents assurant des conditions correctes pour les animaux. La ventilation des caissons peut être adaptée à l’aide d’aérations présentes sur les caissons dont l’ouverture et la fermeture peut être ajustée pour diminuer une humidité excessive. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation du bien-être animal. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Des points limites spécifiques au protocole sont établis (présence de plaies cutanées, fausse route…) Si des prélèvements de sang sont réalisés au cours du protocole, les animaux sont anesthésiés. Une anesthésie locale est également réalisée. Les rats sont placés sur un tapis chauffant avec contrôle de la température, et une réhydratation est réalisée en injectant en S.C. 3 fois le volume prélevé. Si des injections en voie I.V. sont réalisées, les animaux sont anesthésiés avec une analgésie locale et contôle de la température corporelle. Les mesures hémodynamiques réalisées en fin de protocole se font sur animaux anesthésiés ayant reçus une injection préalable d'analgésiant. Pour chaque anesthésie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant retro-contrôlé et du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux. Les pompes osmotiques sont implantées en s.c. sous anesthésie générale et analgésie locale. Un massage de la zone d'implantation de la pompe est effecuté pour limiter la fibrose des tissus et optimiser son fonctionnement. [MODIFICATION: A la suite des test d'efforts, les animaux seront réhydratés. Les animaux seront habitués au tapis roulant à hauteur de 3 fois maximum par semaine à faible intensité.]
Choix des espèces
Même si de nombreuses espèces animales sont concernées, la majorité des modèles d’HTAP ont été développés chez le rat adulte parce qu’il permet d’obtenir, après induction de la pathologie, des données hautement reproductibles. De plus, les rats présentent des modifications cardiovasculaires similaires à l’homme : modifications des pressions, remodelage vasculaire et cardiaque, perte de fonction. Finalement, ce modèle d'HTAP développé chez le rat représente un modèle de référence pour l’étude de l’HTAP car la progression de la pathologie est continue au cours du temps et mime ainsi l’évolution délétère de la maladie observée chez l’homme. Des rats de 4/6 semaines au moment où ils arrivent en acclimatation dans nos locaux sont utilisés pour ce modèle. Ce modèle est sensible à l’âge et des animaux plus âgés ne présentent pas le même développement de la pathologie.
Etude de l’efficacité de candidats médicaments dans un modèle préclinique d’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) chez le rat (modèle monocrotaline) MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
1 960 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une injection de monocrotaline sous anesthésie leur provoque une hypertension artérielle pulmonaire. Ils reçoivent ensuite des composés chaque jour pendant cinq semaines, passent au moins deux imageries cardiaques et jusqu'à deux tests d'effort sur tapis roulant dont l'intensité augmente "jusqu'à l'épuisement de l'animal", avant une chirurgie terminale pour mesurer la pression dans le cœur. Les molécules retenues "pourraient ensuite" être étudiées chez l'être humain, alors que la maladie infligée peut réduire l'activité, l'appétit et le poids des rats. Sur le remplacement, le porteur affirme que les cellules ou tissus isolés ne rendent pas compte des "effets globaux" du médicament, et conclut que l'utilisation d'un "modèle animal est nécessaire".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de tester de nouveaux médicaments destinés au traitement d’une maladie grave des poumons appelée hypertension pulmonaire artérielle. Cette maladie entraîne une augmentation de la pression dans les vaisseaux des poumons, ce qui fatigue progressivement le cœur et peut conduire à une insuffisance cardiaque. Elle peut apparaître sans cause connue, être liée à des facteurs familiaux, ou être associée à d’autres maladies ou à certains médicaments. Bien que des traitements existent déjà pour soulager les symptômes, leur efficacité reste limitée et variable selon les patients. Le but de cette étude est donc d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle animal, afin de mieux comprendre leur potentiel avant une éventuelle utilisation chez l’être humain.
Bénéfices attendus
Le modèle utilisé dans ce projet reproduit de manière fiable les principales caractéristiques de la maladie étudiée, en particulier les atteintes des vaisseaux des poumons et du cœur. Chez les animaux, l’augmentation progressive de la pression dans les poumons entraîne des modifications du cœur similaires à celles observées chez les patients atteints de cette maladie. L’utilisation de ce modèle permet de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et d’évaluer l’effet de nouveaux médicaments dans des conditions proches de celles rencontrées chez l’être humain. Les résultats obtenus permettront d’identifier les futurs molécules thérapeutiques les plus prometteuses, qui pourraient ensuite être étudiés chez l’homme dans le cadre d’essais cliniques, avec pour objectif d’améliorer la prise en charge future des patients.
Procédures
Les animaux sont anesthésiés afin d’injecter la substance induisant une augmentation de la pression artérielle dans les petits vaisseaux sanguins localisés dans les poumons c'est-à-dire l'hypertension artérielle pulmonaire (durée de l’intervention : 6-8 min). Durant les 5 semaines suivantes, les animaux seront traités quotidiennement avec plusieurs composés par différentes voies d'administration selon les objectifs de l’étude (durée de 1 à 5 minutes selon la voie choisie). Le traitement pourra également être administré via des pompes diffusant les composés, implantées sous anesthésie et analgésie. [MODIFICATION: Les animaux seront soumis à un test d'effort sur tapis roulant dont la l'intensité maximale augmente progressivement jusqu'à l'épuisement de l'animal. Ce test sera réalisé au maximum 2 fois au cours du protocole, avant le début des traitements et à la fin du protocole (durée maximale du test 35 min).] Au cours du protocole, les animaux seront à nouveau anesthésiés afin de réaliser une imagerie cardiaque (environ 20 min) pour contrôler les répercussions de l'induction de la pathologie et l'effet potentiel des nouvelles molécules thérapeutiques à tester. Une autre imagerie cardiaque sera effectuée en fin de protocole (environ 20 min), puis une chirurgie sera effectuée sous anesthésie et analgésie afin de réaliser des mesures de pression dans le cœur et dans l'artère pulmonaire (environ 20 min). Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours du protocole sur animaux vigiles ou anesthésiés (environ 5 minutes par prélèvement), ou en fin de protocole après les mesures de pression et avant leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux recevront une substance destinée à provoquer la maladie étudiée. Cette administration est réalisée sous anesthésie générale et peut entraîner une gêne passagère, notamment au niveau respiratoire ainsi qu'une gêne au niveau du site d'injection (démangeaisons, sensation de brûlure). Avec le développement de la maladie, les animaux peuvent présenter une diminution de l’activité, une baisse de l’appétit et de la prise de boisson, pouvant conduire à une perte de poids. Une intervention chirurgicale pourra être réalisée pour implanter un dispositif diffusant le traitement. Cette intervention implique une ouverture de la peau et peut entraîner une douleur ou une gêne temporaire liée à la présence du dispositif. L’administration répétée de médicaments peut générer du stress, car elle nécessite une manipulation et une contention des animaux. Certains effets indésirables liés aux médicaments testés ou aux gestes techniques peuvent survenir, en particulier avec de nouvelles molécules. Des prises de sang et des examens d’imagerie cardiaque seront réalisés sous anesthésie ou avec contention, ce qui peut entraîner un inconfort temporaire, du stress ou une douleur légère. [MODIFICATION: Les tests d'efforts induisent un stress comportemental et physique.]. En fin de protocole, des mesures complémentaires seront effectuées sous anesthésie générale.
Devenir
Afin de caractériser l'effet des traitements testés, notamment l'effet biologique, nous devons faire des mesures qui sont trop invasives pour permettre le réveil de l’animal, et il est indispensable de récupérer le cœur et les poumons en fin d'expérience pour évaluer l’efficacité des traitements
Remplacement
Ce projet vise à évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments dans un organisme vivant. Les tests réalisés sur des cellules ou des tissus isolés ne permettent pas d’étudier les effets globaux du médicament sur le cœur et les poumons. L’utilisation d’un modèle animal est nécessaire pour mieux comprendre ces effets et le comportement du médicament dans le corps.
Réduction
Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données précédemment acquises dans notre laboratoire. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, de l'imagerie est utilisée pour permettre de suivre plusieurs paramètres dans le temps sur le même animal.
Raffinement
A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Une grille de score est établie afin de faire un suivi clinique des animaux, avec la mise en place de mesures adaptées en fonction du score et des critères d’arrêt de souffrance. Des enrichissements multiples leur sont proposés en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Lorsqu’une chirurgie avec réveil sera nécessaire, elle sera réalisée en conditions propres (sans microbes) et les animaux auront un suivi post-opératoire intensif pendant au moins 3 jours. Par ailleurs, les animaux seront habitués à la manipulation et à la contention ainsi qu’aux environnements nouveaux afin de réduire le stress. [MODIFICATION: A la suite des tests d'efforts, les animaux seront réhydratés. Les animaux seront habitués au tapis roulant à hauteur de 3 fois maximum par semaine à faible intensité.]
Choix des espèces
Le rat est le modèle animal le plus approprié pour cette étude car la maladie peut y être reproduite de façon fiable et ses effets sur le cœur sont comparables à ceux observés chez les patients. Sa taille permet également de réaliser des prises de sang répétées pour mieux suivre l’action du médicament dans l’organisme. Des rats entre 4 et 8 semaines au moment où ils arrivent en acclimatation dans nos locaux sont utilisés dans ce modèle. L’âge des animaux impactant la sévérité du modèle, ces paramètres seront choisis selon les objectifs de l’étude.
Evaluation préclinique de microsuture après implantation autour du système nerveux périphérique-MODIFICATION
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Lapins : 204
Sous anesthésie générale, le nerf sciatique de 204 rats et 204 lapins, intact ou lésé au préalable par chirurgie, reçoit un fil de microsuture ou une gaine lors d'une opération de 20 à 40 minutes, suivie d'environ deux semaines d'examens quotidiens. Ces 408 rats et lapins sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, puis tous mis à mort pour l'analyse au microscope du nerf et des tissus voisins. Il s'agit d'essais de sécurité et de performance de dispositifs médicaux, commandés par un "donneur d'ordre" en vue d'une autorisation de mise sur le marché. Le résumé déclare des procédures sévères mais ne cite comme effet néfaste que la douleur liée à l'implantation, et il annonce des tests de motricité et de sensibilité sans dire lesquels.
Objectifs
Ce projet vise à développer un modèle animal adéquat pour étudier la tolérance locale (évaluation de la réaction d’un organisme en contact avec un produit étranger) et/ ou la performance de dispositif médicaux destiné à une utilisation en microchirurgie notamment et plus spécifiquement en neurochirurgie pour anastomose des nerfs périphériques après coupure/cassure (fil de microsuture ou nerve wrap (gaine/feuillet qui se met autour de chaque extrémité du nerf) par exemple. L’utilisation clinique de ces types de produit étant le même à savoir l’anastomose en microchirurgie, leur dénomination est regroupée sous le terme « microsuture »).). La neurochirurgie comprend toute chirurgie qui interviendrait au niveau du système nerveux central ou périphérique. L’anastomose des nerfs périphériques est une des neurochirurgies les plus courantes et peut survenir à la suite de nombreux traumatismes (coupures, accident de la route, …). La sécurité biologique sera évaluée par analyses des tissus qui ont été en contact avec les dispositifs médicaux sutures. La performance technique (cohésion du fil tout au long de l’implantation par exemple) ou la performance biologique (le fait que le nerf retrouve sa fonction après une cassure, par exemple) pourront aussi être évaluées. L’ensemble de ces données permettra de réduire les risques de complications lors des phases de tests des produits chez l’humain. Dans le cadre de ce projet, des formations adaptées pourront être menées afin d'assurer et de maintenir les compétences du personnel de l'EU sur les études couvertes par ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’obtenir un modèle animal fiable et reproductible pour l’obtention de données de sécurité des microsutures/pansements ou autre dispositif médical utilisés en neurochirurgie. Ainsi avec ce projet, il est possible d’analyser ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché. Ce modèle animal pourra être utilisé en vue de sélectionner un produit parmi un panel de produits en développement (essais de screening), en comparant leurs données de sécurité. Ces essais de screening sont essentiels dans la stratégie de réduction du nombre total d’animaux utilisés, en poussant seulement le développement des produits les plus intéressants et en écartant rapidement des recherches les produits ne présentant pas les qualités de sécurité satisfaisantes. Par la suite des essais de screening, ce modèle animal permet aussi de mener des essais de confirmation de sécurité / performance d’un produit en développement, en le comparant à un autre produit déjà commercialisé, afin de s’assurer qu’il présente un bénéfice au moins égal ou supérieur.
Procédures
L’ensemble des animaux sera opéré sous anesthésie générale et traitement analgésique pour placer le dispositif médical autour du nerf sciatique (intact ou lésé chirurgicalement). Cette intervention chirurgicale aura une durée d’environ 20 à 40 minutes. Les animaux seront ensuite examinés quotidiennement pendant la phase post-opératoire (environ 14 jours) pour pouvoir apprécier la bonne guérison du site chirurgical et évaluer les signes de douleur, les effets sensoriels et sur la motricité. Enfin, pour évaluer l’efficacité et l’absence d’effet indésirable, des prises de sang pourront être réalisées sur les animaux en cours d’étude. Celles-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). Ils seront finalement mis à mort pour permettre l’observation et l’analyse microscopique des tissus de la zone d’implantation (nerf et tissus environnants).
Impact sur les animaux
A l’instar des effets secondaires possibles chez l’humain lors de microsutures, les effets indésirables connus pouvant survenir chez l’animal sont : - douleur et stress liés à l’implantation du fil de microsuture auour du nerf sciatique, controlée par la prise d’analgésique (morphonique) et par la réalisation d’une anesthésie générale.
Devenir
Afin de s’assurer de la sécurité des dispositifs médicaux une observation des tissus environnant la zone d’implantation est nécessaire. Ceci permet d’évaluer la tolérance locale de ces produits, ce qui est l’objectif des études réalisées dans ce projet. Des prélèvements de tout ou partie de certains organes peuvent éventuellement être nécessaires, en particulier en cas d’anomalie constatée, pour évaluer les effets tissulaires à l’échelle microscopique. L’ensemble de ces éléments explique l’impossibilité en fin d’étude de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
Les essais in vivo de sutures/nerve wrap de microchirurgie sont nécessaires car les interactions complexes s’établissant entre le dispositif médical et le système nerveux périphérique ne peuvent être recréées ex vivo. Il n’existe donc pas de méthodes alternatives pour prouver l’efficacité des sutures/ nerve wrap de microchirurgie. Des mesures ex vivo (tests de sutures/ nerve wrap sur/autour d’un nerf du système nerveux périphérique d’un animal euthanasié) peuvent être réalisées en amont des études in vivo, et permettent d’estimer les meilleures conditions pour disposer le fil de microsuture / nerve wrap. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de fournir l’ensemble des réponses nécessaires à l’évaluation de la sécurité des produits de sutures de microchirurgie en vue de leur utilisation chez l’humain. Les études in vivo sont donc nécessaires pour répondre aux exigences réglementaires et de qualité dans le but de mettre sur le marché les produits de sutures/ nerve wrap de microchirurgie.
Réduction
Le donneur d’ordre demandant la réalisation de ces tests s’engage à ne pas faire renouveler à l’identique un essai déjà mené précédemment. De plus, l’interprétation des résultats nécessite toujours de comparer ceux obtenus chez des animaux qui reçoivent le produit évalué avec ceux obtenus d’animaux qui reçoivent un produit « contrôle », dont l’effet attendu est déjà connu. Pour réduire encore le nombre d’animaux inclus en étude, il est possible d’utiliser un même groupe « contrôle » pour plusieurs groupes « test » recevant des produits à tester différents. Enfin, nous avons déjà mentionné la possibilité de réaliser des études pour sélectionner parmi un panel de produits celui qui présente le plus d’intérêt à être développé, réduisant ainsi le nombre de tests réalisés sur des produits ayant un intérêt moindre. Par ailleurs, si l’effet attendu d’un produit est trop incertain, il est possible de réaliser une étude dite « pilote » sur quelques animaux seulement. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit, avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc). Le nombre d'animaux étant réglementé par les normes, aucune approche statistique ne sera réalisée.
Raffinement
-La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). En phase postopératoire immédiate, les suivis quotidiens sont renforcés pour détecter précocement tout signe clinique ou de douleur. En cas de signes de douleur, un traitement analgésique supplémentaire est administré. Des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (surveillance ou réfection des pansements (si applicable), désinfection des sites chirurgicaux …). - Point limites stricts et spécifiques du projet : Les animaux seront suivis quotidiennement à l'aide d’une grille de suivi du bien-être animal portant spécifiquement sur l'apparition de lésion auto-induite et un suivi de la locomotion et des signes de douleurs.
Choix des espèces
Le lapin est un modèle de plus en plus utilisé pour réaliser des expériences sur les nerfs périphériques alors que le rat reste le premier modèle qui avait été développé faisant de ces deux modèles, des modèles de choix en termes de disponibilité de la littérature. Le choix entre les deux espèces, sera surtout en fonction de la taille du nerf ciblé ou en fonction de la taille du dispositif. En effet la taille du nerf sciatique chez le lapin (le plus cité dans la littérature) est équivalente aux nerfs que l’on peut retrouver au niveau du poignet ou des mains chez l’Homme (diamètre compris entre 2 et 4 mm, longueur inférieure à 30mm). Le rat par ailleurs est une espèce chez laquelle différents tests et scoring de motricité et de sensorialité ont été établis dans la littérature, permettant un suivi précis des animaux opérée. L’utilisation d’animaux adultes d’un poids minimum de 2,5 kg pour les lapins ou d’environ 300g pour les rats lors de la chirurgie est recommandée, afin de limiter les risques liés à l’anesthésie et de permettre la mise en oeuvre des techniques chirurgicales et post-opératoires adéquates.
Impact du retard de croissance intrautérin sur l’integrité des interfaces sang-cerveau fetales chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Accouplées une seule nuit, soumises sans anesthésie à un frottis vaginal pour dater la gestation, puis nourries d'un régime pauvre en protéines jusqu'au terme, 16 rates Sprague Dawley vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce régime doit provoquer un retard de croissance chez leurs fœtus, et le porteur indique qu'il peut entraîner chez les mères inactivité et perte de poids, les rates étant hébergées seules à partir du quinzième jour. Au dix-neuvième jour de gestation, chaque rate est anesthésiée puis opérée sans réveil pour exposer ses fœtus un par un et leur injecter un traceur qui mesure la perméabilité des barrières entre le sang et le cerveau. Toutes sont mises à mort ce jour-là, et les fœtus, jusqu'à six analysés par femelle, ne sont pas comptés dans l'effectif de 16.
Objectifs
Le retard de croissance intra-utérin est un facteur de risque d’apparition de troubles du neurodéveloppement chez l’enfant, et des travaux antérieurs montrent que les interfaces sang-cerveau qui protègent le tissu cérébral sont fragilisées à la naissance, avec pour conséquence une exposition augmentées aux stress environnementaux ou inflammatoires. L’objectif de notre projet est de comprendre si le retard de croissance intra-utérin impacte l’intégrité des barrières sang-cerveau avant la naissance, chez le fœtus
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’apporter des informations importantes concernant l’impact du RCIU sur la mise en place des barrières sang-cerveau au cours du développement prénatal, et donc la protection du cerveau en développement. Nos résultats précédents montrent une altération de l'intégrité de ces barrières chez le nouveau-né mais la précocité de cet effet délétère du RCIU n’est pas connue, alors même que la période fœtale tardive est particulièrement impliquée dans l’étiologie des troubles neurodéveloppementaux. Ce projet permettra donc de définir si une vigilance accrue à l’exposition à des stress environnementaux et inflammatoires est nécessaire avant la naissance, voire d’envisager un traitement protecteur des interfaces en fin de grossesse.
Procédures
Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et une femelle par cage) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime alimentaire hypo-protéiné durant toute la période de gestation (8 femelles). Enfin au 19ième jour de gestation les animaux sont anesthésiés, une chirurgie expose les fetus un par un et permet d’injecter un traceur pour mesurer la perméabilité des interfaces sang-cerveau (chirurgie sans réveil). Les animaux non injectés sont également utilisés pour collecter des tissus à des fins d’analyses biochimique et moléculaire.
Impact sur les animaux
Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une perte de poids associées à ce régime pourront être observées durant la période de gestation. La seconde procédure est sans réveil.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort au 19ième jour de gestation, en raison de l'utilisation des fœtus pour les mesures de perméabilité
Remplacement
Bien que des modèles in vitro de barrières sang-cerveau (e.g. cellules endothéliales cérébrales) existent, ils ne reflètent pas le fonctionnement spécifique des interfaces fœtales, ne permettent pas d’étudier l'influence globale des différentes cellules cérébrales sur la perméabilité de ces interfaces, et ne permettent pas de mimer des pathologies périnatales aussi complexes que le RCIU. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.
Réduction
Nous prévoyons, qu’un nombre de 8 rates par lot expérimental (RCIU, Control) est suffisant, afin de remplir les Conditions statistiques de test de significativité. Six foetus peuvent être analysés pour chaque femelle gestante. La valeur de perméabilité fœtale est consolidée par l’analyse de 6 fœtus, mais la variabilité du degré de retard de croissance induit d’une femelle à l’autre, nécessite se nombre d’animaux.
Raffinement
Les rates gestantes soumises au régime pauvre en protéine seront hébergées individuellement à partir du quinzième jour de gestation et leur poids sera suivi régulièrement tous les trois jours à partir de la mise en reproduction. Les conditions d’hébergement sont règlementaires : enrichissement systématique des cages (bâtonnets à ronger), limitation du bruit, manipulations réalisées par un personnel formé et, autant que possible, par les mêmes expérimentateurs afin de limiter le stress. Pendant l’hébergement individuel, les animaux sont logés dans des cages transparentes et grilles espacées, et la présence systématique d’autres animaux dans l’environnement immédiat de la cage est contrôlé afin de maintenir au maximum un contact visuel, olfactif, auditif et dans une moindre mesure tactile, en plus d'un milieu de vie sur-enrichi par l’ajout d’un objet supplémentaire dans la cage et de matériel de nidification. La méthode de RCIU que nous appliquons est reconnue comme moins invasive que les autres méthodes d’induction d’un retard de croissance (ligature des artères utérines). La mesure de perméabilité se fait entièrement sous anesthésie sans réveil.
Choix des espèces
Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats Sprague Dawley (SD), espèce utilisée dans nos travaux précédents. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requièrent une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits. Les données déjà acquises sur ce projet l'ont été avec ce modèle. Les animaux seront mis à mort lorsque les fetus auront atteint 19 jours de vie embryonnaire . Le but du projet est d'étudier la permeabilité des interfaces sang-cerveau au cours de la periode fetale tardive.
Modèle d’encéphalopathie induit par régime chez le rat BDL
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
Les rats de ce projet ont une maladie chronique du foie provoquée par chirurgie, et certains arrivent déjà opérés de chez un fournisseur spécialisé. 2 010 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, nourris pour certains d'un régime enrichi en protéines ou en ammoniac, et reçoivent une substance impliquée dans les troubles neurologiques de la maladie. S'y ajoutent des prises de sang, des traitements expérimentaux par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse, jusqu'à vingt minutes en enceinte thermostatique avant certaines injections, et des tests de mémoire, d'apprentissage et de motricité que le porteur ne nomme pas. Tous sont tués à l'issue, car les dosages prévus exigent un grand volume de sang prélevé en fin de vie et plusieurs tissus.
Objectifs
Les maladies chroniques du foie peuvent entraîner des troubles du fonctionnement du cerveau. Les personnes atteintes peuvent présenter des difficultés de concentration, de mémoire, de coordination des mouvements ou des changements de comportement. Dans les formes les plus sévères, l’état de conscience peut être altéré. L’objectif de ce projet est de développer et caractériser des modèles reproduisant certaines de ces complications chez le rat et d’utiliser ces modèles pour évaluer de futurs traitements. Pour cela, une maladie chronique du foie sera induite par une intervention chirurgicale. Cette intervention sera associée à une alimentation enrichie en protéines ou en ammoniac ainsi qu’à l’administration ponctuelle d’une substance impliquée dans l’apparition des troubles neurologiques observés chez les patients. Ces travaux permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes responsables de la maladie et d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques destinées à prévenir ou à réduire les troubles neurologiques associés aux maladies chroniques du foie. Les conditions expérimentales seront définies afin de reproduire des formes modérées de la maladie compatibles avec le bien-être des animaux.
Bénéfices attendus
Les maladies chroniques du foie peuvent provoquer des troubles du fonctionnement du cerveau. Les personnes atteintes peuvent présenter des difficultés de concentration, de mémoire, d’apprentissage ou de coordination des mouvements. Dans certains cas, ces troubles peuvent réduire l’autonomie des patients et avoir un impact important sur leur vie quotidienne et celle de leurs proches. Ce projet vise à développer des modèles permettant de mieux reproduire ces complications et de mieux comprendre les mécanismes responsables de leur apparition. Ces modèles seront également utilisés pour évaluer de nouveaux traitements destinés à prévenir, limiter ou corriger les troubles observés. À terme, ces travaux pourraient contribuer à améliorer la prise en charge des patients atteints de maladies chroniques du foie, à réduire les conséquences neurologiques associées à ces maladies, à préserver leur autonomie et à améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale accompagnée d'un traitement adapté contre la douleur. Cette intervention vise à provoquer une maladie chronique du foie similaire à celle observée chez certains patients. Selon la procédure concernée, les animaux pourront recevoir une injection sous-cutanée d'une substance impliquée dans l'apparition des troubles neurologiques observés chez les patients atteints de maladie du foie. Cette administration dure moins d'une minute. Un prélèvement sanguin pourra être réalisé au cours de l'étude ainsi qu'un prélèvement final. Ces actes sont effectués sous anesthésie gazeuse de courte durée, généralement comprise entre 2 et 5 minutes, et le prélèvement lui-même dure environ une minute. Les animaux pourront également recevoir un traitement expérimental administré par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse. Chaque administration dure habituellement moins d'une minute. Certaines administrations intraveineuses pourront nécessiter un maintien temporaire dans une enceinte thermostatique pendant une durée maximale de 20 minutes afin de faciliter l'administration. Dans certaines études, un traitement unique pourra être administré selon un principe de dialyse péritonéale sous anesthésie gazeuse de courte durée. L'administration dure environ une à deux minutes et l'anesthésie quelques minutes. Enfin, les animaux participeront à des tests comportementaux non invasifs destinés à évaluer l'activité, la mémoire, l'apprentissage ou les capacités motrices. Ces évaluations reposent principalement sur l'observation des animaux et ne nécessitent pas d'acte invasif.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale et bénéficieront d'un traitement adapté contre la douleur. Après l'opération, ils pourront présenter une gêne temporaire, une diminution transitoire de l'activité ou une baisse de l'alimentation. Au cours de l'étude, le développement de la maladie pourra entraîner une diminution modérée de la prise de poids, une baisse de l'activité spontanée ainsi que des modifications du comportement, de la mémoire, de l'apprentissage ou de la coordination des mouvements. Certains régimes alimentaires utilisés dans le projet pourront renforcer temporairement ces effets. Une substance impliquée dans les mécanismes de la maladie pourra également être administrée afin de reproduire certains épisodes observés chez les patients. Cette administration pourra entraîner, pendant une courte durée, une diminution de l'activité ou des capacités motrices. Les animaux feront l'objet d'une surveillance régulière tout au long du projet. Des critères d'arrêt prédéfinis permettront d'intervenir rapidement en cas d'aggravation inattendue afin de préserver leur bien-être.
Devenir
À l’issue des procédures, l’ensemble des animaux sera mis à mort afin de permettre la réalisation des prélèvements biologiques nécessaires à l’atteinte des objectifs scientifiques du projet. Les analyses prévues nécessitent le recueil d’un volume sanguin terminal important ainsi que la collecte de plusieurs tissus d’intérêt, notamment au niveau cervical. Ces prélèvements permettent la réalisation concomitante de nombreux dosages qui ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux. L’utilisation de prélèvements terminaux permet également de maximiser la quantité de données obtenues à partir d’un même animal et contribue ainsi à l’application du principe de réduction en limitant le nombre total d’animaux nécessaires au projet. En raison de la nature des prélèvements réalisés et de leur caractère invasif, aucun animal ne pourra être réutilisé à l’issue de l’étude.
Remplacement
Avant de réaliser les études chez l'animal, des tests in vitro et des approches de modélisation informatique sont utilisés pour sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs. Ces méthodes permettent notamment d'étudier l'action de composés sur des cellules, des tissus ou certaines bactéries présentes dans l'intestin, ainsi que de prédire certains de leurs effets dans l'organisme. Cependant, les troubles étudiés dans ce projet résultent d'interactions complexes entre plusieurs organes, notamment l'intestin, le foie, les reins et le cerveau. Aucune méthode alternative disponible aujourd'hui ne permet de reproduire simultanément l'ensemble de ces mécanismes dans un organisme vivant. Les méthodes sans animaux ne permettent pas non plus d'évaluer les effets de la maladie sur la mémoire, l'apprentissage, le comportement ou les capacités motrices, ni de mesurer l'efficacité globale d'un traitement dans l'organisme. Elles ne permettent pas davantage de suivre la façon dont un médicament est absorbé, transformé et agit sur différents organes. À ce jour, aucune méthode alternative validée ne permet donc d'atteindre les objectifs de ce projet sans recourir à l'animal.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés a été limité au strict minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Avant les études thérapeutiques, plusieurs phases de caractérisation permettront d'identifier les conditions expérimentales les plus adaptées et de vérifier la reproductibilité des modèles. Les connaissances acquises lors de ces premières étapes seront utilisées pour concevoir les études suivantes et éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires. Les mêmes animaux seront suivis à plusieurs reprises au cours des études afin de recueillir différentes informations (état général, prélèvements biologiques et évaluations comportementales) sans avoir à utiliser de nouveaux animaux. Les groupes expérimentaux ont également été conçus de façon à permettre la comparaison de plusieurs traitements au sein d'une même étude lorsque cela est possible. Cette stratégie permet d'obtenir un maximum d'informations à partir de chaque animal tout en utilisant le plus petit nombre d'animaux compatible avec la qualité et la fiabilité des résultats scientifiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions favorisant leur bien-être, avec un enrichissement du milieu comprenant notamment des abris, des matériaux permettant la construction de nids et des objets à ronger. Lorsque leur état le permet, ils seront maintenus en groupe. Certains animaux pourront être reçus déjà opérés auprès d'un fournisseur spécialisé. Dans tous les cas, une période d'acclimatation et une surveillance renforcée seront mises en place après leur arrivée ou après l'intervention chirurgicale. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec traitement contre la douleur. Les animaux bénéficieront d'une surveillance adaptée jusqu'à leur rétablissement complet et d'un complément alimentaire favorisant la reprise de l'alimentation. Avant le début des évaluations, les animaux seront progressivement habitués aux manipulations et aux différents tests afin de limiter le stress. Les conditions expérimentales seront définies de manière à reproduire des formes modérées de la maladie sans rechercher l'apparition de troubles sévères. Une surveillance régulière sera réalisée tout au long du projet afin de détecter rapidement toute dégradation de l'état des animaux. Des mesures adaptées seront mises en place si nécessaire et des critères d'arrêt prédéfinis permettront d'éviter toute souffrance excessive.
Choix des espèces
Aucun modèle alternatif ne permet aujourd'hui de reproduire l'ensemble des mécanismes impliqués dans les complications neurologiques associées aux maladies chroniques du foie. Le rat a été choisi car son organisme présente de nombreuses similitudes avec celui de l'Homme concernant le fonctionnement du foie, de l'intestin et du cerveau. Il permet également d'étudier la mémoire, l'apprentissage, l'activité et le comportement à l'aide de méthodes reconnues et largement utilisées en recherche pharmaceutique. Cette espèce est particulièrement adaptée au modèle utilisé dans ce projet, notamment pour la réalisation de l'intervention chirurgicale nécessaire à l'induction de la maladie. De plus, de nombreuses études scientifiques ont déjà été réalisées chez le rat, ce qui facilite la comparaison des résultats et contribue à limiter le nombre d'animaux nécessaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes. Ce stade de développement a été retenu car il correspond à celui le plus fréquemment utilisé pour l'étude de ces maladies et permet de réaliser les interventions et les évaluations prévues dans des conditions optimales.
Implantation d’un hydrogel, thermosensible et dégradable contenant un agent pharmacologique neuroprotecteur, dans le site lésionnel chez le rat ayant une ischémie cérébrale
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérés pour provoquer un accident vasculaire cérébral ischémique ou soumis à une chirurgie simulée selon leur groupe, puis injectés pour certains d'un hydrogel dans la zone lésée du cerveau, 438 rats âgés de 10 à 12 mois seront tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Une partie reçoit en plus un implant d'enregistrement de l'activité cérébrale, d'autres courent sur tapis roulant pendant deux semaines, et le porteur prévoit des déficits moteurs, une perte de poids et des difficultés à boire et à manger. Le projet teste si cet hydrogel chargé d'un traitement, associé à l'exercice, améliore la récupération motrice et cognitive. Le porteur qualifie les évaluations comportementales de "peu contraignantes" sans les nommer, et ne précise pas comment l'accident vasculaire est provoqué.
Objectifs
L’objectif principal est d’évaluer, après un accident vasculaire cérébral ischémique expérimental chez le rat, l’efficacité d’un hydrogel biodégradable permettant de délivrer localement et progressivement un traitement dans la région cérébrale lésée. Le projet étudiera les effets de cette approche sur la protection du cerveau et la récupération des fonctions motrices et cognitives. Il déterminera également si son association avec un programme précoce d’exercice physique améliore davantage la récupération que chaque intervention utilisée séparément.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de récupération du cerveau après un accident vasculaire cérébral. Il évaluera l’intérêt d’un hydrogel biodégradable comme moyen d’administrer localement et progressivement un traitement dans la région lésée. Les résultats permettront également de déterminer si l’association de ce traitement avec un programme d’exercice physique améliore la récupération motrice et cognitive. À terme, ces connaissances pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies combinant traitement local et rééducation physique après un accident vasculaire cérébral.
Procédures
Selon leur groupe, les animaux seront soumis à une chirurgie simulée ou à une intervention reproduisant un accident vasculaire cérébral ischémique transitoire. Certains recevront ensuite une injection locale d’un hydrogel, contenant ou non un traitement. Une partie des animaux recevra également, avant l’induction de l’accident vasculaire cérébral, un dispositif permettant d’enregistrer l’activité cérébrale. Après récupération, certains animaux réaliseront un programme adapté d’exercice sur tapis roulant pendant deux semaines. Des évaluations motrices et cognitives seront réalisées à plusieurs reprises. Tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale profonde à la fin du protocole afin de permettre l’analyse des tissus.
Impact sur les animaux
L’intervention reproduisant l’accident vasculaire cérébral peut entraîner une diminution de l’activité, des déficits moteurs, une fatigue, une perte de poids et des difficultés temporaires d’accès à l’eau ou à la nourriture. Les interventions chirurgicales peuvent provoquer une douleur postopératoire transitoire, une gêne locale, une inflammation ou, plus rarement, une infection ou une complication liée à un implant. L’exercice peut entraîner une fatigue transitoire ou de légères irritations des pattes. Les évaluations comportementales sont peu contraignantes. La douleur, l’état général, le poids, l’alimentation, l’hydratation et les sites opératoires seront surveillés régulièrement. Une analgésie et des soins adaptés seront administrés et des points limites précoces seront appliqués.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser les analyses histologiques, moléculaires et biochimiques nécessaires, ainsi que de vérifier la localisation des injections et, pour les animaux concernés, le positionnement des implants et l’expression des vecteurs. La réutilisation ou le maintien en vie ne sont pas compatibles avec le caractère invasif des procédures et la nécessité des prélèvements terminaux.
Remplacement
Il n’existe pas actuellement de méthode alternative permettant de reproduire simultanément les conséquences cérébrales et fonctionnelles d’un accident vasculaire cérébral, la réponse à un traitement délivré localement, ainsi que les effets de l’exercice sur la récupération. Les études réalisées sur des cellules ou des tissus isolés ne permettent pas d’évaluer les interactions entre la circulation sanguine, le cerveau et les fonctions motrices et cognitives. Le recours au rat est donc nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé par une analyse de puissance statistique réalisée avant l’étude. Celle-ci conduit à un effectif de 10 animaux exploitables par sexe et par groupe. Le suivi longitudinal et la réalisation de plusieurs évaluations chez un même animal permettent de limiter les effectifs. Des marges maximales sont prévues uniquement pour compenser d’éventuelles pertes techniques ou expérimentales. Elles ne seront mobilisées qu’en cas de besoin. Ainsi, les 438 rats demandés constituent un maximum réglementaire et non un nombre qui sera systématiquement utilisé.
Raffinement
Les animaux seront habitués progressivement aux manipulations, aux tests et au tapis roulant. Toutes les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie préventive et postopératoire adaptée. La méthode MDA pourra être utilisée après habituation pour certaines administrations postopératoires de buprénorphine afin de limiter les contentions et les injections répétées. L’état général, le poids, l’alimentation, l’hydratation, la douleur et les sites opératoires seront surveillés régulièrement. De la nourriture humidifiée et de l’eau facilement accessibles seront proposées si nécessaire. Des points limites précoces entraîneront l’arrêt de la procédure et la mise à mort de l’animal lorsque son état l’exige.
Choix des espèces
Le rat (*Rattus norvegicus*) a été retenu car sa taille facilite les interventions neurochirurgicales, les injections intracérébrales, l'implantation de dispositifs chroniques (lentilles d'imagerie ou électrodes), les prélèvements sanguins répétés ainsi que les évaluations comportementales. Cette espèce est largement utilisée et validée dans les modèles d'accident vasculaire cérébral, ce qui permet de comparer les résultats obtenus à une littérature abondante. Les procédures expérimentales prévues dans ce projet ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives, car elles nécessitent d'étudier simultanément les effets du traitement, de l'exercice physique et leurs interactions sur le fonctionnement du cerveau, les capacités motrices et les fonctions cognitives au sein d'un organisme vivant. Des rats adultes âgés de 10 à 12 mois seront utilisés. Ce stade de développement correspond à un âge où les capacités de récupération cérébrale commencent à diminuer, ce qui permet de se rapprocher davantage de la population humaine concernée par les accidents vasculaires cérébraux et d'améliorer la pertinence des résultats obtenus. Des rats âgés de 10- 12 mois (500-700g) seront utilisés dans ce projet.
Modèle d’entéropathie induite par le méthotrexate chez le rat et la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 758
1 516 rongeurs, 758 souris et 758 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des injections répétées dans l'abdomen d'un produit, le méthotrexate d'après le titre, abîment leur paroi intestinale pendant 14 à 16 jours, avec perte de poids, baisse d'appétit et troubles digestifs, auxquels s'ajoutent jusqu'à deux traitements par jour, un jeûne de 6 à 16 heures et un gavage de marqueur. Le but est de mettre au point une méthode d'induction de lésions intestinales pour tester des traitements contre l'aggravation des maladies chroniques du foie. Le porteur écrit qu'"aucune douleur significative" n'est attendue, et subordonne pourtant le recours à une analgésie morphinique à sa "compatibilité avec les objectifs scientifiques".
Objectifs
Notre laboratoire cherche à mieux comprendre le rôle de l’intestin dans l’aggravation de certaines maladies chroniques du foie. Chez les personnes atteintes de cirrhose, une altération de la paroi intestinale peut favoriser le passage de bactéries ou de substances normalement contenues dans l’intestin vers l’organisme. Ce phénomène peut contribuer à déclencher ou à amplifier une inflammation importante et favoriser l’apparition d’une défaillance de plusieurs organes suite une atteinte chronique du foie. L’objectif de ce projet est de développer un modèle expérimental permettant de reproduire de façon contrôlée ces altérations précoces de la barrière intestinale et d’en étudier les conséquences. Ce modèle permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le passage de bactéries et de substances inflammatoires depuis l’intestin vers le reste de l’organisme. Il servira également à évaluer de nouveaux traitements destinés à protéger ou restaurer la fonction normale de la barrière intestinale, à limiter le passage de substances indésirables dans l’organisme et, à plus long terme, à prévenir l’aggravation des maladies chroniques du foie.
Bénéfices attendus
Les maladies chroniques du foie peuvent s’aggraver lorsque la paroi intestinale est endommagée. Dans cette situation, des bactéries ou des substances normalement présentes dans l’intestin peuvent plus facilement passer dans l’organisme et contribuer à entretenir une inflammation importante. Ce phénomène est suspecté de jouer un rôle dans l’aggravation de certaines maladies du foie et dans l’apparition de complications sévères. Ce projet vise à développer un modèle expérimental permettant d’étudier ces altérations de la paroi intestinale et leur réparation. Il permettra de mieux comprendre comment l’intestin participe à l’évolution des maladies du foie et d’identifier les mécanismes impliqués dans le rétablissement d’une fonction intestinale normale. Ce modèle sera également utilisé pour évaluer de nouveaux traitements destinés à protéger ou restaurer la paroi intestinale après une lésion. Les résultats obtenus seront comparés à ceux d’un second modèle expérimental étudiant d’autres aspects du fonctionnement de la barrière intestinale. Cette approche permettra de mieux comprendre le mode d’action des traitements étudiés et d’identifier les candidats les plus prometteurs. À plus long terme, les connaissances acquises pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter l’aggravation des maladies chroniques du foie et à réduire le risque de complications sévères associées à ces pathologies.
Procédures
Les animaux recevront plusieurs administrations en intrapéritonéal d’un produit permettant d’induire une altération modérée et transitoire de la fonction de protection de l’intestin afin de reproduire certaines situations observées chez l’Homme. La durée maximale des procédures sera de 16 jours chez le rat et de 14 jours chez la souris. Selon les procédures, les animaux pourront recevoir un ou plusieurs traitements expérimentaux ou leurs véhicules par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse. Ces administrations pourront être réalisées jusqu’à deux fois par jour pendant plusieurs jours afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques. Lors des injections intraveineuses, les animaux pourront être placés dans une enceinte chauffée pendant une durée maximale de 20 minutes afin de faciliter l’injection. Afin d’évaluer cette fonction de protection intestinale, les animaux seront soumis à une courte période de jeûne (16 heures chez le rat et 6 heures chez la souris), puis recevront par gavage une substance marqueur permettant de suivre son passage à travers la paroi intestinale. Chez le rat, plusieurs prélèvements sanguins seront réalisés au cours de l’étude. Ces prélèvements seront effectués sous anesthésie gazeuse de courte durée (2 à 5 minutes). Chez la souris, l’évaluation reposera sur un prélèvement sanguin final réalisé sous anesthésie gazeuse, suivi d’une mise à mort sans réveil.
Impact sur les animaux
Les effets attendus dans ce modèle concernent principalement le système digestif. Après l’administration du produit, les animaux peuvent présenter une diminution temporaire de leur activité, une baisse de leur consommation de nourriture et d’eau ainsi qu’une perte de poids modérée. Des troubles digestifs légers à modérés, pouvant se traduire par un inconfort abdominal ou des modifications des selles, peuvent également être observés. Ces effets sont généralement transitoires et font l’objet d’une surveillance attentive tout au long de l’étude afin de garantir le respect du bien-être animal. Pour certaines évaluations, les animaux seront soumis à une courte période de jeûne (16 heures chez le rat et 6 heures chez la souris) pouvant entraîner un inconfort léger et temporaire. Cette évaluation nécessite également l’administration d’un marqueur par voie orale suivie d’un prélèvement sanguin sous anesthésie.
Devenir
À l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort afin de permettre la réalisation des examens nécessaires à l’atteinte des objectifs du projet. Les analyses des échantillons de sang ainsi que différents organes, en particulier l’intestin, permettront d’évaluer les effets du traitement et de mieux comprendre les mécanismes étudiés. Ces analyses nécessitent le prélèvement de quantités de sang et de tissus qui ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux. La collecte de plusieurs échantillons chez un même animal permet d’obtenir un maximum d’informations à partir de chaque individu et contribue ainsi à réduire le nombre total d’animaux nécessaires à la réalisation du projet. En raison de la nature des prélèvements réalisés et des analyses prévues, les animaux ne pourront pas être réutilisés dans d’autres études après la fin de la procédure.
Remplacement
Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’altération de la barrière intestinale et à évaluer de nouveaux traitements destinés à préserver ou restaurer son intégrité. Avant leur évaluation chez l’animal, les composés candidats sont sélectionnés à l’aide de méthodes alternatives telles que des cultures cellulaires et des modèles simplifiés de tissus intestinaux. Ces approches permettent de limiter le recours aux animaux conformément au principe de remplacement de la règle des 3R. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans le fonctionnement normal de l’intestin ni les conséquences d’une altération de la barrière intestinale dans un organisme vivant. Elles ne permettent notamment pas d’étudier les interactions entre les cellules intestinales, le système immunitaire, les micro-organismes naturellement présents dans l’intestin et les différents tissus de l’organisme. Elles ne permettent pas non plus d’évaluer de manière fiable l’absorption, la distribution et l’élimination des traitements étudiés, ni leurs effets sur la restauration de la fonction barrière dans un organisme complet. Le recours à un modèle animal reste donc nécessaire pour étudier les mécanismes impliqués dans l’altération de la perméabilité intestinale et pour déterminer si de nouveaux traitements sont capables de prévenir ces altérations ou d’en favoriser la réparation. À ce jour, aucune méthode alternative validée ne permet de répondre à l’ensemble des objectifs scientifiques du projet avec un niveau de fiabilité comparable à celui obtenu dans un organisme vivant complet.
Réduction
Les effectifs animaux ont été déterminés de manière à utiliser le plus petit nombre d’animaux compatible avec l’obtention de résultats scientifiquement fiables. Ce nombre s’appuie sur les connaissances acquises dans la littérature scientifique ainsi que sur l’expérience de l’établissement dans l’étude des altérations de la barrière intestinale. Les études de caractérisation du modèle seront réalisées par étapes afin d’identifier les conditions expérimentales les plus pertinentes avant la mise en œuvre des études thérapeutiques. Cette approche permet de limiter la répétition inutile d’expériences et de réduire le nombre total d’animaux utilisés. Plusieurs analyses biologiques et histologiques seront réalisées à partir de chaque animal afin d’obtenir un maximum d’informations à partir des mêmes prélèvements. Les données obtenues au cours du projet seront utilisées pour orienter les phases suivantes de l’étude et ajuster les effectifs lorsque cela sera possible sans compromettre la qualité des résultats. L’ensemble de ces mesures a été conçu pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse scientifique du projet, conformément au principe de réduction de la règle des 3R.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière de leur état général. Une attention particulière sera portée à leur poids, à leur consommation de nourriture et d’eau ainsi qu’à leur comportement. Afin de limiter les conséquences de l’atteinte intestinale induite au cours de l’étude, des aliments enrichis et faciles d’accès seront mis à disposition lorsque cela sera nécessaire. L’état d’hydratation sera également surveillé et des gels hydratants pourront être fournis aux animaux en cas de besoin. Le projet prévoit également l’évaluation de mesures destinées à réduire davantage l’inconfort des animaux. L'opportunité d'un recours à une analgésie, de type morphinique, sera évaluée tout au long du projet. Bien qu'aucune douleur significative ne soit attendue, cette mesure pourra être mise en œuvre si des signes cliniques suggèrent un inconfort supérieur à celui anticipé et sous réserve de sa compatibilité avec les objectifs scientifiques. Des critères de surveillance prédéfinis permettront d’identifier rapidement tout signe de dégradation de l’état de santé ou du bien-être des animaux. Si nécessaire, des mesures adaptées seront immédiatement mises en place afin de limiter leur inconfort. Dans les situations où le niveau de souffrance dépasserait les limites préalablement définies, l’animal serait retiré de l’étude et euthanasié afin de prévenir toute souffrance inutile. L’ensemble de ces dispositions a pour objectif de réduire au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout en garantissant la qualité scientifique des résultats obtenus, conformément au principe de raffinement de la règle des 3R.
Choix des espèces
Les rats et les souris ont été sélectionnés car leur système digestif présente de nombreuses similitudes anatomiques, physiologiques et fonctionnelles avec celui de l’Homme. Ces similitudes permettent d’étudier de façon pertinente les altérations de la barrière intestinale et d’évaluer l’efficacité potentielle de nouveaux traitements dans des conditions proches de celles observées chez l’être humain. À l’inverse, les invertébrés ne possèdent pas une organisation du tube digestif ni une fonction de barrière intestinale comparables à celles des mammifères, ce qui ne permet pas de répondre aux objectifs du projet ni de prédire de manière fiable le devenir des candidats médicaments. Les rats et les souris sont largement utilisés dans ce domaine de recherche et bénéficient d’une importante base de connaissances scientifiques permettant une interprétation robuste des résultats. Le choix du rat ou de la souris dépendra des caractéristiques des composés étudiés ainsi que des connaissances acquises lors des étapes précédentes du projet. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes. À ce stade de développement, le système digestif est mature et la fonction de barrière intestinale est pleinement établie, permettant l’étude fiable des mécanismes impliqués dans son altération et sa réparation. Les rats seront âgés de 6 à 7 semaines à leur arrivée dans l’établissement et les souris de 6 à 8 semaines. L’utilisation de jeunes adultes permet également de limiter la variabilité biologique et d’améliorer la reproductibilité des résultats obtenus.
Rôle du circuit mésocorticolimbique dans les comportements liés à l’addiction à l’alcool : évaluation pharmacologique par imagerie calcique et étude causale par chemogénétique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les rats qui ne se mettent pas à boire de l'alcool en excès après environ huit semaines d'accès à une bouteille d'alcool à 20 % sont tués, de même que ceux qui n'apprennent pas à appuyer sur un levier pour en obtenir. 3 240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comprendre pourquoi certaines personnes perdent le contrôle de leur consommation d'alcool. Les rats retenus sont opérés du cerveau pendant 90 à 120 minutes pour recevoir un vecteur viral et une lentille d'imagerie, logés seuls, puis s'administrent de l'alcool cinq jours par semaine pendant trois à quatre mois, et les tests de compulsion ajoutent de la quinine à l'alcool ou des chocs électriques aux pattes, jusqu'à 0,35 mA, sur neuf séances au plus. Sur 30 rats par groupe au départ, le porteur prévoit que 5 à 6 au plus développeront le comportement compulsif étudié, et qu'il faudra parfois refaire l'expérience sur une seconde cohorte.
Objectifs
L’alcoolodépendance est une maladie chronique caractérisée par une perte progressive du contrôle de la consommation d’alcool. Certaines personnes continuent à rechercher ou à consommer de l’alcool malgré des conséquences négatives importantes. Les traitements actuellement disponibles ne sont pas efficaces chez tous les patients, et les raisons de cette efficacité variable restent encore mal comprises. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes cérébraux impliqués dans les comportements liés à l’alcool, en particulier la motivation à obtenir de l’alcool, la persistance de la recherche d’alcool malgré une conséquence négative, et la reprise de ce comportement après une période d’arrêt. Pour cela, nous utiliserons un modèle chez le rat permettant de suivre plusieurs dimensions du comportement : la consommation volontaire d’alcool, l’apprentissage d’une réponse pour obtenir de l’alcool, la motivation, la perte de contrôle, l’extinction du comportement et sa reprise. Les animaux seront aussi étudiés avant et après administration de traitements pharmacologiques afin d’identifier pourquoi certains individus répondent à un traitement alors que d’autres y répondent peu ou pas. Le projet utilisera deux approches complémentaires. La première permettra d’enregistrer l’activité de neurones chez l’animal éveillé pendant les tests comportementaux. La seconde permettra de modifier temporairement l’activité de certains groupes de neurones pendant ces mêmes tests, afin de déterminer s’ils participent directement aux comportements observés. Ces approches permettront de mieux relier l’activité cérébrale aux comportements liés à l’alcool et à la réponse aux traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux comprendre pourquoi les individus ne sont pas tous égaux face au risque de perte de contrôle de la consommation d’alcool. Certains sujets développent des comportements persistants malgré des conséquences négatives, alors que d’autres restent plus sensibles à ces conséquences et diminuent leur recherche d’alcool. Les résultats attendus permettront d’identifier des mécanismes cérébraux associés à ces différences individuelles. Ils permettront également d’étudier comment l’activité de certains groupes de neurones change pendant la consommation, la motivation, la persistance du comportement et la reprise de la recherche d’alcool après une interruption. Un autre bénéfice important du projet est de mieux comprendre pourquoi certains traitements de l’alcoolodépendance sont efficaces chez certains individus mais pas chez d’autres. En comparant les animaux répondeurs et non répondeurs aux traitements, il sera possible d’identifier des signatures comportementales et cérébrales associées à une bonne ou à une mauvaise réponse thérapeutique. À plus long terme, ces connaissances pourraient contribuer à améliorer la compréhension des mécanismes de l’alcoolodépendance et à orienter le développement de stratégies thérapeutiques mieux adaptées aux différences individuelles entre patients.
Procédures
1- Chirurgies (Implantation de lentille, injection de vecteur viral, implantation de lentilles) : 1 seule chirurgie par rat - Durée de la chirurgie : 90 à 120 minutes. 2- Deux prélèvements de sang par rat au maximum sous anesthésie générale : durée de l'intervention : 3 minutes. 3- Auto-administration d'alcool : protocole de 15-30 minutes par jour, 5jours par semaine pendant 3-4 mois. 4- Injection intra-péritonéales : chaque animal recevra plusieurs injections sur toute la durée des mois d'auto-administration - Maximum de 12-14 injections.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont classées comme modérées. L’hébergement individuel est indispensable pour mesurer précisément la consommation d’eau et d’alcool de chaque rat, attribuer les réponses opérantes à un individu donné et éviter les biais liés à la hiérarchie sociale ou à l’accès différentiel aux bouteilles. Il peut entraîner un stress social. Cette contrainte sera compensée par un enrichissement compatible avec les objectifs expérimentaux et par une habituation régulière aux manipulations. Les étapes de consommation d’alcool ne sont pas associées à une douleur. Les procédures chirurgicales peuvent entraîner une douleur post-opératoire transitoire, un risque d’infection locale, une perte de poids transitoire ou une gêne liée à l’implant. Dans le cadre de l’imagerie in vivo, la connexion du miniscope à la base fixée sur le crâne est brève et non douloureuse, mais elle nécessite une manipulation à laquelle les animaux seront progressivement habitués. Les traitements pharmacologiques ou les ligands chemogénétiques pourront entraîner une gêne brève liée à la contention et à l’injection, ainsi que des effets transitoires dépendant du composé: baisse d’activité, sédation légère, modification de la locomotion ou irritation locale. Ces effets seront limités par l’utilisation de doses déjà décrites dans nos publications ou nos études en cours comme compatibles avec des tests comportementaux chez le rongeur, par l’adaptation des volumes au poids corporel, par l’habituation aux injections factices et par une surveillance post-administration. Toute altération persistante du comportement, de la mobilité, de l’alimentation ou du poids entraînera l’arrêt de l’administration, l’avis du responsable du bien-être animal et, si nécessaire, du vétérinaire.Les tests de compulsion pourront utiliser soit l’adultération de la solution d’alcool par la quinine, soit une punition électrique brève et de faible intensité, comprise entre 0,1 et 0,35 mA pendant 0,5 sec, au maximum pendant 9 sessions opérantes de 15 min. Cette conséquence peut induire une gêne transitoire aux pattes, évitable par l’arrêt de l’appui sur le levier actif. La perfusion transcardiaque réalisée sous anesthésie terminale sera effectuée uniquement sur des animaux profondément anesthésiés, sans réveil, et ne provoquera donc pas de perception consciente de douleur. Les nuisances associées seront limitées à la phase précédant l’anesthésie intrapéritonéale kétamine/xylazine.
Devenir
Pour induire une forte consommation d'alcool chez les rats, une première étape de consommation volontaire intermittente est réalisée pendant environ 8 semaines. Les rats ont accès à deux bouteilles pendant 24 heures : une contenant de l'alcool à 20% v/v et une contenant de l'eau. Certains rats développent une consommation excessive d'alcool après environ 10 à 12 sessions, tandis que d'autres ne le font pas. Ceux qui ne développent pas une consommation excessive d'alcool sont euthanasiés, et des échantillons de tissus tels que le foie ou le cerveau peuvent être prélevés sur ces animaux pour des tests ultérieurs. Les rats qui réussissent la tâche d'auto-administration opérante d'alcool sont sélectionnés pour les chirurgies. Ceux qui ne parviennent pas à acquérir cette compétence sont également euthanasiés eet des échantillons de tissus peuvent être prélevés sur eux. À la fin de l'étude, une perfusion transcardiaque sera réalisée pour chaque animal afin de réaliser des analyses histologiques, anatomiques ou neurobiologiques. La perfusion transcardiaqu sera effectuée sous anesthésie générale profonde, sans réveil de l’animal. L’anesthésie sera induite par une injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine à la dose de 200/20 mg/kg. La perfusion ne sera initiée qu’après vérification de la profondeur anesthésique, comprenant l’absence de réflexe cornéen, l’absence de réflexe de retrait à un pincement de la patte et l’absence de réaction à une stimulation nociceptive. Si ces critères ne sont pas atteints, la perfusion sera différée et l’anesthésie sera prolongée ou complétée avant toute intervention. Après confirmation de l’anesthésie profonde, une thoracotomie sera réalisée, puis la perfusion transcardiaque sera effectuée avec une solution tampon, suivie si nécessaire d’une solution fixatrice adaptée aux analyses prévues, par exemple du paraformaldéhyde à 4 %. L’animal restera sous anesthésie profonde pendant toute la procédure. La mort sera confirmée par l’arrêt respiratoire et cardiaque à l’issue de la perfusion.
Remplacement
Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Les modèles que nous avons choisis font partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature. L'animal dans son entièreté est le seul modèle disponible actuellement pour remplir les objectifs de ce projet.
Réduction
Pour les tests comportementaux, nous identifions le minimum d’animaux nécessaires pour un résultat statistiquement significatif, qui est déterminé en utilisant une « power analysis » basée sur nos résultats précédents, et un n = 30/groupe est généralement suffisant. Il est donc nécessaire de commencer avec un grand nombre d'animaux dans nos groupes. Si nous avons initialement 30 rats par groupe, nous perdrons ensuite environ 15 à 20 % des rats après la première étape d'acquisition de consommation volontaire excessive d'alcool, puis encore 15 à 20 % à la seconde étape d'acquisition de tâche opérante. Cela nous amènera à avoir une vingtaine de rats par groupe avant les tests de compulsivité. Théoriquement, nous aurons au maximum 5 à 6 rats qui développeront un comportement compulsif. Cela représente le nombre minimum nécessaire pour effectuer des tests statistiques. A noter donc qu’il est des fois nécessaires de répéter chaque expérience sur deux cohortes indépendantes, si le nombre de rats compulsif est inférieur à 5. Les tests statistiques utilisés seront des analyses ANOVA suivi d’analyses post hoc. Ces études se feront de manière longitudinale, afin de tester plusieurs paramètres (la consommation du type «binge »; perte de contrôle ; motivation ; consommation compulsive ; abstinence et rechute) chez le même animal afin de réduire au maximum le nombre de rats utilisés. Par ailleurs, les animaux sont surveillés quotidiennement.
Raffinement
Les animaux seront stabulés dans des cages enrichies grâce à un tube en carton et une buchette en bois. Les animaux seront manipulés 5 jours par semaine avec une intensification du "handling" durant les jours suivant l'arrivée des animaux au sein de la plateforme, permettant ainsi une forte réduction du stress. Par la suite tous les jours de la semaine (5 jours par semaine) les animaux seront manipulés avant et après la mise en place dans les cages d'auto-administration. Nous utiliserons la Rat Grimace Scale (RGS) tout au long de ce projet pour l'évaluation du niveau de souffrance/douleur. En fonction du score différentes procédures d'analgésie (paracétamol, Pracétam 20% 100 ou 200 mg/kg) seront appliquées pour réduire voire annuler toute souffrance ressentie par les animaux. Dans les cas où un rat présenterait une faiblesse musculaire, tonique, nous lui administrerons une injection de solution glucosée (5%, 10 mL/kg) 2 fois par jour en intra-péritonéale et nous utiliserons de l'aliment en poudre supplémenté en solution glucosée (5%) pour faciliter la prise alimentaire. Pour la chirurgie, une prémédication au paracétamol (Pracétam 20%) à 200 mg/kg 24 heures avant la chirurgie sera mise en place. Les animaux seront sur un tapis chauffant avec pose de gel occulaire. La profondeur de l'anesthésie sera controlée toutes les 5 minutes. Les opérations d'injection ou d'implantation seront réalisées sous anesthésie gazeuse et analgésie générale et locale. Au cours de la période post-opératoire, les rats recevront automatiquement une dose de 200 mg/kg de paracétamol dans l'eau de boisson pour au minimum 3 jours. Ensuite en fonction du score obtenu par la RGS, nous utiliserons soit une dose de 200 mg/kg (score de 5 et 6) ou 100 mg/kg (score de 3 et 4).
Choix des espèces
Le rat est l’animal le plus couramment utilisé dans les études d’auto-administration opérante d’alcool de part ses capacités d’apprentissage de la tâche opérante mais également pour son attrait naturel pour l’alcool. Les rats adultes seront agés de 8 semaines à leur arrivée au laboratoire pour une utilisation allant de quelques semaines à plusieurs mois.
Elevage et caractérisation génétique par prélèvement, de modèles de rongeur permettant l’étude et l’évaluation de composés thérapeutiques ciblant les troubles neurologiques (Projet multi-sites : 2/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Rats : 24000
Une puce électronique et une biopsie sur rongeur éveillé, trente secondes chacune, sont les seuls actes décrits pour 72 000 souris et 24 000 rats de lignées mutantes ou génétiquement modifiées, élevées dans deux établissements pour l'étude de maladies neurologiques. Ces 96 000 rongeurs vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré à sévère, avec un hébergement isolé des mâles jusqu'à sept jours pour "améliorer l'indice de productivité de la lignée". Le porteur ne mentionne qu'une "douleur légère" pour la biopsie, mais énumère pour ces lignées des crises épileptiques, une dysfonction motrice, une atrophie cérébrale, des cataractes et des troubles rénaux, et écrit que "Aucune approche statistique n'a été réalisée" pour fixer les effectifs. Le champ structuré les déclare tous morts, alors que le porteur indique qu'une partie est expédiée vers d'autres établissements, femelles gestantes comprises, ou gardée pour une "utilisation continue", les rongeurs sans génotype d'intérêt étant tués.
Objectifs
Les troubles neurologiques sont des maladies du système nerveux central ou périphérique, c’est-à-dire qu’elles touchent le cerveau, la moelle épinière, les nerfs crâniens et les nerfs périphériques. Il existe de nombreuses pathologies cérébrales comme la maladie d’Alzheimer, maladie de Huntington, maladie de Parkinson. Les autres troubles neurologiques les plus courants comprennent l’épilepsie, la sclérose latérale amyotrophique (également appelée maladie de Charcot), la schizophrénie et la sclérose en plaques. Un Français sur deux est touché directement ou indirectement par une pathologie cérébrale. De nombreuses maladies neurodégénératives sont toujours incurables et très fréquentes chez les personnes de plus de 65 ans comme la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson. L’objectif de ce projet est d’élever des rongeurs modèles pertinents pour l’étude de ces pathologies et des complications qui leurs sont associées. Ces modèles peuvent développer spontanément ou via des altérations génétiques une ou plusieurs caractéristiques des troubles neurologiques. Les animaux issus de ces développements seront utilisés afin d’étudier l’apparition, le développement et les complications associées aux pathologies neurologiques mais également de tester de nouveaux traitements. Ce projet et la procédure qu'il comporte seront mis en œuvre sur notre Etablissement utilisateur 1 et sur notre Etablissement utilisateur 2.
Bénéfices attendus
L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Ces modèles murins, au plus proche de la maladie humaine, sont donc très pertinents pour l’étude de l’apparition, du développement et des complications associées aux pathologies neurologiques mais également le développement de traitements pharmacologiques.
Procédures
Une puce électronique sera posée sur animal vigile afin de l’identifier. Une biopsie sera réalisée sur animal vigile afin de génotyper l’ensemble des animaux obtenus. Chacune de ces interventions ne durera pas plus de 30 secondes. En règle générale, une seule puce et une seule biopsie suffisent pour identifier un animal et établir son génotype. Ces interventions pourront avoir lieu dans les deux établissements utilisateurs.
Impact sur les animaux
Une douleur légère ainsi qu’un léger stress peuvent être induits lors du prélèvement de biopsies et de la pose associée d’une puce électronique en vue de l’identification et du génotypage de l’animal. En fonction des besoins et afin d’améliorer l’indice de productivité de la lignée, il pourrait être nécessaire d’héberger individuellement des mâles pour une période ne dépassant pas 7 jours avant qu’ils soient présentés aux femelles afin de mettre en place des accouplements. Cela pourrait générer un stress léger. A ces effets indésirables s’ajoutent les phénotypes pouvant être attendus lors de troubles neurologiques (liste non-exhaustive) : des déficits de la mémoire spatiale et de la mémoire de travail, des altérations de la mémoire cognitive, une atrophie cérébrale, une perte neuronale, l’apparition de déficits cognitifs, une dysfonction motrice, des crises épileptiques, une intolérance au glucose, des cataractes, des dysfonctionnements des reins, une diminution de la densité minérale osseuse, un tressautement des vibrisses, macro-orchidie chez les mâles et insuffisance ovarienne chez les femelles.
Devenir
Les animaux sont soit expédiés dans un autre établissement utilisateur soit utilisés dans notre établissement (utilisation continue), soit mis à mort pour la gestion de l'élevage (atteinte des points limites du phénotype dommageable, prélèvement de gamètes). Les animaux ne présentant pas de génotype d’intérêt pour la poursuite du projet seront mis à mort (pas d’autre utilisation possible).
Remplacement
Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal ; en effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de troubles neurologiques, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
Les animaux aptes au transport seront livrés d’un établissement à l’autre via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux. Le transport entre les 2 EU prend moins d’une heure. Au cours de ce voyage, les animaux seront placés dans des colis munis de filtres (afin de maintenir leur statut sanitaire), de litière, d’aliment, d’enrichissement et d’hydrogel. Les animaux seront transportés via des camions ventilés et thermorégulés.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Les génomes des souris et des rats sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi chez nos partenaires ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d’ovules, des adultes matures sexuellement seront utilisés.
Evaluation de la sécurité préclinique de candidats médicaments en ophtalmologie chez les rongeurs et les non-rongeurs
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 240
Chiens : 80
Cochons : 80
Macaques à longue queue : 180
Avant tout essai chez l'humain, des candidats médicaments pour l'œil sont testés en série, à raison d'une dizaine d'études par an, sur 240 souris, 240 rats, 80 chiens, 80 cochons et 180 macaques à longue queue. Ces 820 individus reçoivent des gouttes oculaires parfois plusieurs fois par jour ou des injections dans l'œil, jusqu'à deux mois de traitement, avec prises de sang, prélèvements d'humeur aqueuse et biopsies, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur décrit dans les cas les plus marqués des paupières fermées, des rougeurs, des œdèmes de la conjonctive, une photophobie et des frottements répétés des yeux, et affirme que ces études ne sont menées que lorsqu'elles sont "indispensables". La plupart sont tués pour un examen anatomopathologique terminal, mais le champ structuré déclare 51 chiens, cochons et macaques gardés en vie, dont 33 réutilisés, 6 chiens proposés à l'adoption et 12 cochons et macaques rendus à l'élevage, ce dernier point n'apparaissant nulle part dans la narration.
Objectifs
-Contexte De nombreuses maladies des yeux ne disposent pas encore de traitements suffisamment efficaces. C'est le cas par exemple de certaines maladies de la rétine pouvant entraîner une perte de la vision, du glaucome ou encore de certaines atteintes de la surface de l'œil. Afin de répondre à ces besoins médicaux, de nouveaux médicaments sont en cours de développement. -Objectif principal Avant d'être testés chez l'Homme, les futurs médicaments doivent faire l'objet d'études de sécurité. Ces études, réalisées chez l'animal, permettent de vérifier qu'ils ne présentent pas de risques majeurs et de préparer leur évaluation lors des essais cliniques. -Finalités Ces études visent à : - identifier les éventuels effets indésirables du médicament ; - sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs ; - comprendre comment le médicament est distribué et éliminé par l'organisme ; - recueillir les informations nécessaires pour orienter la suite de son développement et préparer les études réglementaires. -Méthodologie Le candidat médicament est administré dans l'œil, en une ou plusieurs fois selon les objectifs de l'étude. Tout au long de l'étude, les animaux font l'objet d'un suivi attentif comprenant notamment : - l'observation de leur état de santé général ; - la mesure de différents paramètres biologiques ; - la réalisation d'examens ophtalmologiques ; - des prélèvements biologiques permettant d'analyser les effets du médicament. L'ensemble des résultats recueillis est ensuite analysé afin d'évaluer le profil de sécurité du candidat médicament et d'optimiser son développement. Cette approche contribue également à limiter le nombre d'études nécessaires en exploitant au mieux les données obtenues. Toutes espèces confondues, environ 10 études peuvent être réalisées chaque année.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice de ce projet est de contribuer au développement de traitements plus sûrs pour les maladies de l'œil. Avant qu'un nouveau médicament puisse être testé chez l'Homme, il est important de vérifier qu'il ne présente pas de risque majeur pour la santé. Les études réalisées dans le cadre de ce projet permettent d'identifier le plus tôt possible d'éventuels effets indésirables et de mieux comprendre le profil de sécurité des futurs traitements. Cette étape contribue à protéger les participants aux essais cliniques et, à terme, les futurs patients. Le projet permet également de recueillir des informations essentielles pour orienter le développement des nouveaux médicaments. Les résultats obtenus aident notamment à déterminer les doses les plus adaptées, à définir les examens de suivi nécessaires et à mieux évaluer l'équilibre entre l'efficacité attendue du traitement et ses éventuels effets indésirables. Ces études permettent aussi d'identifier les organes ou tissus qui pourraient être particulièrement sensibles au médicament. Cette connaissance facilite la détection précoce d'éventuels effets indésirables, qu'ils concernent les yeux ou d'autres parties de l'organisme. Par ailleurs, le projet contribue à identifier des indicateurs biologiques pouvant être utilisés dans les études ultérieures pour suivre l'action du traitement et détecter rapidement d'éventuels effets indésirables. Plus largement, les connaissances acquises permettent de mieux comprendre les mécanismes à l'origine de certains effets indésirables et d'améliorer les décisions prises tout au long du développement des futurs médicaments.
Procédures
Les animaux reçoivent le candidat médicament directement au niveau de l'œil (quelques secondes), soit en une seule administration, soit en plusieurs administrations selon le type de traitement étudié. La fréquence d'administration varie en fonction du médicament. Par exemple, des gouttes ophtalmiques peuvent être administrées plusieurs fois par jour, tandis que certaines injections dans l'œil peuvent être réalisées seulement une fois par mois. La durée totale du traitement peut aller jusqu'à deux mois. Lorsque des injections oculaires sont nécessaires (quelques minutes), elles sont réalisées dans des conditions de stérilité strictes, sous anesthésie locale et, si besoin, sous une anesthésie générale de courte durée afin d'assurer le confort de l'animal. Des prélèvements de sang ou d'autres échantillons biologiques (quelques minutes) peuvent également être réalisés au cours de l'étude pour analyses. Ces analyses permettent de mieux comprendre la façon dont le médicament agit dans l'organisme et d'évaluer son niveau d'exposition. Dans certains cas, de petits prélèvements de tissus ou de cellules peuvent être nécessaires (quelques minutes). Toutes ces procédures sont réalisées dans le respect des recommandations éthiques en vigueur, avec un nombre et un volume de prélèvements limités au strict nécessaire. Lorsque ces prélèvements nécessitent une intervention, celle-ci est effectuée sous anesthésie de courte durée et dans des conditions garantissant le bien-être des animaux. Des examens ophtalmologiques (quelques minutes) sont généralement réalisés avant le début du traitement, puis à intervalles réguliers pendant l'étude, et enfin à son terme. Selon la nature de l'examen, un collyre anesthésiant peut être administré afin de rendre l'œil temporairement insensible pour permettre la réalisation des mesures dans les meilleures conditions. L'ensemble de ces observations, examens et analyses permet de suivre l'état de santé des animaux, d'évaluer les effets du médicament sur l'œil et l'organisme, et de recueillir les informations nécessaires à son développement en toute sécurité.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables seront limités à une contrainte modérée. L’administration d’un candidat médicament par voie ophtalmique peut entraîner des effets indésirables oculaires, parfois accompagnés, dans les cas les plus marqués, d’effets systémiques. Ces effets peuvent être liés à l’actif étudié et/ou à la procédure d’administration, notamment lors d’injections intra- ou péri-oculaires. Chez les rongeurs comme chez les non-rongeurs, les effets indésirables oculaires se manifestent par des signes cliniques observés au niveau de l’œil et de la région périoculaire, tels qu’une fermeture des paupières, une rougeur et/ou un œdème conjonctival, un écoulement oculaire. Lors d’atteintes oculaires les plus marquées, ces effets locaux peuvent s'accompagner d'un retentissement sur le comportement de l'animal, se traduisant notamment par des frottements répétés des yeux, une photophobie, une diminution de l'activité ou une baisse de la consommation alimentaire. Outre les effets liés à l’administration de la substance étudiée, la procédure elle-même (contention, examens, prélèvements de fluides biologiques ou de tissus, etc.) peut engendrer des nuisances se traduisant par un inconfort, un stress ou une douleur de courte durée. Les administrations intra- ou périoculaires, ainsi que les prélèvements d’humeur aqueuse et biopsies sont susceptibles d’entraîner, au cours des 48 heures suivant l’intervention, une douleur légère, une diminution de l’appétit et une légère baisse de l’activité.
Devenir
Les études précliniques exploratoires de sécurité visant à évaluer les effets indésirables potentiels de candidats médicaments en ophtalmologie nécessitent, le plus souvent, la réalisation d’analyses biologiques ainsi qu’un examen anatomopathologique terminal. Cet examen permet d’évaluer les éventuels effets du candidat médicament administré par voie oculaire, tant au niveau de l’œil que des autres tissus et organes. Il permet également de déterminer l’exposition des différents tissus oculaires et de l’organisme au candidat médicament et/ou d’analyser son effet sur sa cible thérapeutique, ainsi que de réaliser toute investigation complémentaire nécessaire à son évaluation. Lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas d’analyses terminales, certains animaux non rongeurs pourront être réutilisés après validation du Vétérinaire clinicien. Une partie d’entre eux pourra être proposée à l’adoption par l’intermédiaire d’associations ou de structures d’accueil spécialisées, en accord avec les autorités compétentes.
Remplacement
Avant qu'un nouveau médicament destiné à traiter les maladies de l'œil puisse être administré à l'Homme, il doit être soigneusement évalué afin de vérifier son efficacité et sa sécurité. Plusieurs méthodes alternatives sont systématiquement intégrées dans notre stratégie d'évaluation, comme la modélisation informatique, l’utilisation de cultures cellulaires ou l’étude de tissus en laboratoire. Ces approches permettent de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs et d'écarter rapidement ceux qui présentent des risques potentiels. Toutefois, ces méthodes ne permettent pas de reproduire toute la complexité d'un organisme vivant. En particulier, elles ne permettent pas d'étudier la façon dont un médicament se répartit dans l'œil et dans le reste de l'organisme, ni d'évaluer l'ensemble des réactions biologiques susceptibles de se produire après son administration. Lorsque les informations nécessaires ne peuvent pas être obtenues par ces méthodes alternatives, des études chez l'animal sont alors réalisées. Elles permettent notamment de : - évaluer les effets du médicament sur l'œil et sur l'organisme dans son ensemble, - comprendre comment le médicament est absorbé, distribué et éliminé, - vérifier que son niveau de sécurité est compatible avec une future utilisation chez l'Homme. Les études animales sont donc mises en œuvre uniquement lorsqu'elles sont indispensables et qu'aucune autre méthode validée ne permet d'obtenir les informations recherchées. Elles constituent aujourd'hui une étape importante du développement des médicaments, contribuant à garantir la sécurité des futurs participants aux essais cliniques et des patients.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est limité au strict nécessaire, conformément aux principes éthiques applicables à la recherche animale. Pour chaque étude, le nombre d'animaux est soigneusement déterminé afin d'obtenir des résultats fiables et scientifiquement solides tout en évitant l'utilisation d'animaux en excès. Cette estimation s'appuie sur les connaissances scientifiques disponibles, l'expérience acquise lors d'études précédentes et les recommandations en vigueur. Lorsque cela est possible et sans impact sur leur bien-être ou sur la qualité scientifique des résultats, certains animaux peuvent participer à plusieurs études compatibles. Cette démarche permet de réduire davantage le nombre total d'animaux nécessaires au projet. L'objectif est ainsi de recueillir les informations indispensables au développement de nouveaux traitements tout en limitant au maximum le recours aux animaux.
Raffinement
Les procédures expérimentales sont conçues de manière à minimiser la douleur, la souffrance, le stress et les contraintes subis par les animaux. Une phase de désensibilisation et d’habituation est systématiquement mise en œuvre avant le début de l’étude afin de limiter le stress des animaux au cours des procédures expérimentales. Chaque manipulation est associée à un renforcement positif (récompenses physiques ou alimentaires). Les animaux bénéficient d'enrichissements alimentaires spécifiques distribués individuellement à la main dès leur arrivée pour favoriser une relation de confiance avec l'expérimentateur. Lorsque certains examens ou interventions sont susceptibles d'entraîner un inconfort, ils sont réalisés sous anesthésie afin de prévenir la douleur et de limiter le stress (examens approfondis des yeux, certains actes chirurgicaux). Ces interventions sont effectuées dans des conditions d'asepsie strictes afin de prévenir tout risque d'infection, des traitements antidouleur sont administrés lorsque cela est nécessaire. L'ensemble de ces mesures vise à garantir à la fois la qualité de la procédure et le confort de l'animal pendant et après celle-ci. L'état de santé et le comportement des animaux sont surveillés quotidiennement par du personnel qualifié. Des critères précis ont été définis pour détecter rapidement tout signe de douleur, d'inconfort ou de détresse. Si nécessaire, des mesures adaptées sont prises immédiatement, pouvant aller jusqu'à l'arrêt anticipé de la participation de l'animal à l'étude. Pour renforcer le suivi clinique, des systèmes de vidéosurveillance dédiés sont utilisés pour les chiens et les miniporcs. Pour certaines études, les souris sont hébergées dans des cages connectées pouvant être équipées de caméras pour détecter les anomalies 24h/7j. Les rats bénéficient également de caméras pour enregistrer leur activité jour et nuit. L'utilisation d'implants de monitoring des fonctions vitales (température) limite la contrainte sur les animaux tout en recueillant des informations importantes pour le suivi clinique. L'environnement des animaux est enrichi et adapté à leurs besoins spécifiques (jeux, objets à explorer, activités de recherche alimentaire, ambiance sonore adaptée). Les animaux sont également habitués à être manipulés de manière douce et respectueuse afin de réduire leur stress et d'améliorer leur bien-être tout au long de l'étude.
Choix des espèces
Le choix des espèces animales utilisées dans les études est guidé par des critères scientifiques et par les réglementations internationales encadrant le développement des médicaments. Selon les recommandations en vigueur, les études de sécurité sont généralement réalisées chez différentes espèces animales. Cette approche permet de mieux comprendre les effets potentiels du futur médicament et d'obtenir des données aussi fiables que possible avant son évaluation chez l'Homme. L'espèce retenue est choisie en fonction de plusieurs facteurs, notamment la manière dont l'œil est constitué et fonctionne, le mode d'administration du médicament et la façon dont celui-ci agit dans l'organisme. L'objectif est d'utiliser les espèces les plus adaptées pour répondre aux questions scientifiques posées par l'étude. Lorsque les caractéristiques du médicament le permettent et que cela est scientifiquement justifié, les études peuvent être réalisées dans une seule espèce pertinente. Cette approche contribue à limiter le nombre d'animaux utilisés tout en garantissant la qualité des données recueillies. Selon les besoins du programme de recherche et les exigences réglementaires, les études peuvent être menées chez des animaux jeunes ou adultes. Le choix est effectué au cas par cas afin de s'assurer que les résultats obtenus sont les plus pertinents possibles pour le développement du futur traitement.
MODIFICATION Troubles endocriniens et métaboliques : diabète et obésité
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Rats : 1100
Jusqu'à huit prises de sang en quatre à huit heures, une privation de nourriture pouvant atteindre 16 heures, cinq jours seuls en cage pour un test de choix entre deux biberons : 2 200 rongeurs, 1 100 souris et 1 100 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un réactif administré une fois, un régime riche en graisse ou les deux leur provoquent diabète ou obésité, avant qu'ils reçoivent des substances en développement, testées pour leur effet sur ces troubles ou pour leurs effets indésirables sur le système endocrinien. S'y ajoutent une tâche de nage et des tests cognitifs non nommés, en sessions quotidiennes pendant deux à cinq semaines. 440 rongeurs sont déclarés réutilisés, les autres tués, selon le porteur pour les procédures qui exigent des prélèvements d'organes, et il décrit le rongeur comme "un modèle fiable pour découvrir et valider de nouveaux traitements du diabète".
Objectifs
La prévalence mondiale du diabète et de l’obésité n’a cessé d’augmenter au cours de ces dernières décennies et a atteint des proportions pandémiques, (463 millions de personnes atteintes en 2019) (Pouya et al. (2019) Global and regional diabetes prevalence estimates for 2019 and projections for 2030 and 2045: Results from the International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9th edition.Diabetes Res Clin Pract. 2019 Nov;157:107843). Ces troubles métaboliques exposent les personnes atteintes à un risque de pathologie bien plus grave, en effet une glycémie constamment élevée provoque des lésions vasculaires généralisées affectant le cœur, les yeux, les reins et les nerfs. Elle expose les personnes atteintes à une incidence accrue de maladies athérosclérotiques cardiovasculaires (American Diabetes Association.(2011). Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care). A l’heure actuelle, toutes les thérapies disponibles traitent les conséquences du diabète en se focalisant principalement sur la régulation glycémique, mais ne ciblent pas le mécanisme biologique sous-jacent qui cause la maladie. Par ailleurs, certaines molécules médicamenteuses en cours de développement peuvent avoir des effets secondaires sur le système endocrinien et favoriser l’apparition d’hyperglycémie et de diabète. Et au-delà de ses conséquences métaboliques, l'obésité est étroitement associée à des altérations de la santé cérébrale, incluant une prévalence accrue de l'anxiété, de la dépression et des déficits cognitifs. Ainsi le présent projet aura pour objectif d’une part d'évaluer l’efficacité préclinique de nouvelles substances susceptibles de lutter contre les troubles métaboliques et endocriniens (diabète, obésité, syndrome métabolique) et de leurs conséquences, d’autre part, de déterminer si de nouvelles substances en développement peuvent avoir une répercussion sur le système endocrinien. Quel que soit le contexte de l’étude, l’effet des substances pharmacologiques est évalué sur des modèles biologiques suffisamment sensibles et prédictifs, capables de mimer la physiologie endocrinienne humaine et sa complexité, afin de garantir la pertinence et la validité des résultats expérimentaux obtenus.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'évaluer l’activité pharmacologique de substances en développement sur le métabolisme glucidique et lipidique chez le rongeur. Ce projet permettra également d’étudier les effets secondaires possibles d’autres substances bioactives sur le système endocrinien.
Procédures
Les troubles métaboliques sont induits par une administration unique d'un réactif (durée d'environ 1 minute), ou par un régime riche en graisse, ou la combinaison des deux. Les substances-test peuvent être administrées par bolus (voie orale, intraveineuse, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire), durée de quelques secondes ou par perfusion lente (intraveineuse) de quelques minutes à quelques heures. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours (le plus souvent) ou plusieurs semaines, et cela en fonction de l’objectif de l’étude. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline nécessitent une administration unique (durée d’environ 1 minute) suivie de prélèvements d'une goutte de sang (durée de quelques secondes, 8 maximum, sur 4 ou 8h de test). Les éventuels tests comportementaux durent environ 5 à 10 minutes, ou 5 jours (test mesurant une consommation de liquide dans deux biberons en libre choix, avec hébergement individuel sur cette période), ou par sessions journalières de plusieurs minutes pendant plusieurs semaines (max : 30 à 120 minutes pendant 2 à 5 semaines) pour les tests cognitifs nécessitant de l'apprentissage. Par ailleurs, des prélèvements de sang (8 maximum, sur 4 ou 8h) peuvent être réalisés, chaque prélèvement durant quelques secondes à 3 minutes. Enfin, un hébergement individuel (durée max 24 h) peut être réalisé au cours de l'étude pour prélèvement d'urines ou de fèces.
Impact sur les animaux
Bien qu’un certain nombre de procédures appliquées dans ce projet n’induisent pas de nuisance ou d’effets indésirables sur les animaux, quelques procédures peuvent induire un stress lié à un hébergement individuel, une privation de nourriture (
Devenir
Pour les procédures légères et modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Pour procédures nécessitant des prélèvement d’organes les animaux sont euthanasiés.
Remplacement
Dans le cadre du développement des médicaments testés de nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) ont déjà eux lieu avant l'utilisation de l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substance à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne reflètent pas la complexité de l’environnement biologique et du système endocrinien chez l’Homme. De même, il n'est pas possible de prédire les effets secondaires des substances utilisées. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Quand le protocole d'étude le permet, un groupe traité est utilisé comme son propre contrôle négatif permettant ainsi d’utiliser un nombre d’animaux réduit. Par ailleurs et dans la mesure du possible (en fonction de la durée d'action de la substance-test), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal et à des jours différents, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Nos données historiques ainsi que celles de la littérature indiquent qu’un effectif 8-10 animaux ( rats et souris) en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. L' analyse statistique prévue repose sur des tests paramétriques. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude. Dans le but de réduire le nombre d’animaux, certains animaux issus des procédures réalisées sur l’animal éveillé sont également réutilisés aux strictes conditions qu’ils n’aient pas subi de procédure sévère et après accord du vétérinaire.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites permettant l'euthanasie précoce de tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le métabolisme de rongeurs (rats, souris), est prédictif de leur efficacité et/ou sécurité en clinique. En effet, le rongeur s'est avéré être un modèle fiable pour découvrir et valider de nouveaux traitements du diabète, il presente une physiologie proche de celle de l'Homme. Les études sont principalement menées sur des jeunes rongeurs adultes sains dont l'âge est compris entre minimum 4 semaines (correspond à la fin du sevrage des animaux) et maximum 20 semaines (correspond à l'apparition du processus de sénescence).