Hamsters dorés

7 830 animaux non-humains, 7 410 lapins et 420 hamsters dorés, vont être utilisés en cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, au rythme d'environ 438 études commandées par an. Chaque étude consiste à injecter ou appliquer un dispositif médical sur la peau, l'œil, la bouche, le vagin ou le rectum, une ou plusieurs fois sur 21 jours au plus, puis à noter érythème et œdème, avec rasage, pansements ou collerette selon les tests. Le nombre de lapins et de hamsters dépend "du nombre d'études signées avec les différents donneurs d'ordre", et le porteur justifie le recours à ces tests par des pays dont les autorités ne reconnaissent pas encore les méthodes in vitro. Sont tués tous ceux dont les sites d'application doivent être prélevés pour l'histologie, et une partie des autres selon les résultats, tandis que 360 lapins sans réaction ni anomalie clinique sont prévus pour d'autres tests.

Objectifs

Tout fabricant doit s’assurer que l’utilisation de son produit ne compromette ni l’état clinique et la sécurité des patients, ni la sécurité et la santé des utilisateurs. L’évaluation des risques menée prend en compte le fait que les risques éventuels liés à l’utilisation du produit constituent des risques acceptables au regard du bienfait apporté au patient et sont compatibles avec un niveau élevé de protection de la santé et de la sécurité des patients comme des utilisateurs. Dans ce projet, le paramètre évalué est le potentiel irritant des dispositifs médicaux. Certains matériaux n'ayant pas été testés peuvent induire des effets indésirables lorsqu'ils entrent en contact avec des tissus humains. Le fabricant est dans ce cas tenu d'évaluer chaque dispositif en fonction de ses effets indésirables potentiels avant sa mise sur le marché.

Bénéfices attendus

Ce projet participe à l’autorisation de mise sur le marché de dispositifs médicaux en vérifiant que l’utilisation du produit de santé ne compromet ni l’état clinique et la sécurité des patients, ni la sécurité et la santé des utilisateurs. Ce projet permet spécifiquement d’évaluer les risques éventuels de manifestations cutanées liés à l’utilisation de dispositifs médicaux et de s’assurer le cas échéant qu’ils constituent des risques acceptables au regard des bienfaits/bénéfices apportés aux patients et sont compatibles avec un niveau élevé de protection de la santé et de la sécurité des patients comme des utilisateurs. Les résultats seront disponibles à l’issue des études et leur incorporation dans les dossiers de soumission aux autorités de santé compétentes avant leur mise (ou leur maintien) sur le marché pourront en découler à court terme. Le nombre total d’animaux utilisés dépend directement du nombre d’études signées avec les différents donneurs d’ordre durant les 5 années du projet. Nous attendons : -Pour les études d'irritation intradermiques 380 études par an -Pour les études d’irritation primaire cutanée 20 études par an -Pour les études d’irritation oculaires 25 études par an -Pour les étudesd’irritation vaginale ou d’irritation rectale 6 études par an -Pour les études d’irritation buccale 7 études par an

Procédures

Dans ce projet, le paramètre évalué est le risque que l’élément testé provoque une réaction d’irritation des tissus chez les lapins ou hamsters. Les animaux reçoivent des injections ou des applications de l’élément d’essai au niveau de la zone d’intérêt recherchée (peau ou muqueuses qui seront en contact avec le produit lors de son utilisation clinique). Chaque application dure entre 1 et 5 minutes, ou jusqu’à 10 minutes en incluant l’anesthésie lorsque celle-ci est nécessaire. La fréquence d’application du produit peut varier en fonction de l’utilisation clinique du produit chez l’Homme. Des applications répétées mimant les conditions d’utilisation clinique peuvent donc être réalisées. Les injections ou applications peuvent donc être uniques ou multiples (période d’application limitée à 21 jours). Lors de ces applications, les animaux peuvent être contenus ou anesthésiés pendant quelques minutes en fonction des procédures. Les sites d’intérêt sont observés macroscopiquement immédiatement après chaque application mais également immédiatement avant l’application suivante si applicable. Des scores d’érythème et d’œdème sont attribués à chaque intervalle de temps. Enfin, après la dernière application les sites seront observés et scorés entre 24h et 21 jours en fonction des procédures. Pour certaines procédures, les animaux sont ensuite euthanasiés pour prélever puis analyser les sites en histologie. Pour les autres procédures, en fonction des résultats obtenus, les animaux peuvent être réutilisés dans d’autres tests ou euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues communes à toutes les procédures sont les suivantes : - Stress limité et de courte durée (moins de 5 minutes par acte), lié aux contentions lors des différentes applications et observations vigiles, ou lors des anesthésies. - Douleur limitée à moyenne, causée par les injections ou certaines applications. - Gêne ou douleur locale limitée à moyenne en cas de réaction irritante (test positif). Les nuisances attendues et spécifiques à certaines procédures sont les suivantes : - Irritation intradermique : o Stress limité lié au rasage avant injection (inconfort transitoire, acte inférieur à 5 minutes) - Irritation primaire cutanée : o Stress limité lié au rasage avant application (inconfort transitoire, acte inférieur à 5 minutes) o Inconfort léger à modéré lié à la présence de pansement o Douleur modérée ponctuelle liée au retrait des pansements (présence d’une compresse protégeant et limitant le contact de l’adhésif avec la peau, acte transitoire inférieur à 1 minute) - Irritation buccale : o Stress léger suite à la présence d’une collerette lors des applications (vérification de l’absence de gêne pour s’alimenter et s’abreuver).

Devenir

Réutilisation des animaux ayant répondu négativement et ne présentant aucune anomalie clinique pour d’autres procédures jugées scientifiquement compatibles. Pour les tests nécessitant des analyses histopathologiques comme requis dans le(s) texte(s) de référence, tous les animaux seront mis à mort étant donné que les sites d’applications doivent être prélevés.

Remplacement

Des tests in vitro ont été développés pour détecter certains risques de réaction d’irritation causée par des dispositifs médicaux. Ces tests in vitro sont mis en œuvre dès qu’ils sont acceptables pour les dossiers de demande d’autorisation de mise sur le marché. Néanmoins, les tests in vivo restent nécessaires pour les mises sur le marché des produits dans certains pays dont les autorités compétentes ne reconnaissent pas encore les tests in vitro. De ce fait, les tests in vivo peuvent être limités dans certains cas mais l’utilisation d’animaux est donc toujours requise par certaines réglementations et autorités.

Réduction

Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Le nombre d’animaux minimal requis pour chaque test est défini dans les textes normatifs afin de permettre la détection fiable d’une réaction d’irritation. Si le pH de l’élément à tester est trop extrême (acide ou basique), il ne sera pas testé in vivo. Enfin, dans certains cas (composition du produit faisant craindre un caractère irritant par exemple), le test pourra être mené sur un seul animal dans un premier temps. Si l’effet irritant est constaté, le test est considéré comme positif et l’essai ne va pas plus loin. Si l’animal ne présente pas de réaction, les autres animaux prévus sont également soumis au test pour atteindre l’effectif attendu par les textes normatifs. La réalisation des témoins positifs pour s’assurer de la validité des tests est effectuée tous les 6 mois et non pour chaque étude, permettant de réduire également le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Si, au cours du suivi (à minima quotidien) des animaux, un signe de souffrance ou d’angoisse est détecté, un suivi spécifique est mis en place par l’équipe vétérinaire, ainsi qu’un traitement adapté si jugé nécessaire (ex : traitement analgésique). Une évaluation renforcée supplémentaire (a minima journalière également incluant également les week-ends) aura lieu dans les phases critiques des études, pour s’assurer que la prise en charge est adaptée aux observations cliniques réalisées.

Choix des espèces

Espèce animale définie dans le (ou les) texte(s) de référence(s) Les tests doivent être réalisés sur des animaux jeunes et en bonne santé. A noter : pour les lapins, le poids correspondant est précisé dans le(s) texte(s) de référence (poids minimum à 2 kg en début d’étude). Pour les hamsters, le poids des animaux doit être de 75g minimum avant la première application.

4 300 rongeurs, 2 150 souris et 2 150 hamsters dorés, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infectés par le SARS-CoV-2 par le nez sous anesthésie, ils reçoivent ensuite des composés candidats, jusqu'à 84 fois par voie orale en six semaines ou par injection, et peuvent perdre du poids ou présenter des difficultés respiratoires. Une partie des souris est génétiquement modifiée pour porter la protéine humaine ACE2, et tous finissent par une ponction intracardiaque sous anesthésie profonde. Pour écarter les méthodes sans animaux non-humains, le porteur invoque "les exigences réglementaires de tous les pays de destination des produits".

Objectifs

Dans ce projet, nous voulons évaluer l’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques contre le virus SARS-CoV-2, responsable de la COVID-19. Ces composés pourraient empêcher le virus d’entrer dans les cellules ou limiter sa multiplication dans l’organisme. Nous souhaitons également étudier la réponse immunitaire de l’organisme face à l’infection et déterminer si ces composés peuvent la moduler afin d’aider à éliminer plus rapidement le virus. La présence du virus sera mesurée grâce à des méthodes permettant de détecter son matériel génétique et sa capacité à infecter des cellules en laboratoire. Les différentes variantes circulantes du virus pourront également être étudiées. Les modèles d’infection utilisés chez le hamster reproduisent plusieurs caractéristiques observées chez l’Homme lors d’une infection par le SARS-CoV-2 et permettent ainsi d’évaluer l’efficacité potentielle des traitements. Les études pourront également être réalisées chez des souris génétiquement modifiées afin de rendre leur sensibilité au virus plus proche de celle de l’Homme. Dans ce projet, le virus SARS-CoV-2 est administré par voie intra-nasale sur animal anesthésié. Après l’infection, le virus se développe principalement dans les voies respiratoires et les poumons, ce qui permet d’étudier l’évolution de la maladie et l’effet des traitements testés. Dans ce projet, il est anticipé un total de de 40 études et 4300 animaux pour les 5 prochains années.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’efficacité de composés candidats dans des modèles animaux d’infection par le SARS-CoV-2. Les études réalisées permettront d’obtenir des données précliniques essentielles sur l’activité antivirale et l’impact des traitements sur la progression de l’infection. Plus largement, ces études permettront de produire des données précliniques d’efficacité dans des modèles pertinents de la maladie, nécessaires à l’évaluation et au développement de candidats thérapeutiques. À terme, ces données pourront contribuer au développement de traitements visant à réduire la sévérité de l’infection et ses complications chez l’humain.

Procédures

Aucune procédure chirurgicale ne sera mis en œuvre sur les animaux. Selon les procédures appliquées : • Infection des souris ou hamsters : Injection intra-nasale : anesthésie générale, 1 fois par animal, 2 minutes • Administration de composés thérapeutiques sur une durée de 24h à 2 semaines. Par voie orale (20mL/kg/dose), vigile, 1 à 2 fois par jour par animal maximum 84 administration pour une étude de 6 semaines avec deux administration par jour, 1 minute OU Par voie sous-cutanée (10mL/kg/dose) : anesthésie générale, 1 fois par jour maximum sur 5 jours maximum, durée 1 minute OU par voie intramusculaire (0.05ML/site): anesthésie générale, administration unique quel que soit la durée de l’étude donc 2 maximum, une pour chaque patte arrière, durée 1 minute OU par voie intrapéritonéale (20mL/kg/dose) : vigile, 1 fois maximum, durée 1minute OU par voie intrathécale (20µl max) : anesthésie générale, 1 fois maximum, durée 1minute OU par voie intraveineuse (5ml/kg) : vigile, 1 fois par jour maximum sur 5 jours maximum),, durée 1minute • Suivi clinique et pondéral : Pesée et bilan clinique tous les jours par animal sur la durée de l’étude, sur animal vigile. La périodicité sera adaptée en fonction des signes cliniques et des recommandations du vétérinaire. • Prélèvement sanguin : À la veine submandibulaire (1×/2 semaines, 1 prélèvement maximum par animal sur 2 semaines) ou à la queue chez la souris (avec une période de récupération adaptée), sur animal vigile, pendant 2 semaines maximum au cours de l’étude. Prélèvement terminal sous anesthésie profonde, par ponction intracardiaque, durée 2 minutes, sur tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, les souris et les hamsters sont infectés par le virus responsable de la COVID-19 afin d'évaluer de nouveaux traitements. Au cours de l'infection, certains animaux peuvent présenter des signes de maladie, tels qu'une perte de poids temporaire, une baisse d'activité, un aspect plus fatigué ou des difficultés respiratoires généralement modérées. Les traitements testés dans cette étude ont pour objectif de limiter la multiplication du virus et de diminuer l'inflammation provoquée par l'infection. Ils sont donc susceptibles de réduire l'intensité et la durée des signes de la maladie chez les animaux. Les composés évalués ayant pour objectif de limiter la réplication virale et la réponse inflammatoire, leur administration devrait contribuer à réduire la sévérité et la durée des signes cliniques observés, mais dans la phase de développement de candidat-médicament, des effets secondaires imprévus ne sont jamais totalement exclus. Cependant, par expérience du Projet autorisé précédent, cela est pas/peu attendu avec les molécules testées. Cependant, par expérience du projet autorisé précédent, la survenue d’effets indésirables est peu attendue avec les molécules testées, notamment au regard des données de tolérance et des études PK/PD préalablement réalisées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin d’étude pour les nécessités scientifiques des études (prélèvements tissulaires terminaux). Dans le contexte infectieux, les règles de biosécurité ne nous permettent pas de garder ou d’envisager un autre devenir pour les animaux.

Remplacement

Aucune méthode évitant totalement le recours à l’animal selon les exigences réglementaires de tous les pays de destination des produits n’est développée à ce jour pour les procédures expérimentales décrites. A l’heure actuelle, les tests in vitro, effectués préalablement pour valider l’intérêt des cibles identifiées et l’efficacité de nouvelles molécules, ne permettent pas d’appréhender l’intégralité des mécanismes de l’infection et de l’interaction hôtes/pathogènes. C’est pourquoi, le recours à des modèles expérimentaux in vivo s’avère nécessaire pour la compréhension et l’évaluation des mécanismes d’actions des composés candidats. Ces modèles in vivo permettent également d’anticiper l’éventuelle toxicité des molécules thérapeutiques dans ces conditions complexes de relation hôte/pathogène (implication du système immunitaire).

Réduction

Le schéma expérimental des procédures de ce projet s’appuie sur les données bibliographiques actualisées ainsi que sur les résultats préliminaires obtenus au sein du laboratoire. Le nombre d’animaux nécessaires est déterminé au plus juste à l’aide de calculs de puissance statistique réalisés en collaboration avec un biostatisticien, afin de garantir la robustesse scientifique des résultats tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Une stratégie de sélection en amont est systématiquement mise en œuvre. Les candidats sont d’abord évalués au moyen de tests in vitro et d’approches in silico permettant de prioriser les molécules les plus pertinentes. Seuls les composés présentant un profil compatible avec une évaluation in vivo sont retenus, ce qui permet de réduire significativement le nombre d’animaux exposés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe social de 3 à 5 animaux pour les souris et de 2 pour les hamsters compatibles dans des cages conformes aux normes réglementaires en vigueur et bénéficiant d’un enrichissement adapté (matériel de nidification, abris). Les locaux d’hébergement et d’expérimentation sont suivis par un personnel spécifiquement formé et habilité. Les procédures mises en œuvre sont classées de gravité modérée et s’étendent de quelques heures à deux à quatre semaines selon le modèle étudié. Un suivi clinique quotidien est assuré et renforcé durant la phase aiguë post-infection si nécessaire. Lorsque cela est possible, une anesthésie générale ou locale est pratiquée pour les gestes techniques susceptibles d’induire une douleur. Des mesures analgésiques adaptées sont mises en place si la procédure le justifie. Les manipulateurs sont spécifiquement formés et régulièrement évalués dans leurs pratiques, ce qui permet de limiter le stress, la durée des manipulations et les risques de douleur ou de détresse pour les animaux.

Choix des espèces

Les études sont réalisées chez la souris et le hamster syrien, deux espèces couramment utilisées dans la recherche biomédicale. Certaines souris utilisées ont été modifiées afin de posséder une protéine humaine appelée ACE2, qui est le point d'entrée utilisé par le virus responsable de la COVID-19 pour infecter les cellules. Ce modèle permet de mieux comprendre le déroulement de l'infection et d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. D'autres lignées de souris présentant des caractéristiques génétiques particulières sont également utilisées afin d'étudier le fonctionnement du système immunitaire et la manière dont l'organisme réagit à l'infection. La souris est un modèle de référence en recherche, car de nombreux outils permettent d'analyser précisément les réponses biologiques observées. Le hamster syrien est également largement utilisé pour l'étude de la COVID-19, car il développe une maladie présentant des similitudes avec celle observée chez l'Homme. Il constitue donc un modèle pertinent pour évaluer l'efficacité de futurs traitements antiviraux avant leur utilisation dans des essais cliniques. La maturité du système immunitaire diffère selon l’âge et peut influencer le déroulement de l’infection. Pour les études d’infection par le SARS-CoV-2 réalisées chez le hamster et la souris transgénique K18-hACE2, des animaux adultes seront privilégiés, afin de disposer d’un système immunitaire mature et d’un modèle d’infection reproductible et représentatif. L’âge pourra toutefois être adapté en fonction du modèle utilisé, des données bibliographiques disponibles et des objectifs scientifiques de l’étude.

Quarante heures en cage individuelle sans enrichissement, répétées trois fois, et jusqu'à 52 semaines de régime hypercalorique : 1 400 souris et 1 500 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin. Les souris femelles reçoivent chaque jour un dérivé de la testostérone qui supprime leur cycle, les hamsters femelles sont privées de leurs ovaires par chirurgie, et l'ensemble subit frottis vaginaux quotidiens pendant quatorze jours, prises de sang après jeûne, tests de tolérance au glucose, épilation sous anesthésie et échocardiographie. Le porteur écrit qu'aucun effet douloureux n'est attendu de ces mesures. L'objectif est de construire des modèles de syndrome des ovaires polykystiques associé à l'obésité pour y tester des composés, aucun modèle in vitro ou ex vivo de présélection n'existant selon lui.

Objectifs

Le syndrome d’ovaires polykystiques (SOPK) touche 6 à 13% des femmes en âge de procréer. Elle se traduit par un désordre hormonal menant à l’anovulation et à l’infertilité. Outre le fait que le syndrome impacte la vie sexuelle des femmes atteintes, il peut induire un désordre métabolique et un risque cardiovasculaire important : ces femmes sont plus susceptibles de développer un surpoids/une obésité, de l’hypertension artérielle, de l’hyperlipidémie, un diabète de type 2. Aujourd’hui les traitements anti-obésité et anti-diabète ne sont pas compatibles avec le souhait de procréation et d’enfanter et il est donc nécessaire de trouver une stratégie thérapeutique efficace pour traiter les atteintes métaboliques de ses femmes sans pour autant les empêcher de procréer. Pour ce faire, il faut donc développer des modèles précliniques atteints de syndrome d’ovaires polykystiques et d’obésité permettant de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques adaptées à cette population de patientes.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles SOPK associé à l’obésité mimant ce qui est observé chez les femmes atteintes. Ils permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques associée à la SOPK et ainsi de tester et valider de nouvelles thérapies.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en sucre seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 52 semaines pour les hamsters). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles (1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié). 3 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeûn 6h maximum avant le prélèvement. Des frottis vaginaux seront réalisés à plusieurs reprises au cours du projet (quotidiennement pendant 14 jours et jusqu’à 4 fois durant le projet, sur animal vigile, quelques secondes). Des tests de tolérance au glucose et à l’insuline pourront être effectués la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à un taux normal de sucre dans le sang. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Pour mesurer la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. Pour mesurer la force musculaire, nous testerons l’agrippement sur grille (2 minutes en fin de période de traitement). Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

-Le traitement quotidien avec un dérivé de la testostérone induit l’absence de cycle menstruel chez la souris femelle. -L’ovariectomie (retrait des ovaires) induit l’absence de cycle œstral chez le hamster femelle. -Obésité induite par l’ingestion d’un régime gras : Le maintien de l’animal sous régime gras favorise sa prise de poids et limite ses capacités de mouvements. -Les mesures réalisées et les traitements : aucun effet douloureux n’est attendu après ces mesures cependant, il peut arriver qu’un animal supporte mal l’anesthésie ou soit stressé par certains gestes techniques. -Les mesures de dépenses énergétiques nécessitent un isolement pendant 40 heures (16 heures d’acclimatation puis 24 heures de mesure). Cela peut induire un stress.

Devenir

Nous devons collecter les organes cibles (foie, système génital, tissus adipeux, muscles, cœur, tibia a minima) donc tous les animaux seront mis à mort en fin de projet.

Remplacement

Le dérèglement associé à la SOPK et l’obésité est un dérèglement multi organique, qui se passe de façon séquentielle dans un ordre bien précis lors du développement de la maladie. Pour trouver un traitement efficace ciblant ces deux comorbidités, l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire pour mimer à la fois l'atteinte multi-organique et l'évolution de la pathologie au cours du temps. Il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo de préscreening. La SOPK est une maladie combinant dérégulation du cycle hormonal et dérégulation métabolique. Ces dérégulations ciblent de multiples organes de l’appareil reproducteur et du système métaboliques (foie, tissu adipeux, muscle, pancréas, …). Aujourd’hui il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo mimant l’ensemble de ces dérégulations.

Réduction

Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie, de ses comorbidités ou sa résolution, le cas échéant, seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude.

Raffinement

Lors de la mise sous régime et lors du traitement pharmacologique, l’état physique des animaux est monitoré et scoré 1 fois par jour tous les jours de l’étude. Jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des animaux peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage, entraineront un examen clinique poussé par la structure du bien-être animal (SBEA). Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre les points limites, ce dernier serait mis à mort. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution de réhydratation est envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être sera placé en armoire chauffante. Parce qu’elle est stressante et peut induire une perte de poids, la procédure impliquant l’utilisation de cage individuelle (dépense énergétique) se fait la veille de la mise à mort. Pour limiter le stress, les cages étant transparentes et les unes à côté des autres, les animaux peuvent voir leur congénère à proximité. Enfin, en cas d'apparition de plaies en cours d’étude, des soins seront réalisés par la SBEA avec du cicalfate crème et du cicalfate lotion 2/jour jusqu'à l'apparition des croutes. L'utilisation des antibiotiques type acide fusidique sera validé avec le vétérinaire désigné.

Choix des espèces

La souris est un modèle bien connu pour l'étude du diabète car suffisamment caractérisé et publié. Le hamster est un modèle bien connu pour avoir un métabolisme des lipides (cholestérol et triglycérides) et des lipoprotéines, comparable à l’homme. En outre, nous avons caractérisé et publié plusieurs modèles nutritionnels de hamster, y compris celui utilisé dans le présent projet, en utilisant des mâles. En conséquence la connaissance acquise sur ces espèces permet de limiter le nombre d'animaux utilisé. Les souris sont utilisées à partir de 4 semaines d’âge et les hamsters sont utilisés à partir de 13 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine où la SOPK se met en place au moment de la puberté.

Le projet vise à produire du sérum et des tissus de référence à partir de hamsters immunisés. 112 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chaque animal reçoit trois immunisations puis une ponction de sang directement dans le cœur sous anesthésie profonde. Le porteur justifie l'espèce par sa bonne réponse immunitaire et présente les cultures cellulaires comme une piste future de réduction, la mise à mort servant à collecter sang et organes.

Objectifs

De plus en plus d’études montrent que des virus circulent ou apparaissent chez les chauves-souris européennes, dont certains sont particulièrement préoccupants en raison de leur capacité connue à se transmettre d'une espèce à l'autre et à provoquer des maladies graves chez l'Homme. Les méthodes de détection disponibles, développées pour des virus humains (ex. le virus de la rage), sont rarement validées pour les virus trouvés chez les espèces de la faune sauvage tel que les chauves-souris ou les musaraignes, ou ne sont pas adaptées aux échantillons collectés sur le terrain. Pour cela, il apparait nécessaire de développer de nouveaux outils de détection des virus circulant dans la faune sauvage permettant ainsi d’appréhender plus rapidement le risque pour l’Homme. De plus, l'absence de matériaux de référence ou de valeurs seuils communes complique l'interprétation des résultats et leur comparaison entre les groupes de recherche. Le modèle hamster est un modèle sensible à certains virus et peut facilement être utilisé pour produire des matériaux de référence comme du sérum et des tissus. Ces matériaux de référence issus de sérums/organes d’animaux immunisés ou non-immunisés permettront de développer un panel d’outils de détection de ces virus. La collecte des organes, permettra de développer de nouvelles méthodes de recherche d’anticorps intratissulaires pour chaque virus quand l’obtention de sérum ne sera pas possible. Ils permettront également de mettre au point des cultures de cellules en 3 dimensions mimant les caractéristiques et fonctionnalités des organes en vue de constituer une banque biologique limitant ainsi l’utilisation d’animaux par la suite. Ce projet ne nécessite pas d’analyse statistique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer et valider des outils de détection sérologiques adaptés à chaque virus et aux investigations chez les chauves-souris et musaraignes, réservoirs de ces virus (microprélèvements, organes/tissus d’intérêt…). La collecte des différents tissus permettra de rechercher les marqueurs d’une infection passée (anticorps) pour chaque virus et dans différents organes lorsque l’obtention de sérum ne sera pas possible dans les conditions du terrain. Le travail innovant sur les cultures de cellules en 3 dimensions permettra l’étude des mécanismes d’infection d’un agent pathogène sur une espèce sensible, limitant ainsi l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques. Dans un second temps, ce travail pourra être étendu aux chauves-souris afin de tester la réceptivité/sensibilité de ces espèces vis-à-vis de nouveaux virus et de caractériser les relations hôtes-pathogènes. Dans cette optique, et sur le long terme, cela permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés. Ces modèles pourront ensuite être utilisés dans d’autres études ou pour tester d’autres agents pathogènes.

Procédures

Les hamsters seront immunisés trois fois par voie intra-péritonéale ou par voie sous-cutanée (animaux anesthésiés- durée =10 secondes environ). Une prise de sang intracardiaque sous anesthésie profonde (+ analgésie) est effectuée sur tous les hamsters (durée 3 minutes)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont celles liées au stress de la contention de l'animal, et à l'anesthésie gazeuse et celles lisées à la douleur liées aux injections par voie intra-péritonéale ou sous-cutanée (légères de courtes durées mais répétées).

Devenir

Mise à mort pour collecte de sang et tissus

Remplacement

Le modèle hamster nous permettra de collecter des échantillons pour développer des outils sérologiques et cellulaires adaptés à leur détection ou à leur étude dans d’autres espèces animales. De plus, l’étude in vitro des mécanismes de franchissement de la barrière d’espèce de ces virus dans la faune sauvage nécessite la mise en place de cultures de cellules en 3 dimensions. Seuls des organes rapidement prélevés sur l’animal permettront la mise au point de ce type de modèle in vitro (poumon, cerveau, foie, rate…). Il n’y a donc pas d’alternative non animale disponible à ce jour dans ce domaine.

Réduction

Le nombre de hamsters a été confirmé par les premiers résultats obtenus d'un précedent projet pour pouvoir mener à bien le développement et la validation des différentes techniques qui permettront une meilleure compréhension de la réponse immunitaire induite suite à l’immunisation avec chaque espèce virale. Aucune analyse statistique n’est réalisée. La collecte des organes sera effectuée sur l’ensemble de ces hamsters afin de disposer de matériel qui pourra être utilisé pour la mise au point de méthodes de détection sérologiques sur des matrices alternatives au sérum mais également pour le développement de cultures de cellules en 3 dimensions, qui à moyen terme, permettra des études in vitro, réduisant ainsi l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques. Suite à l'obtention de premiers résultats, nous avons modifié le protocole d’immunisation des animaux afin d’avoir une meilleure réponse immunitaire sans qu’il soit nécessaire d’augmenter le nombre d’animaux par espèce virale.

Raffinement

Les hamsters seront hébergés en cage de 2 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Aucun signe clinique n'est attendu dans la mesure où les animaux seront immunisés par des suspensions non pathogènes ou faiblement réplicatives (virus inactivés, faiblement réplicatifs ou protéine virale vectorisée ou protéine adjuvée).

Choix des espèces

Plusieurs études scientifiques menées sur les lyssavirus et sur des protéines virales vectorisées ou adjuvées d’intérêt ont montré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une bonne réponse immunitaire humorale et permettait l’obtention de sérums spécifiques. Le hamster est donc un très bon modèle pour réaliser ces tests d’immunisation. D’après la littérature des hamsters âgés entre 7 et 10 semaines le jour de l’immunisation sont connus pour avoir une bonne réponse immunitaire humorale. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 7 semaines à réception.

Les animaux qui perdent plus de 20 % de leur poids en trois jours, avec prostration et dos courbé, sont mis à mort. 4 750 souris, rats et hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever foie, sang et tissus. Ils reçoivent des régimes gras et sucrés, parfois additionnés d'éthanol, pendant jusqu'à 60 semaines, avec un ou deux gavages par jour, des tests de tolérance au glucose, des séjours de 40 heures en cage individuelle sans enrichissement et des courses de 20 minutes sur tapis roulant. Le porteur retient le hamster parce qu'il consomme spontanément l'alcool, et rattache ce choix à la hausse de la consommation humaine depuis les confinements liés au COVID-19.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. En outre, ces modèles animaux ne tiennent pas compte du fait que les patients atteints de NASH consomment également de l'alcool. Il a été démontré que la consommation d'alcool favorise la progression de la NASH vers des formes plus sévères. De plus, cette consommation d'alcool a considérablement augmenté dans la population générale depuis la pandémie de COVID-19, à cause des périodes de confinements. Par conséquent, il est important d'inclure la contribution de l'alcool dans les complications hépatiques liées à l'obésité et la NASH afin de mieux modéliser le contexte humain. Si les modèles d'alcool chez le rat ou la souris ne sont pas très pertinents car ces deux espèces ne sont pas naturellement attirées par l’alcool, le hamster est un modèle intéressant car il consomme spontanément et métabolise efficacement l'éthanol. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés, a lieu dans la poche pré-gastrique. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en éthanol et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 ou 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles (1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié). 3 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Des tests de tolérance au glucose et à l’insuline pourront être effectués la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Pour mesurer la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. POUR MESURER LA FORCE MUSCULAIRE, NOUS TESTERONS L'AGRIPPEMENT SUR GRILLE (2 MINUTES DE FACON HEBDOMADAIRE) ET LA DUREE DE COURSE SUR TAPIS ROULANT EN MESURANT LES ECHANGES GAZEUX (20 MINUTES TOUS LES 15 JOURS). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale, nous mesurerons le débit de filtration glomérulaire en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. Cela consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal ne suit pas la courbe de poids attendue, une recherche approfondie d’éventuels symptômes sera faite. Les points limites de ce projet seront les suivants : absence de mouvement, piloérection et dos courbé. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas dans les 48 heures, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront. Si un animal atteint l'un des points limites, il sera euthanasié immédiatement. Pendant la phase de traitement, si la perte de poids est supérieure à 20% en l'espace de 3 jours et associée à d'autres signes tels que la prostration, le dos courbé et l'absence de toilettage, l'animal doit être euthanasié ou la dose et la fréquence de traitement adaptées.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques. Les hamsters présentent un métabolisme du cholestérol et des acides biliaires semblable à celui des humains. Les rats et les hamsters peuvent aider à étudier les effets de médicaments potentiels pour les complications cardiovasculaires (dysfonctionnement diastolique) et rénales. Chez les hamsters, la combinaison d'un régime riche en graisses, en cholestérol et en fructose et de la consommation d'alcool peut imiter le mode de vie de certains patients atteints de NASH, notamment pendant et après le confinement lié à la pandémie COVID-19. Si le modèle associé à la consommation d'alcool chez le rat ou la souris n'est pas très pertinent, le hamster est un modèle intéressant car il consomme et métabolise l'éthanol très facilement. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés a lieu dans la poche prégastrique. Les animaux sont utilisés à partir de 4 ou 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.