Les vésicules dérivées de la membrane externe comme cibles thérapeutiques innovantes dans l’Hépatite Alcoolique Aigüe sévère (HepatAlc-OMV)

En dépit d’une diminution de la consommation d’alcool en France ces dernières décennies, cette substance demeure un problème de santé publique majeur en raison de ses propriétés toxiques, cancérigènes et addictives. Une proportion importante de la mortalité liée à l’alcool provient du développement de la Maladie du Foie liée à l’Alcool, qui débute avec la maladie du foie gras, réversible, et qui s’achève avec les formes chroniques de la cirrhose et du cancer du foie. Certains patients atteints peuvent présenter une inflammation, dont la forme sévère peut causer une hépatite, une maladie du foie caractérisée par la survenue brutale d’une jaunisse. La forme sévère de cette hépatite (hépatite alcoolique aigüe sévère) est prise en charge par l’administration d’anti-inflammatoires. Toutefois, ce traitement est inefficace chez 30 % des patients. De plus, il n’existe actuellement aucun autre traitement approuvé pour les patients avec une hépatite alcoolique aigüe sévère, même si d’autres pistes sont explorées, notamment en ciblant le microbiote intestinal. Dans le cadre d’un projet conduit ces dernières années, le microbiote intestinal de patients avec une hépatite alcoolique aigüe sévère a été caractérisé. Un important déséquilibre intestinal a pu être observé, avec une augmentation de certaines bactéries connues pour leur production de petites particules appelées vésicules. Or, ces vésicules sont de plus en plus reconnues comme contribuant à diverses maladies du foie, mais il n’existe actuellement aucune étude les associant à l’hépatite alcoolique aigüe sévère. L’objectif de ce projet est ainsi d’utiliser un modèle de souris afin de vérifier le rôle de ces vésicules produites par des bactéries fécales et l’inflammation du foie. A plus long terme, ces travaux pourraient aider à trouver de nouveaux traitements pour cette maladie grave.

Ce projet est pilote : il s’agit de vérifier une hypothèse de recherche qui n’a jusqu’à présent pas été explorée dans la littérature, c’est-à-dire que les vésicules jouent un rôle clef dans l’hépatite alcoolique aigüe sévère. Si cette hypothèse est vérifiée, des travaux supplémentaires sur modèles cellulaires, animaux et chez l’Homme pourraient être justifiés pour mieux comprendre les mécanismes impliqués, et à plus long terme proposer de nouveaux traitements.

Un total de 3 interventions seront employées dans ce projet. La première intervention consiste en l’introduction de bactéries dans le microbiote intestinal pour jusqu’à 36 mères gestantes. Pour cela, deux gavages oraux seront administrés en quelques secondes sur animal vigile, avec un espacement de quatre jours. Cette intervention sera complétée par l’ajout d’antibiotiques dans l’eau de boisson pendant dix jours pour faciliter l’installation des bactéries. La première intervention consiste en l’exposition de jusqu’à 324 petits de ces mères à de l’alcool. L’alcool sera administré dans l’eau de boisson d’une part, et d’autre part par un gavage oral (quelques secondes) par semaine pendant quatre semaines, sur animal vigile. La troisième intervention consiste en l’introduction d’un marqueur fluorescent de santé intestinale chez jusqu’à 324 souriceaux. Ce marqueur sera administré par gavage oral sur animal vigile une fois le protocole d’alcoolisation achevé. Plusieurs heures après ce gavage, les animaux seront anesthésiés par inhalation de gaz, du sang sera prélevé pendant environ 30 secondes, puis les animaux seront euthanasiés.

Dans la première partie de l’étude, les femelles gestantes seront hébergées individuellement pour contrôler la date de mise bas et prévenir les comportements d’agressivité ou de cannibalisme post-partum. Cet hébergement individuel peut induire un stress modéré durant la période de stabulation. À leur arrivée, les femelles recevront une des antibiotiques, susceptibles d’entraîner un léger inconfort transitoire, parfois accompagné de rares épisodes diarrhéiques. Elles subiront également deux gavages, espacés de quatre jours, occasionnant une gêne légère et brève liée à la contention et à l’introduction de la sonde. Le gavage permettra d’administrer l’une des trois souches fécales non-pathogènes. Ces précautions limiteront l’impact sur la fonction intestinale, estimé léger pendant la stabulation, avec de possibles épisodes diarrhéiques rares, également anticipés chez les souriceaux. Dans la seconde partie de l’étude, les souriceaux pourront présenter une altération intestinale légère et transitoire durant la stabulation. Le prélèvement de fèces par induction représentera également une nuisance brève et légère. L’exposition des souriceaux à l’alcool dans l’eau de boisson pourrait provoquer des effets nuls à légers sur la durée de l’étude. Quatre gavages oraux, espacés d’une semaine, seront réalisés. Ces manipulations entraîneront une gêne légère et passagère, sans douleur persistante. L’alcool administré pourrait toutefois induire un état transitoire de somnolence ou de prostration, associé à une diminution de la prise alimentaire. Combinée à la consommation d’alcool, cette exposition peut entraîner des atteintes intestinales et hépatiques ainsi qu’un stress physiologique modéré. D’après nos travaux antérieurs, la nuisance globale après quatre semaines d’exposition à l’éthanol est considérée comme modérée. A la fin de cette seconde partie, une courte période d’isolement et de jeûne (≈4 h) pourra générer un stress léger et transitoire. Elle sera suivie d’un gavage oral d’un marqueur de santé intestinale, provoquant une gêne brève liée à la contention.

La mise à mort des animaux est nécessaire dans notre étude afin de pouvoir obtenir des échantillons biologiques indispensables. A l’issue de la première partie de l’étude, qui s’achève avec le sevrage et le sexage des souriceaux, les mères gestantes seront mises à mort afin de récupérer le foie et les intestins. Les souriceaux sevrés seront ensuite utilisés dans la seconde partie de l’étude, et exposés à de l’alcool. Au terme de cette exposition pendant quatre semaines, les animaux seront mis à mort afin de récupérer le foie et les intestins.

Des souris femelles âgées de 10 semaines et à 10 jours de gestation seront utilisées. Il nous est impossible d’utiliser des femelles avec gestation confirmée du fait du besoin de coloniser la mère avant la naissance des souriceaux. Selon notre expérience avec ces souris gestantes, nous avons besoin d’une semaine pour l’antibiothérapie et la colonisation du microbiote intestinal. Le choix de mères gestantes, et non de souriceaux, est pertinent afin de gaver un nombre réduit d’animaux. De plus, nous nous attendons à ce que la déstabilisation du microbiote intestinal à travers l’antibiothérapie combinée aux gavages bactériens aboutisse à une atteinte hépatique augmentée. Les souriceaux seront en outre inclus dans la procédure d’alcoolisation seulement une fois sevrés et avec un poids suffisamment élevé, de 20 g pour les mâles et 19 g pour les femelles, au maximum 5 semaines post-naissance selon les courbes de croissance du fournisseur. Des souris aussi jeunes permettent de reproduire le comportement de binge drinking (alcoolisation ponctuelle importante) qui débute chez l’Homme au cours de l’adolescence. Nous nous attendons aussi à une atteinte hépatique plus marquée à un jeune âge suite à la colonisation dès la naissance par la bactérie, et qui serait potentialisée par les effets de l’alcool.