Injection de virus adéno-associés dans des modèles murins de maladies neuromusculaires

Nous développons de nouvelles approches thérapeutiques pour des maladies neuromusculaires, c’est-à-dire des pathologies qui affectent le fonctionnement des muscles et peuvent également impliquer les nerfs qui les contrôlent. Ces maladies entraînent une faiblesse musculaire progressive, pouvant altérer la mobilité, la posture et, dans certains cas, certaines fonctions vitales. Ces atteintes sont généralement liées à des anomalies au sein des cellules musculaires, notamment au niveau de structures essentielles à leur stabilité et à leur bon fonctionnement. Lorsque ces structures sont altérées, les fibres musculaires deviennent plus fragiles et se dégradent progressivement, conduisant à une perte de masse et de force musculaire. Certaines de ces maladies peuvent également toucher d’autres organes, ce qui en fait des pathologies complexes et hétérogènes. À ce jour, les options thérapeutiques disponibles restent limitées et ne permettent pas de traiter efficacement la cause de ces maladies. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies capables d’agir directement sur les mécanismes responsables des atteintes musculaires. Dans ce contexte, nous évaluons des approches innovantes visant à restaurer ou améliorer le fonctionnement des cellules musculaires. Ces stratégies sont d’abord étudiées sur des cellules humaines issues de patients, puis dans des modèles animaux, afin d’analyser leur efficacité et leur tolérance dans un environnement biologique plus complexe. Ces étapes sont indispensables pour mieux comprendre les effets du traitement et pour envisager, à terme, une application chez l’humain.

Les travaux proposés ont pour objectif d’évaluer et d’optimiser différentes approches thérapeutiques innovantes pour des maladies neuromusculaires d’origine génétique. Ces études reposent sur l’utilisation de modèles animaux présentant des altérations comparables à celles observées chez les patients, permettant d’étudier ces maladies dans un contexte biologique global et pertinent. À court terme, ce projet vise à analyser l’efficacité, la tolérance et la distribution dans l’organisme des approches développées. Il permettra notamment d’identifier les conditions d’administration les plus adaptées, telles que la dose ou la voie d’administration, afin d’obtenir une action efficace au niveau des muscles. Les effets du traitement seront évalués à l’aide de différents paramètres complémentaires, incluant la fonction musculaire, l’analyse des tissus et l’étude de marqueurs biologiques, afin de déterminer une éventuelle amélioration de l’état musculaire. Les bénéfices scientifiques immédiats résident dans l’acquisition de données essentielles sur l’efficacité et la sécurité de ces approches, constituant une étape indispensable avant toute application chez l’humain. À plus long terme, ces travaux contribueront à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans ces maladies et à orienter le développement de stratégies thérapeutiques plus performantes et mieux adaptées. Ainsi, ce programme présente un intérêt scientifique important en permettant de faire progresser de nouvelles approches thérapeutiques, avec des retombées potentielles significatives sur le plan médical et sociétal, notamment pour des maladies actuellement sans traitement curatif efficace.

Administrations de vecteurs rAAV : Chaque animal recevra une seule administration de vecteur ou de solution contrôle, par l’une des voies suivantes selon le groupe expérimental et l’âge : injection intraveineuse (veine faciale chez le nouveau-né P0–P1 ou veine caudale chez l’adulte), injection intramusculaire (muscle tibial antérieur), injection intracérébroventriculaire, ou intrathécale. La durée de chaque injection est comprise entre 2 et 10 minutes. Les injections chez l’adulte sont réalisées avec ou sans anesthésie selon la voie, et les injections néonatales sont effectuées sous cryo-anesthésie. Biopsie auriculaire pour le génotypage : Une biopsie auriculaire unique est réalisée chez les animaux issus de l’élevage afin de permettre leur génotypage. Cette procédure, réalisée sur animal vigile sous contention douce, dure moins de 2 minutes par animal. Tests fonctionnels comportementaux et moteurs : Les animaux subiront une session unique de tests fonctionnels comprenant le rotarod, le test de suspension sur fil (hang wire) et le test de force de préhension (grip strength). La durée totale de cette session est d’environ 30 à 45 minutes par animal, incluant les périodes de repos entre essais. Ces tests sont réalisés sur animaux vigiles. Chirurgie terminale pour l’évaluation de la fonction musculaire : En fin de protocole, les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale terminale sous anesthésie générale (kétamine/xylazine), visant à la mesure ex vivo de la force isométrique du muscle tibial antérieur. Cette procédure dure environ 30 à 60 minutes par animal. Les animaux sont ensuite euthanasiés sans réveil, conformément à la réglementation. Les animaux sont maintenus en expérimentation pour une durée maximale de 6 mois après injection, tandis que les animaux reproducteurs sont conservés jusqu’à 12 mois.

A) Nuisances liées au phénotype Modèles hDMDmdx, hDMDmdxDel44 et hDMDmdxDelCH2 Ces lignées expriment soit la version sauvage (hDMD), soit des versions mutées du gène DMD humain (hDMDmdxDel44 et hDMDmdxDelCH2). Elles présentent un phénotype musculaire comparable à celui observé dans d’autres modèles de dystrophie de Duchenne, mais d’intensité légère à modérée. Ces animaux conservent une très bonne santé générale et une espérance de vie normale. La surexpression de la dystrophine humaine ne provoque pas de pathologie connue. Une dégénérescence musculaire progressive mais lente peut apparaître à partir de l’âge de 3 à 12 semaines, sans impact significatif sur la locomotion ni sur la survie. Modèles FVB, HSAlr et DMSXL Ces lignées expriment soit la version sauvage (FVB), soit des versions mutées du gène DMPK (HSAlr et DMSXL). Elles présentent un phénotype musculaire comparable à celui observé dans d’autres modèles de DM1, mais d’intensité légère à modérée. Pour la HSAlr, le gène muté n’étant exprimé que dans les cellules musculaires, ces souris ne développent qu’un phénotype musculaire, principalement des myotonies de certains muscles mais qui n’affectent pas leurs espérances ou leurs qualités de vie. Pour les DMSXL, ces souris ont principalement un très léger phénotype neuronale qui également ne changent pas leur durée de vie ou leur bien-être. Effets liés aux injections d’AAV (U7-ACCA, U7-del44, U7-delCH2, U7-DM1) Les vecteurs AAV9 ont été utilisé plusieurs fois dans des essais cliniques aux doses proposées dans ce projet. Ils ne sont pas attendus comme toxiques même à long terme sur la base des données générées au préalable (études menées en utilisant 1.e15vg total dans des souris P0-P1 jusqu’a 18 mois). . Chez certaines lignées (notamment hDMDmdxDel44 et hDMDmdxDelCH2), une dégénérescence musculaire très lente et modérée peut être observée, sans impact significatif sur la survie. Aucun effet systémique majeur n’est anticipé. Ces vecteurs ont par le passé était injecté pour générer des données préliminaires et aucun effets négatifs n’a été observé. Toutefois, une vigilance particulière sera maintenue durant la confirmation des données préliminaires préalablement obtenues surtout sur les études à long terme.

Les souriceaux issus des portées seront génotypés par biopsie caudale afin d’identifier les animaux présentant le génotype et le sexe d’intérêt pour les études expérimentales. Les animaux ne correspondant pas aux critères requis (génotype ou sexe non adaptés aux objectifs du projet) seront euthanasiés après génotypage. Les animaux sélectionnés seront inclus dans les études expérimentales et suivis jusqu’à 6 mois, selon les différents protocoles d’administration et de suivi prévus dans le projet. À l’issue des expérimentations, l’ensemble des animaux inclus sera euthanasié afin de permettre la réalisation des analyses post-mortem (analyses histologiques, moléculaires et biochimiques).

Les souris ont été choisies comme espèce modèle en raison de leur proximité biologique avec l’Homme et de l’existence de modèles reproduisant les principales caractéristiques des maladies neuromusculaires étudiées. Ces modèles présentent des altérations génétiques distinctes affectant une même fonction musculaire, permettant de mimer la diversité des atteintes observées chez les patients. En effet, une même pathologie peut résulter de différentes anomalies génétiques, entraînant des degrés et des mécanismes d’atteinte variables. L’utilisation de plusieurs modèles complémentaires permet ainsi d’évaluer l’efficacité de différentes approches thérapeutiques en fonction du type d’altération présente, et d’anticiper leur pertinence pour des sous-groupes de patients présentant des profils génétiques distincts. Ces modèles reproduisent les principales conséquences de la maladie, notamment la faiblesse musculaire progressive et les altérations des tissus musculaires, ce qui en fait des outils pertinents pour des études précliniques. Les animaux sont utilisés à différents stades de développement afin de répondre aux objectifs du projet. Une administration précoce permet d’évaluer l’effet des traitements avant l’apparition des symptômes, tandis que des administrations à un stade plus avancé permettent d’analyser leur efficacité dans un contexte pathologique établi, plus proche de la situation clinique. Les animaux sont suivis puis analysés à différents temps afin d’étudier l’évolution des effets du traitement sur la fonction musculaire et la progression de la maladie. Enfin, ces approches ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives, car elles nécessitent une évaluation intégrée à l’échelle de l’organisme entier, incluant la distribution du traitement, les interactions entre tissus et les effets fonctionnels globaux.