Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 11/06/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-186645)
1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue pour prélever foie et rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un vecteur viral porteur du génome de l’hépatite B leur est injecté dans une veine, puis, selon les groupes, elles reçoivent deux fois par semaine pendant quatre semaines un produit provoquant une fibrose du foie, une injection unique déclenchant un cancer du foie, ou des anticorps détruisant une partie de leurs cellules immunitaires. Certaines subissent ces injections dès quinze jours de vie. Le porteur écrit que ces atteintes hépatiques entraînent des nuisances « inexistantes ou minimes », et affirme que le modèle murin est « indispensable » puisque aucun modèle in vitro, même un organoïde multicellulaire, ne reproduit les échanges entre le foie et le système immunitaire.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’infection par le Virus de l’hépatite B (VHB) a touché plus d’un milliard de personnes dans le monde et est responsable d’infection chronique pour 250 millions de personnes, aujourd’hui. Ces infections chroniques peuvent conduire à la cirrhose et au cancer du foie. Environ un million de personnes décèdent tous les ans de cette infection virale. Il est donc essentiel de comprendre cette maladie virale afin de développer de nouvelles approches théraputiques. Notre projet de recherche basé sur nos précédents travaux, porte sur l’impact de l’expression d’un des gènes du VHB sur la pathogenèse hépatique et notamment en modulant la réponse immunitaire. Nous souhaitons évaluer le rôle de ce gène viral et les mécansimes associés en utilisant des virus complets ou délétés sur ce gène. Le modèle murin est indispensable pour évaluer les nombreuses interactions existantes entre les cellules du foie infectées et les cellules de l’environnement hépatique dont les cellules immunologiques. Cependant, le modèle murin n’étant pas infectable par le VHB. C’est pourquoi, nous avons généré des vecteurs viraux modifiés génétiquement qui sont d’une part, capables d’infecter le foie des souris et d’autre part, d’exprimer soit le génome complet soit un génome partiel du VHB. Ces vecteurs viraux et les modèles murins nous permettront ainsi d’évaluer l’impact d’une des protéines virales sur la pathogenèse hépatique et de déterminer le rôle de la réponse immunitaire dans cette progression.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Nos données acquises nous éclairerons sur la pathogenèse hépatique et le risque de développement du cancer du foie associé à une infection par le virus de l’hépatite B (VHB). Elles pourraient conduire à de nouvelles approches thérapeutiques ciblant l’infection par le VHB et des complications hépatiques associées chez les patients infectés par le VHB.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Le transfert du génome du virus de l’hépatite B (VHB) sera réalisé après anesthésie (par injection pendant 5-10 secondes par voie intra-péritonéale) sur l’ensemble des souris incluses. Ce transfert sera réalisé par une unique injection par voie intra-veineuse (injection de 5-10 secondes). Parmi ces animaux, un groupe de souris vigiles sera soumis à une injection intra-péritonéale (5 à 10 secondes) deux fois par semaine pendant 4 semaines d’un réactif générant une fibrose hépatique. Un autre groupe également vigile sera soumis à une injection unique intra-péritonéale (5 à 10 secondes) d’un réactif générant un cancer du foie. Un troisième groupe de souris vigile aura été pré-immunisé par une injection intra-veineuse unique (de 5 à 10 secondes). Un dernier groupe de souris vigiles subira une déplétion de sous-population de cellules immunitaires par injections d’anticorps par voie intra-péritonéale (5 à 10 secondes) deux fois par semaine pendant 1 à 2 semaines. Au cours de cette étude, nous serons également amenés à prélever du sang (1 à 5 minutes). Le nombre de prélèvement de sang varie de 1 à 2 selon le temps d’expérimentation (de 7 semaines à 6 mois) de chaque procédure. Les animaux seront anesthésiés avant ce prélèvement de sang. A la fin de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’anesthésie des animaux pourrait engendrer un stress thermique. L’induction des pathologies hépatiques sont bien connues et ont montré des nuisances légères ou modérées de l’atteinte hépatique. La manipulation des souris, en particulier les injections, peuvent induire un stress et pourraient conduire à une douleur légère de courte durée au site d’injection au moment du geste. L’administration de différentes drogues pourrait induire une inflammation, une fibrose et un cancer hépatique. Néanmoins, compte tenu des court temps expérimentaux effectués et/ou du faible impact de certaines des drogues utilisées, les nuisances cliniques seront inexistantes ou minimes. Ils pourraient éventuellement générer quelques troubles digestifs transitoires et rapidement réversibles. Les prélèvements sanguins pourraient être source de stress au moment de l’anesthésie et conduire à des saignements/hématomes.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Pour l’ensemble des animaux inclus dans ce projet, l’euthanasie est requise afin de prélever des échantillons biologiques (foie, rate,…) pour permettre de réaliser de nombreuses analyses expérimentales post-mortem (histologie, quantification de paramètres cliniques, virologiques et immunologiques…) et, ainsi, répondre à la question scientifique posée. Cet acte nécessaire sera réalisé par du personnel compétent et selon les bonnes pratiques d’euthanasie des animaux par une méthode réglementaire.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
De précédents résultats effectués sur des hépatocytes primaires humains (PHH) in vitro suggèrent un rôle du VHB dans le recrutement et l’activation des différents intervenants du système immunitaire intra-hépatique. La mise en place d’un modèle in vitro récapitulant la réponse immunitaire innée et acquise, le recrutement des cellules de la moelle osseuse, ainsi que les interactions entre le foie et le système digestif (interactions essentielles à la pathogenèse hépatique) n’est pas réalisable à ce jour in vitro, même dans un modèle d’organoïdes multicellulaires. C’est pourquoi il est nécessaire de réaliser ces travaux dans un modèle in vivo afin étudier l’impact du VHB sur le recrutement et l’activation des différents acteurs du système immunitaire, par interaction directe et/ou indirecte avec les hépatocytes infectés.
2. Réduction
La réduction de l’échantillonnage d’animaux est liée à l’approche statistique qui nécessite 30 souris par condition afin d’évaluer une différence significative entre les groupes par des tests statistiques. Le nombre total d’animaux sera de 1050 souris. Ce nombre a été évalué selon un calcul de puissance adapté en prenant la somme de toutes les expérimentations prévues dans ce projet de recherche. A l’issue de ces expérimentations, de nombreux tissus seront récupérés sur chaque souris (sang, foie, rate…) afin de permettre de réaliser un grand nombre d’analyses sur une même souris et ainsi de répondre aux questions scientifiques soulevées.
3. Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation pour l’espèce concernée et un suivi quotidien sera assuré par un personnel formé et compétent. De plus, les cages seront raffinées par la présence de lanières Kraft et des abris en carton et installées sur des portoirs ventilés. Aucune souris ne sera isolée dans une cage. Les animaux seront manipulés uniquement par du personnel qualifié et sensibilité au bien-être animal. Les procédures nécessitant l’endormissement de l’animal sont raffinées avec un protocole d’anesthésie et d’analgésie approprié, la gestion du risque d’hypothermie par l’utilisation d’une lampe chauffante ou d’un tapis chauffant durant les manipulations des animaux sous anesthésie, et l’ajout d’un gel de protection oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire si besoin. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Si les points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour éviter toute souffrance inutile.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle murin syngénique (de génome identique) est un modèle parfaitement calibré à l’expérimentation animale. De plus, il existe une homologie relative avec l’Homme dans le fonctionement du système immunitaire et les interactions foie/autres tissus, que nous souhaitons étudier ici. Les animaux nés dans notre établissement seront utilisés à deux stades de développement, soit à 15 jours de vie pour l’initiation du cancer du foie, soit au moment ou quelques semaines après le sevrage pour les autres types d’expérimentation. Les souris adultes provenant de notre fournisseur seront de même fond génétique que les souris provenant de notre établissement. Ces souris seront acclimatées à notre environnement expérimental au moins une semaine avant inclusion dans une de nos procédures. Ces souris seront identifiées à l’inclusion dans une de nos procédures.